Quantification des souches du côlon mutations de cellules

Résumé

Nous rapportons des améliorations significatives pour la mesure reproductible des mutations somatiques des cellules souches du côlon après exposition de souris à des agents potentiellement dommageables de l’ADN.

Résumé

La capacité de mesurer les mutations de cellules souches est un outil puissant pour quantifier dans une population de cellules critique si, et dans quelle mesure, un produit chimique peut induire des mutations qui conduisent potentiellement à un cancer. L'utilisation d'un dosage enzymatique pour quantifier des mutations de cellules souches dans le gène de la glucose-6-phosphate-déshydrogénase liée au chromosome X a été indiqué précédemment. ¹ Ce procédé nécessite la préparation de coupes congelées et incubation du tissu sectionné avec un mélange de réaction qui donne un couleur bleue si les cellules produisent fonctionnelle glucose-6-phosphate déshydrogénase (G6PD) enzyme. Si non, les cellules apparaissent blanchâtres. Nous avons modifié le mélange réactionnel en utilisant Optimal Cutting Temperature composé (OCT) moyen à la place de l'alcool de polyvinyle. Ceci facilite la mesure de pH, augmente la solubilisation des composants de coloration de la G6PD et limite la diffusion de l'enzyme G6PD. Pour démontrer que la mutation a eu lieu dans une cellule souche, l'ensemble doit crypte manque G6PD enzymatiqueactivité. Seulement si une cellule souche abrite une mutation G6PD phénotypique sera tout de la descendance dans la crypte manquer activité enzymatique en G6PD. Pour identifier les cryptes avec une mutation de cellules souches, quatre coupes congelées adjacentes consécutives (un niveau) ont été coupées à 7 um d'épaisseur. Cette approche de faire des coupes adjacentes conformation qui fournit une crypte a été entièrement muté depuis la même crypte muté sera observée dans les sections adjacentes. Diapositives avec des échantillons de tissus qui étaient plus de 50 um part étaient prêts à évaluer d'un total de> 10 ⁴ cryptes par souris. La fréquence de mutation est le nombre de mutés (blanc) cryptes Observée ÷ par le nombre de type sauvage (bleu) cryptes dans un groupe de traitement.

Introduction

Le cancer du côlon est pensé pour impliquer une exposition à des agents environnementaux et composants alimentaires qui peuvent endommager l'ADN et de produire des mutations activatrices somatiques dans oncogènes (par exemple, la ß-caténine) ou d'inactiver les mutations dans les gènes suppresseurs de tumeurs (par exemple, APC). On suppose que ces mutations se produisent dans les cellules critiques souches du côlon. En raison de l'architecture de la crypte unique de l'épithélium du côlon, il est possible de mesurer des mutations de cellules souches dans le côlon après avoir exposé les animaux à des produits chimiques associés à la cancérogenèse colique. Plusieurs enzymes liées au chromosome X peuvent servir d'indicateurs pour des mutations qui se produisent dans les cellules souches, comme les mutations seront présentes dans toutes les cellules au sein d'une crypte.

Auparavant, une procédure a été publiée démontrer que les produits chimiques qui induisent des tumeurs du côlon chez les souris générées également des mutations de cellules souches somatiques dans le côlon par l'intermédiaire d'une analyse de mutations de la glucose-6-phosphate déshydrogénase liée à l'X (G6PD) gène ^1-3.La méthode quantifie l'incidence des mutations somatiques aléatoires dans les cellules souches du côlon sans aucune pression de sélection. La procédure implique la production de sections congelées non fixées du côlon de souris traitées et de contrôle et l'identification des cryptes dépourvues de cellules qui produisent l'activité de la G6PD fonctionnel. Ces cryptes mutées, qui apparaissent blancs, indiquent que la mutation a eu lieu dans une cellule souche qui a donné lieu à une progéniture hébergeant également gène G6PD mutant. Dans le dosage enzymatique, G6PD mutant déficient cryptes peuvent pas oxyder le glucose-6-phosphate, qui est nécessaire pour la réduction du nitro bleu de tétrazolium (NBT). Lorsque l'enzyme est fonctionnelle en G6PD, le NBT dans le mélange de coloration est réduite à formazan insoluble et précipités, l'accumulation à l'emplacement de l'enzyme et des cellules "bleues" de coloration. Les cellules qui sont des mutants de la G6PD restent blanchâtre à la différence de cryptes colorés bleus de type sauvage. Cette méthode permet de mesurer les mutations qui ont un phénotype «nulle». Parce que enenzymes, comme la G6PD, peut diffuser hors des cellules sur une section de tissu non fixé si les articles sont placés dans une solution aqueuse, il est nécessaire de stabiliser l'enzyme dans les sections de tissu à analyser. ⁴ La stabilisation de l'enzyme dans le le tissu ne doit pas interférer avec la diffusion de petites molécules nécessaires à la réaction enzymatique en G6PD de réactifs.

Nous avons fait un certain nombre de changements importants dans la procédure initiale. Le milieu pour la coloration enzymatique critique a été modifié à partir de l'alcool polyvinylique à Optimal Cutting Température composé (OCT), ce qui facilite le contrôle du pH et la solubilisation des composants utilisés dans l'essai. La coloration est effectuée en utilisant 0,4 - 0,5 ml puits en rondelles en acier de sorte que chaque section de tissu a reçu le même volume de mélange de réaction de la G6PD. Une procédure a été développée pour estimer le nombre de cryptes dans une section imagée qui fournit un grand échantillonnage du tissu du côlon, sans avoirde compter manuellement> 10 ⁵ cryptes pour chaque colon. L'analyse des coupes de tissus adjacents 7 um permet la visualisation d'une crypte mutant sur plus d'un coulisseau, ce qui permet de réduire des artefacts de coloration potentiels. Ces changements rendent la procédure plus efficace et reproductible.

En utilisant ce protocole révisé, nous avons quantifié la fréquence de mutation dans les cellules souches du côlon après exposition des souris C57BL / 6 à azoxyméthane, un cancérogène du côlon bien connu chez les rongeurs. ^5-7

Protocole

Les procédures expérimentales et traitement éthique des animaux a été approuvé par l'Université de Pittsburgh IACUC (protocole # 1104674).

1. Préparation de la G6PD coloration Mélange

NOTE: Assurez-vous que la concentration finale de chacun des réactifs est la suivante; 5 mM de glucose-6-phosphate (G6P); 2 mM de NADP, 5 _mM de MgCl2, 1 mM de 0,35-méthoxy-5-méthylphénazinium sulfate de méthyle (MMPMS) et 0,8 mM NBT. ^1,8,9 Pour chaque réactif, la concentration initiale a été obtenue pour un 40 ml de volume final. Des solutions ont été fraîchement préparés et utilisés chaque jour.

1. Ajouter 2 ml de 200 mM pH 7,4 tampon phosphate (PB) à 35 ml de milieu PTOM un tube de 50 ml et agiter vigoureusement. Confirmez avec du papier pH que la solution est d'environ pH 7,4. Si jetez pas la solution.
2. Ajouter 61 mg G6P dissous dans 0,94 ml de PB 200 mM, 61 mg PNDA dissous dans 0,94 ml de PB 200 mM, et 41 mg _de MgCl2 dissous dans 0,96 ml de 100 mM PB. Reconfirmons que le pH est de 7,4 ~ esprith papier pH. Sinon ~ 7.4, jeter la solution.
3. Ajouter 5 mg de MMPMS dissous dans 0,25 ml de PB 200 mM (pH 7,4). Agiter vigoureusement le mélange réactionnel résultant pour générer un homogénat rouge foncé clair. Si la solution est trouble, le mélange doit être jetée. Le tube contenant le mélange de réaction est enveloppé dans une feuille de minimiser l'exposition à la lumière. Stocker le mélange réactionnel à la température ambiante tandis que le composant final, NBT, est préparé.
4. Préparer séparément une solution NBT 5 mM en ajoutant 0,4 ml de formamide de diméthyle (DMF) anhydre et 0,4 ml d'éthanol anhydre à 164 mg de NBT dans un tube de 2 ml avec un couvercle joint torique. Fermez le couvercle lâche (non étanche) et porter la solution à ébullition vigoureuse dans un bain d'huile jusqu'à ce que le NBT est en solution. ⁸
5. Laisser le NBT solubilisé refroidir à température ambiante puis ajouter toute la solution au mélange de réaction PTOM et agiter vigoureusement pour obtenir une solution claire. Observez le changement de couleur de la solution de rouge-orange initial à un rouge foncé ou purpLe couleur au fil du temps. C'est normal.
6. Placez le mélange final G6PD de coloration dans un 37 ° C pièce chaude pendant 1 heure avant utilisation.

2. Traitement des animaux et de collecte de tissus

1. Traiter six semaines d'âge souris C57BL / 6 mâles avec un agent endommageant l'ADN, par exemple, 10 mg / kg azoxymethane (AOM) dans un volume de 200 ul de PBS par injection ip. Traiter les souris témoins avec 200 ul de PBS par injection ip.
2. À 90 jours, euthanasier les souris _par le CO 2 asphyxie suivie par dislocation cervicale tel qu'approuvé par le protocole IACUC.
3. Chirurgicalement ouvrir la cavité abdominale juste au-dessus de l'anus de la base du sternum. Déplacer l'intestin grêle hors de la cavité du corps, mais elle ne exciser. Exciser l'intestin grêle juste en dessous du cæcum au rectum. ¹⁰
4. Découper soigneusement le long d'un côté du côlon en utilisant une paire de ciseaux micro-dissection et enlever les matières fécales du côlon ouvert propre par lavage avec du PBS stérile. Swiss roll le accised côlon avec la face luminale tournée vers l'extérieur, et le placer dans un moule de tissu. ¹⁰
5. Immerger complètement le côlon dans un PTOM, moyen et lieu moule dans un Dewar contenant de l'azote liquide _2. Tenez le moule de sorte que la base en plastique est juste en contact avec le liquide N _{2 jusqu'à ce que} le moyen PTOM gelé.
6. Rangez le bloc de tissu congelé à -80 ° C jusqu'à la coupe des coupes congelées. Ne pas utiliser de fixateur, ce qui donnerait lieu à l'inactivation de l'enzyme de la G6PD.

3. Préparation des sections congelées

1. Couper des sections de tissus congelés à une épaisseur de 7 pm en utilisant un cryostat à -25 ° C. Couper 4 7 um sections consécutives et placer deux d'entre eux sur la même lame (Figure 1). Préparez 2 toboggans, quatre ou 7 um sections consécutives pour représenter un niveau du côlon (Figure 1).
2. Répéter pour le prochain niveau avec une distance minimale de> 50 um à partir de la dernière section de la prEvious niveau. Cette distance est assuré que les cryptes évalués pour chaque niveau ne reproduisent pas les uns les autres.
3. Foire essuyer la lame de cryostat avec 100% d'éthanol pour enlever le résidu des PTOM qui accumule pendant la coupe. Avant de sectionnement est reprise, la lame sec est essuyée avec une feuille sèche antistatique pour dissiper la charge statique accumulée. Stocker les lames avec les coupes congelées à -80 ^o C.

4. La coloration des tissus congelés Section

1. Effectuer la réaction enzyme histochimie dans un 37 ° C chambre chaude avec une humidité élevée.
   REMARQUE: Tenter la réaction enzymatique dans un four d'incubation ou sur une plus chaud de diapositives a conduit à une mauvaise et incohérente coloration en G6PD.
2. Construire des puits pour la coloration des tissus en utilisant deux 1,5 cm x 0,15 cm rondelles d'acier (diamètre intérieur x hauteur) qui sont collées ensemble avec de la graisse de silicone (Figure 1). Couper le parafilm pour correspondre à la base du puits avec le centre découper et le lieu de biend sur la coupe de tissu sur la diapositive.
   Remarque: le parafilm sur le fond de la rondelle crée un joint entre le coulisseau et la rondelle qui maintient le mélange visqueux G6PD de coloration sur la coupe de tissu. Cette construction donne une bien avec un 0,4 - 0,5 ml de volume de sorte que chaque section de tissu dans l'étude reçoit le même volume du mélange de réaction de coloration de la G6PD.
3. Incuber les lames de tissus congelés à 37 ^o C dans une pièce chaude pendant 10 min. A 37 ° C, ajouter le mélange de réaction G6PD de coloration à chaque section de tissu puits (2 sections par lame) pour 45-50 min. Retirer les lames de pièce chaude, et soulevez délicatement les puits en acier inoxydable au large des diapositives.
4. Ensemble lames sur leur grand côté pour permettre au milieu réactionnel au drain. Placer les lames dans 100 mM PB (pH 7,4) pendant 30 à 60 minutes pour éliminer le mélange de réaction G6PD de coloration du tissu sans perturber la coloration des tissus. Plonger les lames dans de l'eau distillée pendant 5-10 min pour éliminer les sels PB
5. Sceller le tissu par adjonctioning fluoro-gel à partir d'un compte-gouttes sur le tissu et d'attente ~ 30 min pour le sécher. Éviter les bulles qui peuvent confondre l'identification des cryptes mutés.
   Remarque: si des bulles se forment, la procédure peut être répétée après enlèvement de la fluoro-gel par trempage dans de l'eau distillée. Ne pas utiliser des lamelles comme ils ont tendance à bulles d'air piège.

5. Détermination de la G6PD Mutant cryptes et Mutation Fréquence

1. Analyser diapositives pour G6PD cryptes mutantes sous un microscope optique.
   REMARQUE: Les critères utilisés pour identifier une crypte entièrement mutant étaient: (i) la totalité de la crypte était dépourvue de couleur bleue; (ii) la structure externe de la crypte était intact, (iii) le mutant a été observé crypte de 7 um sections adjacentes et, (iv) deux observateurs ont pour identifier le même crypte comme un mutant. Mutants observés sur 7 um sections adjacentes sont comptés comme un seul mutant.
2. Chaque image crypte mutant G6PD à un grossissement de 40x et de cataloguer les images à l'aide d'un appareil photo 5,0 mégapixels avecun logiciel d'imagerie.
3. Quantifier le nombre total de cryptes examinés dans une souris en sélectionnant une section représentant pour chaque souris à partir du niveau de la surface plus petite et de l'image au moment de grossissement de 10x (figure 1C).
   REMARQUE: Un niveau représente quatre 7 um sections consécutives (figure 1D), qui en raison de leur proximité montrent souvent mutés cryptes sur plus d'une section. Les niveaux sont séparés par> 50 um à visualiser cryptes de différentes régions du côlon.
4. Ouvrez chaque fichier image et comptez visuellement le nombre de cryptes sur un niveau en analysant les fichiers (représentées par des cases dans la figure 1C). Fichiers Images varient dans le nombre de cryptes observées d'aussi peu que 20 à> 300 cryptes dans un seul fichier.
5. Multipliez le nombre total des cryptes du niveau sélectionné (figure 1C) pour chaque souris par le nombre de niveaux de dépistage du G6PD cryptes mutantes pour chaque colon. Par exemple, un nombre total de1250 cryptes par niveau choisi multiplié par 8 niveaux projetés pour cryptes mutantes est égal à un nombre total de 10.000 cryptes. Évaluer un minimum de 10.000 cryptes pour chaque colon pour l'analyse statistique.
6. Combinez le nombre de mutants observés dans tous les animaux par le nombre total de cryptes projetés pour calculer le MF pour chaque traitement. Le niveau MF de cellules souches de fond dans les souris non traitées est <0.1x10 ^-4 (tableau 1), qui est proche de celle précédemment rapportée dans C57BL / 6. ¹¹

Résultats

La capacité de mesurer les mutations de cellules souches du côlon chez les animaux offre un moyen unique de corréler des mutations à l'induction du cancer. Normalement, il est supposé que l'étape critique dans la carcinogenèse implique l'activation des mutations dans des oncogenes et / ou inactiver les mutations dans les gènes suppresseurs de tumeurs. Nous avons injecté souris C57BL / 6 avec 200 pl de PBS ou de 10 mg / kg AOM dans 200 ul de PBS. AOM est un cancérogène du côlon connue. ^5-7 à 90 jours les deux ...

Discussion

Souvent l'effet génotoxique d'un composé est déterminée par sa capacité à modifier l'ADN. Cela se fait normalement en isolant le tissu et la mesure du niveau global d'adduits d'ADN. Pour AOM, cela impliquerait quantifier O ⁶ -méthylguanine adduits dans le côlon. En utilisant cette information d'approche sur les dommages dans des types cellulaires spécifiques, comme dans la niche de cellules souches, est perdu. En outre, un produit d'addition d'ADN est pas de même d'une muta...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
réactifs
nitroblue, tétrazolium
, NADP
, glucose-6-phosphate
1-méthoxy-5-méthylphénazinium
de phosphate de diméthylformamide
(pH 7,4
Composé à température de coupe optimale (OCT)  ;
Équipement
microscope optique équipé d’une caméra
cryostat
salle chaude