Article de méthode

Génération de cellules souches pluripotentes induites à partir de cellules T périphériques humains à l'aide de virus Sendai dans des conditions libres Feeder-

DOI :

10.3791/53225

⸱

11 novembre 2015

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1Department of Cardiology, Keio University School of Medicine, 2Department of Emergency and Critical Care Medicine, Keio University School of Medicine

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce protocole décrit comment générer des cellules souches pluripotentes induites (iPSC) à partir de cellules T périphériques humaines dans des conditions sans nourrisseur en utilisant une combinaison de vecteurs viraux matrigel et Sendai contenant des facteurs de reprogrammation.

Résumé

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Récemment, CSPi ont attiré l'attention comme une nouvelle source de cellules pour des thérapies régénératrices. Bien que la méthode initiale pour CSPi générant invoqué fibroblastes dermiques obtenus par biopsie invasive et l'insertion génomique rétroviral de transgènes, il ya eu beaucoup d'efforts pour éviter ces inconvénients. Cellules périphériques humaines de T sont une source cellulaire unique pour générer des CSPi. iPSCs dérivées de cellules T contiennent des réarrangements du récepteur des cellules T (TCR) des gènes et sont une source de cellules T spécifiques d'antigène. En outre, le réarrangement T du récepteur de la cellule dans le génome a le potentiel pour marquer lignées cellulaires individuelles et la distinction entre les cellules transplantées et donateurs. Pour l'application clinique de iPSCs sûr, il est important de réduire au minimum le risque d'exposer iPSCs nouvellement générées à des agents nocifs. Bien que les cellules de sérum fœtal bovin et d'alimentation ont été essentielles pour la culture de cellules souches pluripotentes, il est préférable de les retirer du système de culture pour réduire le risquede pathogénicité imprévisible. Pour y remédier, nous avons établi un protocole pour générer CSPi de cellules périphériques T humains en utilisant le virus Sendai afin de réduire le risque d'exposition à des agents pathogènes CSPi indéfinis. Bien que le virus de Sendai manipulation nécessite un équipement avec le niveau de biosécurité appropriées, Sendai virus infecte les cellules T activées sans insertion du génome, mais avec une grande efficacité. Dans ce protocole, nous démontrons la génération de iPSCs à partir de cellules T périphériques humaines dans des conditions exemptes d'alimentation-en utilisant une combinaison de la culture des cellules T activées et le virus Sendai.

Introduction

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CSPi ont attiré une attention considérable en tant que source d'inauguration de cellules pour la médecine régénérative 1-3. À ce jour, diverses méthodes pour générer des CSPi ont été rapportés 4,5. Parmi ceux-ci, CSPi générées à partir de cellules T humaines ont été d'un intérêt particulier en raison de la méthode moins invasive de l'échantillonnage de la cellule 6-8. En outre, iPSCs dérivée de cellules T contient le gène réarrangements du récepteur des cellules T (TCR) et sont donc une source de cellules T spécifiques d'antigène 9,10. Par conséquent, la génération de cellules T dérivées CSPi est utile pour progresser en toute sécurité la médecine régénérative.

Cette méthode est basée sur le concept de la réduction des risques de pathogénicité imprévisible. Pour l'application clinique sûre des CSPi il est important de réduire le risque d'exposition à des agents pathogènes 11. Auparavant, de nombreux systèmes de culture de cellules souches pluripotentes, les cellules nourricières et de sérum bovin foetal ont été utilisés comme réactif essentielS 12. Cependant, l'élimination de ces deux réactifs du système de culture est préférable pour la production iPSC à réduire les risques de pathogénicité imprévisible.

En outre, ce procédé présente l'avantage d'éviter l'échantillonnage de cellules invasive de patients et laborieux préparation de cellules nourricières. Parce que les lymphocytes T dérivés CSPi ont déjà été utilisés avec succès dans la recherche de la maladie 13,14, cette méthode est également applicable et utile pour générer des CSPi maladies spécifiques de patients.

Parmi les méthodes de reprogrammation de cellules T, en utilisant le vecteur virus de Sendai (SeV) comme un véhicule génique est une méthode qui peut générer des CSPi avec un rendement élevé 7,16. En outre, parce SeV est un virus à ARN simple brin et n'a pas besoin d'une phase d'ADN pour la réplication, son utilisation dans la production iPSC évite la rupture du génome de l'hôte 17-19. Par conséquent, nous avons établi des protocoles pour générer CSPi de cellules périphériques T humains dans le sérum-frEE et les conditions de libre-alimentation utilisant une combinaison de matrigel, moyen mTeSR et SeV vecteurs.

Protocole

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1. Préparer les lymphocytes T activés humain

  1. Recueillir 10 ml héparinés sang total d'un donneur par ponction veineuse.
    1. Obtenir le consentement éclairé des donneurs à l'avance de la ponction veineuse. Ponction veineuse doit être effectué par du personnel qualifié et formé.
    2. Manipulez les échantillons sanguins obtenus avec du matériel stérile et des lignes directrices en matière de biosécurité appropriées suivantes.
  2. Diluer 10 ml de sang entier héparinisé avec 10 ml D-PBS (-).
  3. Mettre 15 ml de solution de Ficoll (PREMIUM Ficoll-Paque) dans un nouveau tube conique de 50 ml.
  4. Couche de la solution de sang de 20 ml préparée à l'étape 1.2 sur la solution de Ficoll à l'étape 1.3. En utilisant une pipette électrique, laissez solution de sang préparé à l'étape 1.2 courir lentement le long de la paroi intérieure du tube. Veillez à ne pas mélanger la solution de sang et de solution de Ficoll.
  5. Centrifuger à 400 g pendant 30 min à température ambiante. Réglez la vitesse de décélération centrifuge pour "ralentir".
    Remarque: Après centrifugation, une fine blanchecouche émerge entre une couche de plasma laiteuse supérieure et une couche de Ficoll inférieure claire. Cette mince couche blanche contient des cellules mononucléaires.
  6. Transférer la couche de cellules mononucléées dans un nouveau tube conique de 50 ml avec une pipette de 1 ml. Soyez prudent de ne pas inclure solution de Ficoll.
  7. Ajouter D-PBS (-) pour les cellules mononucléaires à un volume total de 10 ml, et centrifuger à 200 g pendant 5 min à température ambiante.
  8. Jeter le surnageant. Ajouter 10 ml de D-PBS (-) pour les cellules mononucléaires, et centrifuger à 200 g pendant 5 min à température ambiante.
  9. Jeter le surnageant, ajouter 1 ml de milieu KBM502 aux cellules mononucléaires recueillies, et de compter les cellules en utilisant un hémocytomètre. Plus de 5 x 10 6 cellules mononucléaires peuvent être obtenus à partir de 10 ml du sang total hépariné avec une séparation appropriée à l'aide de Ficoll.
  10. Préparer une solution anti-CD3 humain anticorps à une concentration de 10 pg / ml dans du D-PBS (-). Ajouter la solution d'anticorps anti-CD3 humain à une plaque de 6 puits, faire tremper les vaguesas de chaque puits et incuber le plat à 37 ° C dans un incubateur à CO 2 de 5% pendant au moins 30 min.
  11. Retirer la solution d'anticorps anti-CD3 humain à partir de chaque puits et laver une fois avec du D-PBS (-) juste avant l'ensemencement des cellules.
  12. Des cellules mononucléaires de semences qui ont été préparés à l'étape 1.9, à une densité de 2,5 x 10 5 cellules / cm 2 sur les CD3 anti-humain de l'anticorps enduit des plaques à 6 puits dans du milieu KBM502. Incuber à 37 ° C dans un 5 incubateur -CO 2% pendant 3-7 jours sans changement de milieu jusqu'à ce que les cellules atteignent la confluence T. Cellules T dans cette période sont les deux cellules en suspension et adhérents.

2. Infect T cellules humaines avec SeV Vecteurs

  1. Après la culture 3-7 jours, recueillir les cellules T activées avec un milieu existant par pipetage. Les transférer à un tube conique de 15 ml et centrifuger à 200 g pendant 5 min à température ambiante.
  2. Retirer le surnageant et ajouter 1 ml de milieu de KBM502 frais. Compter les cellules et la plaque 1.5 x 10 6 cellules (dans 2 ml de milieu frais KBM502) dans chaque puits d'une plaque à 6 puits revêtues d'anticorps anti-CD3.
  3. Décongeler les solutions SeV de OCT3 / 4-SEV / TSΔF, SOX2-SEV / TSΔF, KLF4-SEV / TSΔF, et c-MYC (HNL) -sev / TS15ΔF sur la glace.
  4. Ajouter les solutions contenant OCT3 SeV / 4-SeV / TSΔF, SOX2-SeV / TSΔF, KLF4-SeV / TSΔF, et c-MYC (HNL) -sev / TS15ΔF individuellement dans les puits, chacun à une multiplicité d'infection (MOI) 10. Incuber à 37 ° C dans un 5 incubateur -CO 2% pour 24 une autre heure.

3. Retirez Vecteurs SEV de la T cellules humaines

  1. 24 h après l'infection, les cellules infectées recueillir avec une pipette. Si il ya des cellules adhérentes, elles se détachent facilement les pipetage à plusieurs reprises de haut en bas. Les transférer à un tube conique de 15 ml, et centrifuger à 200 g pendant 5 min à température ambiante.
  2. Retirer le surnageant contenant les vecteurs SEV, et ajouter 2 ml de milieu de KBM502 frais. Cellules replate dans each des puits. Incuber à 37 ° C dans un 5 incubateur -CO 2% pour une heure 24 supplémentaire.

4. Les cellules réensemencer sur une couche de Matrigel

  1. Préparer la solution de la matrice de la membrane basale par le gel de la matrice de la décongélation (s'il vous plaît voir la liste des matériaux pour la marque spécifique utilisée dans cette étude) au 4 ° C et la dissolution de 0,2 ml dans 10 ml de milieu DMEM / F12.
    Remarque: gel de Matrix (voir s'il vous plaît la Liste des matériaux pour la marque spécifique utilisée dans cette étude) besoin de dégeler O / N à 4 ° C pour être complètement dégelé. Gardez-le sur la glace jusqu'à ce que juste avant l'utilisation.
  2. Planche 5 ml de solution de matrice de la membrane basale dans des plats par boîte de 100 mm et de laisser à température ambiante pendant au moins 30 min avant l'ensemencement des cellules. Au moins deux plats de 100 mm sont nécessaires pour une expérience.
  3. Recueillir des cellules SeV-infectés par le pipetage, les transférer dans un tube conique de 15 ml, et centrifuger à 200 g pendant 5 min à température ambiante.
  4. Retirer le surnageant et ajouter 1 ml de milieu de KBM502 frais. Comptez le nombre de CElls en utilisant un hémocytomètre, retirez la solution sous-sol de la matrice de la membrane des plats de 100 mm préparé à l'étape 4.2 et la plaque 1 × 10 5 et 1 × 10 6 cellules (dans 10 ml de milieu de mTeSR frais) sur un 100-mm membrane basale matrice revêtu de la vaisselle. Enfin, utilisez la plaque dans laquelle les colonies sont facilement ramassés.
  5. Incuber le plat à 37 ° C dans un 5 incubateur% -CO 2 H / N.
  6. Changer le support à 10 ml chair moyen mTeSR chaque autre jour.
    Remarque: Environ 20-30 jours après l'infection, les colonies qui ressemblent étroitement à des cellules souches embryonnaires (CSE) apparaîtra.

5. Développer T CSPi cellulaires dérivées

  1. Préparer la solution de la matrice de la membrane basale par le gel de la matrice de la décongélation (s'il vous plaît voir la liste des matériaux pour la marque spécifique utilisée dans cette étude) au 4 ° C et la dissolution de 0,2 ml dans 10 ml de milieu DMEM / F12.
  2. Planche 1 ml de la solution de matrice de membrane basale par puits dans une plaque à 6 puits et laisser à température ambiante pendant aumoins 30 min avant prélèvement de colonies.
  3. Remplir une plaque de 96 puits avec 20 pi de milieu mTeSR par puits.
  4. Sélectionnez colonies qui ressemblent CES sous le stéréomicroscope aide d'une pipette de 20 pi.
    Remarque: Les colonies de CES et CSPi sont rond et plat comme dans la figure 1B.
  5. Transfert colonies sélectionnées dans la plaque de 96 puits rempli avec un milieu mTeSR à l'étape 5.3.
  6. Ajouter 200 pi de milieu mTeSR à chaque puits et soigneusement la pipette de haut en bas pour briser la colonie en petites touffes sous le stéréomicroscope aide d'une pipette de 200 pi. Retirer la solution de la matrice de la membrane basale du bien préparé en 5.2 et de mettre chaque colonie dans un puits de la matrice revêtu membrane basale plaque de 6 puits avec 2 ml de milieu mTeSR par puits.
  7. Changer le support à 2 ml chair moyen mTeSR tous les autres jours.

6. Maintenir T CSPi cellulaires dérivées

Les iPSCs dérivés de cellules T peuvent être maintenuset stockée en utilisant les mêmes techniques que pour les CSPi humaines et CES de l'homme. Une fois colonies iPSC grandissent, développez-les dans de grands plats en répétant la même procédure.

  1. Changer le support mTeSR tous les 1-2 jours.
  2. Lorsque les colonies deviennent confluentes tous les 5-7 jours, passage des cellules en utilisant une solution de dissociation pour les CSPi humaines et CES de l'homme conformément aux instructions du fabricant.

Résultats

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En utilisant ce protocole, les utilisateurs sont en mesure de générer des CSPi de cellules périphériques T humains de manière stable. génération iPSC à partir de cellules avec SeV et matrigel T a montré environ 0,002% -. 0,005% de l'efficacité de la reprogrammation cellulaire entre plusieurs cas de donateurs et SeV ont pas été détectés après plusieurs passages 16 Figure 1A montre un schéma du protocole pour générer des cellules T-dérivé CSPi dans des conditions exemptes de cellules nourricières utilisant matrigel et moyennes mTeSR. Environ 20-30 jours après l'infection par SEV, colonies iPSC sont reconnus par leur ESC colonie comme la morphologie (figure 1B). Immunofluorescence a révélé l'expression de marqueurs de cellules pluripotentes typiques (NANOG, OCT3 / 4, SSEA4, TRA-1-60, et TRA-1-81) dans T CSPi dérivés de cellules généré dans des conditions sans cellules nourricières (figure 1C).

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Figure 1. (A): Un schéma du protocole pour la reprogrammation des cellules T dans des conditions sans cellules nourricières dans cette étude. (B): Une colonie iPSC ESC comme typique le jour 27 après le prélèvement de sang dans des conditions sans alimentation. (C): ALP coloration et immunofluorescence pour les marqueurs de pluripotence et de surface (NANOG, OCT3 / 4, SSEA4, TRA-1-60, et TRA-1-81) dans T CSPi dérivés de cellules produites dans des conditions sans alimentation. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Discussion

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Nous décrivons un protocole permettant de générer des iPSC à partir de lymphocytes T périphériques humains dans des conditions sans sérum et sans mangeur en utilisant une combinaison de matrigel, de milieu mTeSR et de vecteurs SeV. Pour les applications cliniques des CSPi, il est important de disposer d’un protocole pour générer des CSPi de manière stable et d’une méthode moins invasive pour l’échantillonnage cellulaire. Bien que la génération d’iPSC avec la combinaison d’un milieu matrigel et d’un milieu mTeSR ait montré une efficacité de reprogrammation inférieure à celle d’un milieu de remplacement sérique knock-out (KSR) et de cellules nourricières, cette combinaison permet une génération stable d’iPSC à partir de donneurs16. La génération stable d’iPSC et l’échantillonnage cellulaire moins invasif ont l’avantage de pouvoir augmenter le nombre de donneurs pour la génération d’iPSC.

Les vecteurs SeV, un virus à ARN à brin négatif, ne sont pas intégrés dans le génome de l’hôte. Par conséquent, les risques de tumorigenèse peuvent être évités à l’étape de reprogrammation de l’induction du facteur20-24. De plus, les conditions exemptes de nourrisseur, qui utilisent une combinaison de milieu de culture défini et de matrigel au lieu d’une couche nourricière, permettent de minimiser les risques potentiels d’exposition à des facteurs exogènes inconnus. La fusion de ces techniques permet d’obtenir une technologie iPSC moins invasive et plus sûre pour la médecine régénérative16.

Les étapes importantes de ce protocole sont l’étape d’activation des lymphocytes T humains (étape 1) et leur infection avec des vecteurs SeV (étape 2). Lorsqu’aucune colonie de type ESC n’est obtenue dans la boîte de culture à un moment optimal après l’infection par le SeV, les éléments suivants doivent être pris en compte. Tout d’abord, la confluence des cellules mononucléées avant l’activation des lymphocytes T peut ne pas être appropriée, car l’activation optimale des lymphocytes T est essentielle pour l’infection par le SeV25,26. Une densité trop élevée de cellules mononucléées conduit à la mort cellulaire, interférant avec l’activation correcte des cellules T. Une densité trop faible de cellules mononucléées perturbe également l’activation et la prolifération des lymphocytes T. Par conséquent, la confluence des cellules mononucléées doit être vérifiée et ajustée en conséquence. Deuxièmement, le dosage des vecteurs SeV peut ne pas être suffisant. L’efficacité d’induction des colonies d’iPSC dépend du dosage du virus6. Si aucune colonie de type ESC n’est observée après l’infection par le SeV, la possibilité d’augmenter la dose de virus jusqu’à un MOI de 15-20 doit être envisagée. Si des signes de différenciation des colonies d’iPSC sont observés, la fréquence à laquelle le milieu est changé peut être augmentée jusqu’à tous les deux jours, ou jusqu’à tous les jours lorsque les colonies sont plus grandes.

La limitation de ce protocole consiste en ce que cette méthode n’est pas exempte de virus. Bien que le SeV pour la reprogrammation cellulaire soit facilement disponible dans le commerce, les utilisateurs doivent préparer l’équipement en fonction du niveau de biosécurité approprié. Comme autre méthode pour générer des iPSC sans intégration, les vecteurs épisomaux ont été utilisésjusqu’à présent 27-29. Bien que les vecteurs épisomiques puissent être utilisés avec des équipements ayant un niveau de biosécurité inférieur, les vecteurs épisomiques peuvent s’insérer dans le génome de l’hôte à des taux extrêmement faibles. Par conséquent, des contrôles supplémentaires sont nécessaires pour confirmer la disparition des transgènes, comme lors de l’utilisation du SeV.

Il y a une autre limitation dans le fait que cette technique n’est pas absolument exempte de produits d’origine animale. Certains substrats, tels que le matrigel, les anticorps monoclonaux anti-CD3, la solution de dissociation et la solution SeV, sont dérivés de produits animaux et sont donc associés à un risque de transfert d’agents pathogènes xénogéniques. Cependant, la réduction des substrats d’origine animale dans le système de culture est significative pour l’application clinique de la technologie iPSC en raison du risque plus faible.

Déclarations de divulgation

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Les auteurs ne sont pas des intérêts concurrents ou à divulguer contradictoires.

Remerciements

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Nous remercions Yoshiko Miyake, Sayaka Kanaami, Chihana Fujita, Miho Yamaguchi, Natsuko Henmi, et Rei Ohno de l'École de médecine de l'Université de Keio pour l'assistance technique. Ce travail a été financé en partie par un programme de soutien à la R & D Systems pour accélérer l'utilisation pratique des résultats de la recherche en santé, et le Programme de route pour la réalisation de la médecine régénérative.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Ficoll-Paque PREMIUMGE Healthcare17-5442-02
Souris NA/LE purifiée anti-humaine CD3BD Pharmingen555336
Solution d’albumine bovine fraction VGibco15260-037
mTeSR1 medium kitSTEM CELL5850Chauffer à température ambiante avant utilisation
Solution de dissociationReproCELLRCHETP002
D-PBS(&ndash ;)Wako045-29795
SeV Vector kit CytoTune-iPS ver.1.0DNAVECDV-0303cDécongeler sur de la glace avant utilisation
Boîte de culture tissulaire de 100 mmFalcon353003
Plaque de culture tissulaire à 96 puitsFalcon353078
Plaque de culture tissulaire à 6 puitsFalcon353046
15  ; ml Tube à centrifugerGreiner Bio-One188271
50  ; ml Tube à centrifugerGreiner Bio-One227261

Références

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Mots-clés

Culture de lymphocytes T activ sr arrangement du r cepteur des lymphocytes Tmatrice de membrane basalemilieu M T E S Rmarqueurs de cellules pluripotentesmarquage immunofluorescent

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