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Article de méthode

Cellule étiquetage et le ciblage des nanoparticules d'oxyde de fer Superparamagnetic

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DOI :

10.3791/53099

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19 octobre 2015

 ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Cardiovascular Diseases, Mayo Clinic, 2Division of Engineering, Mayo Clinic, 3School of Medicine, Pharmacy and Health, Durham University, 4Regional Center for Applied Molecular Oncology, Masaryk Memorial Cancer Institute, 5Mayo Clinic College of Medicine, Mayo Clinic

Dans cet article

Résumé

L’administration ciblée de cellules est utile dans diverses applications biomédicales. L’objectif de ce protocole est d’utiliser des nanoparticules d’oxyde de fer superparamagnétiques (SPION) pour marquer les cellules et ainsi permettre des approches de ciblage cellulaire magnétique pour un haut degré de contrôle de l’administration et de la localisation des cellules.

Résumé

L'administration ciblée de cellules et des agents thérapeutiques bénéficierait une large gamme d'applications biomédicales, en concentrant l'effet thérapeutique au niveau du site cible tout en minimisant les effets délétères sur les sites hors cibles. Ciblage cellulaire magnétique est une technique de livraison efficace, sûre et simple. Des nanoparticules d'oxyde de fer superparamagnétiques de (spion) sont biodégradables, biocompatibles, et peuvent être endocytose dans des cellules pour les rendre sensibles aux champs magnétiques. Le procédé de synthèse consiste à créer magnétite (Fe 3 O 4) suivie d'émulsification nanoparticules à grande vitesse pour former un poly (acide lactique-co-glycolique) (PLGA) de revêtement. Les SPIONs PLGA-magnétite sont environ 120 nm de diamètre dont le diamètre de noyau de magnétite d'environ 10 nm. Lorsqu'il est placé dans un milieu de culture, sont naturellement SPIONs endocytose par les cellules et stockées sous forme de petits agrégats à l'intérieur des endosomes cytoplasmiques. Ces particules confèrent masse magnétique suffisant pour les cellulespour permettre le ciblage à l'intérieur des champs magnétiques. Nombreux tri cellulaire et applications ciblant sont activés en rendant divers types sensibles aux champs magnétiques de cellules. SPIONs ont une variété d'autres applications biomédicales, y compris aussi bien l'utilisation comme agent de contraste pour l'imagerie médicale, l'administration de médicaments ou un gène ciblé, des analyses de diagnostic, de génération et hyperthermie locale pour le traitement des tumeurs ou la soudure de tissu.

Introduction

L’administration et la capture ciblées de cellules à des sites spécifiques dans le corps sont souhaitables pour une variété d’applications biomédicales. L’administration de cellules souches neurales au cerveau par ultrasons focalisés guidés par IRM a été proposée comme une option de traitement possible pour les maladies neurodégénératives, les lésions cérébrales traumatiques et les accidents vasculaires cérébraux1. Les cellules souches mésenchymateuses sont étudiées pour leur capacité à administrer des médicaments anticancéreux aux tumeurs en raison de leurs propriétés tropiques tumorales naturelles2,3. Des cellules souches cardiaques ont été délivrées au cœur comme traitement possible de l’infarctus du myocarde4,5. Des stents vasculaires ont été développés avec des anticorps CD34 pour capturer les cellules progénitrices circulantes6. Bien que prometteuses, ces approches de ciblage cellulaire présentent des inconvénients, notamment un manque de spécificité cellulaire, une rétention cellulaire incohérente et une livraison de cellules hors cible.

L’objectif global de la méthode actuelle est de permettre le ciblage magnétique des cellules pour une variété d’applications de livraison et de tri des cellules. Le ciblage magnétique permet une livraison contrôlée de cellules spécifiques à un site cible spécifique avec des effets hors cible minimaux7. Les champs magnétiques peuvent être générés par des dispositifs implantés ou externes pour diriger en toute sécurité le mouvement des cellules marquées magnétiquement dans le corps8. De nombreux efforts de recherche ont porté sur le ciblage magnétique des cellules souches vers les tissus lésés tels que le cœur9-14, la rétine15, les poumons16, la peau17, la moelle épinière18,19, les os20, le foie21 et les muscles22,23 afin d’améliorer les résultats de régénération.

Le ciblage magnétique des cellules a également été largement étudié comme moyen d’endothélialiser des dispositifs cardiovasculaires implantables. Un endothélium uniforme et complet fournit une barrière entre le dispositif et les éléments sanguins circulants pour atténuer la thrombose et l’inflammation. Les cellules endothéliales peuvent être administrées au dispositif soit avant l’implantation, soit via le système vasculaire après l’implantation. Dans les deux cas, des champs magnétiques sont utilisés pour capturer les cellules à la surface de l’appareil et retenir les cellules lorsqu’elles sont soumises à la contrainte de cisaillement générée par la circulation du sang. Les endoprothèses vasculaires magnétiques24-27 et les greffes vasculaires28 ont toutes deux été fabriquées et testées à cet effet.

Le ciblage des cellules magnétiques nécessite une stratégie de marquage des cellules avec des particules porteuses magnétiques. Ces particules peuvent être liées à la surface des cellules par des anticorps ou des paires ligand/récepteur, ou elles peuvent être endocytosées dans les cellules. Les nanoparticules d’oxyde de fer superparamagnétiques (SPION) sont biodégradables, biocompatibles et facilement endocytosées par divers types de cellules29. Ces particules rendent efficacement une cellule réactive aux champs magnétiques et se dégradent naturellement avec le temps. Les SPION offrent un moyen simple et sûr de marquer magnétiquement des cellules en culture pour une variété d’applications de ciblage et de tri magnétiques. L’invention concerne un procédé de synthèse de SPION à l’aide d’un noyau de magnétite (Fe3O4) et d’une enveloppe en poly(acide lactique-co-glycolique) (PLGA). De plus, une méthode de marquage de cellules en culture avec des SPION est fournie.

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Protocole

1. Synthèse de magnétite Gel

  1. Laver toute la verrerie à l'aide d'acide chlorhydrique concentré puis de l'eau désionisée, suivi par l'alcool éthylique. Laisser sécher O / N, de préférence dans un four de séchage.
    ATTENTION! l'acide chlorhydrique est nocif - porter un équipement de protection individuelle et de travailler dans une hotte; alcool éthylique est nocif - porter un équipement de protection individuelle.
  2. Utilisez une bouteille Dreschel dégazer 500 ml de H 2 O déminéralisée par barbotage doucement gaz N 2 pendant 30 minutes.
  3. Mise en place de l'appareil de synthèse de la magnétite dans un hotte chimique.
    1. Placer un flacon ml à trois cols à fond rond de 500 au sein d'un chauffe manchon isotherme et sécuriser le col de centre à l'aide d'une pince et d'éligibilité.
    2. Installation d'un septum en caoutchouc dans l'un des cols latéraux du ballon à fond rond et d'un condenseur à reflux avec un septum en caoutchouc dans le goulot de côté restant. Fonctionner en continu de l'eau froide à travers le condenseur de reflux.
    3. Puncture ee septum en caoutchouc du flacon à fond rond avec une aiguille reliée à une conduite de gaz N 2 et à la perforation de la cloison en caoutchouc pour le réfrigérant à reflux avec une aiguille reliée à une conduite de gaz en cours d'exécution à un barboteur (c.-à-ballon avec de l'eau) pour visualiser les sorties de gaz.
    4. Installez une palette de lame dans le cou de centre du ballon rond via un adaptateur de pagaie. Fixez l'arbre de la palette de la lame à un agitateur monté sur un stand.
  4. Purger le ballon à fond rond avec du gaz N 2 et N 2 laisser gaz circulant à un taux faible, mais détectable.
  5. Retirer le condenseur à reflux de la ballon à fond rond et ajouter 1,000 g de fer (III) chlorure, 0,6125 g de fer (II) tétrahydraté, et 50 ml de dégazée H 2 O.
    ATTENTION! fer (III) et le chlorure de fer (II) tétrahydraté sont nuisibles - porter un équipement de protection individuelle.
  6. Remplacer le condenseur de reflux et agiter à 1000 tours par minute tout en chauffant à 50° C. L'agitation dans ces conditions produit 10 nm de diamètre nanoparticules de magnétite.
  7. Une fois à 50 ° C, ajouter 10 ml de solution d'hydroxyde d'ammonium à 28% en injectant à travers le septum en caoutchouc dans le ballon à fond rond tout en agitant.
    ATTENTION! hydroxyde d'ammonium est néfaste - porter un équipement de protection individuelle.
    REMARQUE: La solution d'hydroxyde d'ammonium est utilisé pour précipiter la magnétite et la solution doit virer au noir.
  8. Retirez le bouchon de caoutchouc et de N 2 conduite de gaz du ballon rond et de la chaleur à 90 ° C pour faire bouillir le gaz d'ammoniac tout en remuant.
    NOTE: Il est facultatif pour maintenir le flux de N 2 dans le ballon à fond rond en perforant la cloison de caoutchouc le condenseur de reflux, cependant, l'oxydation de la magnétite à maghémite est négligeable lors de cette étape.
  9. Une fois à 90 ° C, ajouter 1 ml d'acide oléique dans le ballon à fond rond, tout en remuant. L'acide oléique est utilisé pour revêtir la magnétite nanoparticles pour former un gel de la magnétite.
    ATTENTION! l'acide oléique est nocif - porter un équipement de protection individuelle.
  10. Remplacez le septum en caoutchouc et N 2 conduite de gaz sur le ballon à fond rond et retirez le condenseur de reflux.
  11. Éteindre le feu et remuer à 500 rpm pendant 2 heures.
  12. Retirer le flacon à fond rond à partir de l'appareil de chauffage et un manchon isotherme décanter tandis que le reste du liquide en utilisant un aimant fort maintenue contre la partie inférieure de la fiole pour retenir le gel de magnétite.
    ATTENTION! face à la forte aimant avec un soin extrême pour éviter des dommages ou des blessures.
  13. Laisser gel de magnétite sécher à l'air O / N (en option).

2. Purification de magnétite Gel

  1. Ajouter 40 ml d'hexane dans le ballon à fond rond pour dissoudre le gel de magnétite
    ATTENTION! hexane est nocif - porter un équipement de protection personnelle et de travailler dans une hotte.
  2. Utilisez une ampoule à décanter avec 40 ml d'dégazée H 2 O pour éliminer H 2 O résiduelle from la solution de magnétite.
    1. Verser lentement la solution de magnétite sur le H 2 O au sein de l'ampoule à décanter et agiter doucement le liquide à deux phases pendant 5 minutes.
    2. Égoutter et jeter la fraction aqueuse inférieure.
    3. Lentement, ajouter 40 ml de dégazée H 2 O à l'ampoule à décanter telle qu'elle installe sous la solution de magnétite et de tourbillonner et égoutter délicatement comme avant.
    4. Répétez l'opération pour laver pour une troisième fois.
  3. Transfert solution de magnétite dans un erlenmeyer, ajouter quelques spatules valeur de sulfate de sodium anhydre, et agiter pour éliminer tout restant H 2 O résiduelle de la solution de magnétite.
  4. Filtrer la solution de magnétite travers un papier filtre de 1 pm dans un entonnoir à filtre pour éliminer le sulfate de sodium résiduel et H 2 O.
    REMARQUE: l'aide du vide est recommandé.
  5. Transférer la solution de magnétite à un ballon d'évaporation de 50 ml et en utilisant un évaporateur rotatif pour évaporer l'hexane pour2 h dans les conditions suivantes: vitesse de rotation modérée, appliquée sous vide, l'évaporation ballon dans un bain d'eau à 50 °, et 24 ° C l'eau circulant dans le condenseur.
    NOTE: En option, stocker le gel de magnétite avec avant le revêtement de PLGA.

3. Revêtement de magnétite nanoparticules PLGA avec Shell

  1. Dissoudre 3,60 g de PLGA (75/25 mélange) dans 240 ml d'acétate d'éthyle pour créer un (m / v) de solution à 1,5%. ATTENTION: acétate d'éthyle est nocif - porter un équipement de protection personnelle et de travailler dans une hotte.
  2. Dissoudre 25,00 g de Pluronic F-127 dans 500 ml de dégazée H 2 O avec un agitateur magnétique pour créer un (m / v) de solution 5,0%.
    REMARQUE: Pluronic F-127 est un copolymère à blocs amphiphile non-ionique qui agit comme un agent tensioactif biocompatible. Il permet de stabiliser l'émulsion huile-dans-eau dans l'étape 3.3.2.
  3. Utiliser une microspatule, recueillir le gel de la magnétite en six 0,040 g aliquotes dans des flacons de verre pondérés. Perform le processus de revêtement et de lavage suivant pour chaque aliquote.
    REMARQUE: Les aliquotes sont nécessaires pour assurer une gestion efficace et décantation magnétique, ce qui permettra de maximiser pureté et le rendement tout en minimisant la dégradation avant lyophilisation à l'étape 4.
    1. Ajouter une fraction aliquote de 0,040 g du gel de magnétite et de 40 ml de la solution de PLGA dans un bêcher en matière plastique et de traitement par ultrasons dans un bain à ultrasons pendant 10 minutes.
    2. Ajouter 80 ml de la solution de Pluronic dans le bêcher en plastique et immédiatement émulsionner avec un mélangeur de laboratoire à la position la plus élevée pendant 7 minutes pour former le revêtement sur les nanoparticules PLGA de magnétite comme une émulsion huile-dans-eau.
    3. Immédiatement diluer la solution de SPION dans 1 litre de H 2 O déminéralisée et de traitement par ultrasons pendant 1 h dans une hotte chimique pour évaporer l'acétate d'éthyle.
    4. Placez un aimant puissant à côté de la solution de SPION et remuer doucement pour recueillir SPIONs brunâtres à l'aimant.
      NOTE: Il peut être nécessaire d'agiter par intermittence pendant plusieurs heuress avant que la solution devient blanchâtre indiquant que la plupart des SPIONs ont été recueillis.
    5. Décanter la solution aqueuse tout en conservant les SPIONs dans le bécher avec l'aimant.
    6. Laver les SPIONs trois fois comme suit.
      1. Suspendre les SPIONs dans 1 L d'H 2 O. déminéralisée
      2. Soniquer la solution de SPION pendant 20 minutes.
      3. Placez un aimant puissant à côté de la solution de SPION et remuer doucement pour recueillir SPIONs brunâtres à l'aimant. Il peut être nécessaire d'agiter par intermittence pendant plusieurs heures avant que la solution devient claire indiquant que la plupart des SPIONs ont été recueillis.
      4. Décanter la solution aqueuse tout en conservant les SPIONs dans le bécher avec l'aimant.
  4. Recueillir les SPIONs synthétisés à partir de chacune des six parties aliquotes de gel de magnétite dans un seul flacon de verre pondéré en tant que suspension aqueuse. Eventuellement décanter l'eau en excès magnétiquement au besoin.

4. Gel-Séchage de SPIONs

  1. Congeler la solution de SPION.
  2. Lyophiliser la solution de SPION O / N dans un lyophilisateur.
  3. Peser les SPIONs lyophilisés. SPIONs lyophilisées peuvent être conservés à -20 ° C jusqu'à son utilisation pour l'étiquetage de la cellule.
    REMARQUE: stockage à -20 ° C réduit considérablement la cinétique de dégradation et augmente la durée de vie.

5. marquage des cellules avec SPIONs

  1. Suspendre une partie aliquote de SPIONs dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) à une concentration de 40 mg / ml et sonication pendant 30 min.
  2. Ajouter la solution dans un ballon SPION presque confluente de cellules à une concentration de 5 ul / ml de milieu de culture cellulaire. Assurer une distribution uniforme en secouant délicatement le flacon.
  3. Incuber les cellules pendant 16 heures à 37 ° C.
  4. Aspirer doucement milieu de culture et laver les cellules deux fois avec PBS.
  5. Recueillir des cellules magnétiquement marquées et utiliser pour des expériences.
  6. Solution de SPION utilisé peut être conservé à 4 ° C et devrait nous êtreed dans quelques mois. Sonication pendant 30 min avant chaque utilisation.

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Résultats

Des nanoparticules de magnétite sont d'environ 10 nm de diamètre par suite d'une agitation une solution aqueuse de fer (III) et le chlorure de fer (II) tétrahydrate de chlorure à 50 ° C et 1 000 tours par minute (figure 1). Ces résultats démontrent la synthèse réussie de nanoparticules de magnétite. Il est important de vérifier la taille et la forme de nanoparticules de magnétite prises à partir d'un petit échantillon de la charge lors d'une tentative de synthèse pour la première fois. M...

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Discussion

Comme pour tout protocole de synthèse de nanoparticules, la pureté des substances chimiques réactifs est critique pour la réalisation de SPIONs de haute qualité qui auront des effets cytotoxiques minimales. Il est donc important d'acheter des réactifs très purs dont l'acide oléique (≥99%), le fer (II) tétrahydrate de chlorure (≥99.99%), le fer (III) chlorure (≥99.99%), l'acétate d'éthyle (qualité HPLC, ≥99.9% ), de l'hexane (de qualité pour CLHP, ≥97.0%), de l'hydroxyde d'ammonium (de ≥99.99%...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Remerciements

Les auteurs tiennent à remercier le Fonds européen de développement régional – FNUSA-CICR (no. CZ.1.05/ 1.1.00/ 02.0123), la subvention de développement scientifique de l’American Heart Association (AHA #06-35185N) et les National Institutes of Health (NIH #T32HL007111).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Solution d’hydroxyde d’ammonium, 28 % de NH3 dans H2O, &ge ; 99,99 % de base de métaux tracesSigma-Aldrich338818-100ML  ;Réactif nocif - porter un équipement de protection individuelle
Flacon Dreschel, 500 mlAce Glass5516-16
Acétate d’éthyle, CHROMASOLVR Plus, pour HPLC, 99,9 %  ;Sigma-Aldrich650528-1LRéactif nocif - porter un équipement de protection individuelle et travailler dans une hotte
Alcool éthyliqueSigma-AldrichE7023Réactif nocif - porter un équipement de protection individuelle
Flacon d’évaporation, 50 ml, joint 24/40Sigma-AldrichZ515558À utiliser avec le rotoevaporateur
Papier filtre, 3 cm de diamètre, grade 1Fisher09-805PÀ utiliser avec l’entonnoir filtrant en verre
Béchers en verre, 1 LFisherFB-101-1000Pour le lavage des SPION
Entonnoir à filtre en verre, adaptateur de tuyau d’aspiration, convient à 24/40, 30 mLFisherK954100-0344  ;
Bouchons de flacons en verreFisher03-391-46À utiliser avec des flacons en verre
Flacons en verre, 2 mlFisher03-391-44Pour recueillir le gel de magnétite & SPIONs
Hexane, CHROMASOLVR, pour HPLC, &ge ; 97.0 % (GC)Sigma-Aldrich34859-1L  ;Réactif nocif - porter un équipement de protection individuelle et travailler dans la hotte
Acide chlorhydriqueSigma-AldrichH1758Réactif nocif - porter un équipement de protection individuelle et travailler dans une hotte
Chlorure de fer(II) tétrahydraté, &ge ; 99,99 % base de métaux traces  ;Sigma-Aldrich380024-5GRéactif nocif - porter un équipement de protection individuelle
Chlorure de fer(III) anhydre, poudre, &ge ; 99,99 % de base d’oligo-métauxSigma-Aldrich451649-1GRéactif nocif - porter équipement de protection individuelle
Chauffage Isomantle, 500 mLVoight GlobalEM0500/CEX1
Mélangeur de laboratoireSilversonL5M-A
LyophilisateurLabconco7670520
MicrospatulesFisher21-401-25APour le transfert de magnétite gel
aimant NdFeB, 1 in x 1 in x 1 inAmazing MagnetsC1000H-MAimant très puissant, manipuler avec soin
Acide oléique, &ge ; 99 % (GC)Sigma-AldrichO1008-5G  ;Conserver au congélateur ; Réactif nocif - porter un équipement de protection individuelle
Agitateur aérienIKA2572201
Pince d’agitateur aérienIKA2664000À utiliser avec un agitateur aérien
Agitateur aérien H-standIKA1412000À utiliser avec un agitateur aérien
Saline tamponnée au phosphateLife Technologies10010-023
Béchers en plastique, 250 mlFisher02-591-28
PLGA PURASORB PDLG (mélange 75/25)PuracPDLG 7502PDLG 7502A peut également être utilisé ; Conserver au congélateur
la poudre Pluronic F-127, BioReagent, adaptée à la culture cellulaireSigma-AldrichP2443-250G  ;
Palette à lame extensible en PTFE, diamètre 8 mmSciQuipSP4018
convient à une palette de 24/40, 8 mm de diamètreAdaptateur de cuve en PTFE Monmouth Scientific A480À utiliser avec une palette à lame extensible en PTFE
Refroidisseur à recirculationClarkson696613À utiliser avec le révaporateur
rotatif Condenseur à reflux, convient à 24/40, 250 mmAce Glass5997-133
RotoévaporateurClarkson216949
Septa en caoutchouc, pour 24/40Ace Glass9096-56
Entonnoir séparateur avec bouchon, 250 mlFisher10-438E
Réactif ACS sulfate de sodium, &ge ; 99,0 %, anhydre, granulaireSigma-Aldrich239313-500G  ;
Fiole à fond rond à trois cols, coudée, joints 24/40, 500 mlAce Glass6948-16
Nettoyeur à ultrasons Bac perforéFisher15-335-20AÀ utiliser avec nettoyeur à ultrasonsNettoyeur
à ultrasons, 2,8 LFisher15-335-20
Régulateur de videClarkson216639À utiliser avec le rotoevaporateur (en option)
Vide pompeClarkson219959À utiliser avec le rotoevaporateur
Adaptateur de cuve en PTFE ,

Références

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