Method Article

Imagerie en trois dimensions et l’analyse des mitochondries dans les fibres nerveuses humaines intra-épidermiques

DOI:

10.3791/53369

⸱

September 29th, 2017

 ,  ,  , 
1University of Michigan Medical School, 2Department of Neurology, University of Michigan, 3Department of Internal Medicine, University of Michigan

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce protocole utilise des techniques d’imagerie et d’analyse en trois dimensions (3D) de visualiser et de quantifier les mitochondries nerveuses spécifiques. Les techniques sont applicables à d’autres situations où un signal fluorescent est utilisé pour isoler un sous-ensemble des données d’un autre signal fluorescent.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le but du présent protocole est d’étudier les mitochondries dans les fibres nerveuses intra-épidermiques. Par conséquent, des techniques d’imagerie et d’analyse 3D ont été développés pour isoler les mitochondries nerveuses spécifiques et évaluer les altérations induites par la maladie des mitochondries dans l’extrémité distale des nerfs sensitifs. Le protocole associe immunohistochimie de fluorescence, microscopie confocale et techniques d’analyse des images 3D de visualiser et de quantifier les mitochondries nerveuses spécifiques. Paramètres détaillés sont définies dans les procédures afin de fournir un exemple concret d’utilisation de ces techniques pour isoler les mitochondries nerveuses spécifiques. Anticorps ont été utilisés pour étiqueter le nerf et signaux mitochondriales dans des sections de tissu de peau punch biopsies, qui a été suivie par immunofluorescence indirecte pour visualiser les nerfs et les mitochondries avec un signal fluorescent vert et rouge respectivement. Z-série images ont été acquises avec la microscopie confocale et logiciel d’analyse 3D a été utilisé pour traiter et analyser les signaux. Il n’est pas nécessaire de suivre les paramètres décrits dans, mais il est important d’être cohérent avec ceux choisis tout au long de la coloration, les étapes d’acquisition et d’analyse. La force de ce protocole est qu’il est applicable à une grande variété de circonstances où un signal fluorescent est utilisé pour isoler les autres signaux qui serait autrement impossibles à étudier seul.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mitochondries remplissent des fonctions cellulaires vitales qui comprennent la production d’énergie cellulaire, mise en mémoire tampon de calcium et réglementer nécrotiques et apoptose cellulaire mort1,2,3. Le système nerveux a un métabolisme élevé par rapport au corps4 suggérant que les neurones génèrent un degré élevé d’énergie cellulaire sous la forme d’adénosine triphosphate (ATP) par le biais de la respiration mitochondriale. Un grand nombre de documents de preuve que les fonctions neuronales dépendent de l’ATP5, surtout dans les synapses6. Par conséquent, la répartition des mitochondries dans les neurones est importante.

Au cours des 10 dernières années, que beaucoup d’information a montré que le trafic et l’accostage des mitochondries neuronales est très réglementées. Protéines motrices sont impliqués dans la distribution des mitochondries à compartiments cellulaires spécifiques tout au long du neurone. Traite des mitochondries est particulièrement importante parce que les neurones du projet les axones et les dendrites loin de soma. Les protéines motrices kinésine directement essentiellement antérograde (à l’opposé le soma) traite des mitochondries le long des microtubules pendant la dynéine protéines motrices direct motilité rétrograde (vers le soma)7,8,9 , 10. il sont a des signaux cellulaires un tel potentiel de membrane mitochondrial et la conduction d’impulsion qui influent sur la présence et la direction de mitochondrial trafic11,12,13.

En plus de transporter les mitochondries, il y a des protéines spécialisées à localiser les mitochondries pour les compartiments cellulaires spécifiques qui ont des exigences de haute énergie, tels que les nœuds de Ranvier et synapses8,14, 17. en effet, la majorité des mitochondries dans les axones sont non motiles9,13,18. Les protéines spécialisées comme mitochondries ancre syntaphilin aux microtubules le long des axones tandis que les autres protéines d’ancrage mitochondries à l’actine cytosquelette19–21. Facteurs de croissance et d’ions tels que le calcium ont été signalées à l’appui de la cessation du mouvement des mitochondries afin de les localiser dans des régions où ils sont nécessaires21,22,23.

Pris ensemble, le trafic et d’amarrage des mitochondries sont vitales pour le bon fonctionnement des neurones. À l’appui de cela, perturbation dans le trafic mitochondriale a été associée liée plusieurs maladies neurologiques dont la maladie d’Alzheimer, sclérose latérale amyotrophique, maladie de Charcot-Marie-Tooth, maladie de Huntington, spastique héréditaire paraparésie et atrophie optique15,24,25,26,27. Des études récentes ont mis l’accent sur le dysfonctionnement mitochondrial et la pathologie comme un mécanisme potentiel pour la neuropathie diabétique, la perte sensorielle associée diabète28,29,30,31 ,32,,33. L’hypothèse est que le diabète altère la distribution des mitochondries dans les projections sensorielles de terminaison nerveuse cutanée. Par conséquent, il a développé une technique pour visualiser et quantifier les mitochondries dans les fibres de nerf intra-épidermiques (IENFs), l’extrémité distale de la racine dorsale ganglion afférences sensorielles. La technique combine immunohistochimie de fluorescence spécifique mitochondriale et étiquettes de fibres nerveuses avec acquisition de série z microscopie confocale de signaux avec logiciel d’analyse d’image 3D puissant pour mesurer la distribution du nerf spécifiques mitochondries des biopsies punch cutanée humaine pour atteindre cet objectif.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

punch biopsies de la peau ont été extraites des sujets qui ont été recrutés dans un réseau de grands soins primaires communautaires au centre du diabète de l’Université de l’Utah (Salt Lake City, Utah). Cette étude a été approuvée par l’Université du Michigan Institutional Review Board et respecter les principes de la déclaration d’Helsinki. Écrit le consentement éclairé a été obtenu auprès de chaque personne concernée avant le test.

1. immunohistochimie fluorescence

  1. biopsies punch Prepare pour immunohistochemistry fibre nerveuse intra-épidermiques :
    1. peau 3 mm effectuer des biopsies par medical personnel et placer la biopsie toute à 1.5 mL Zamboni ' solution de fixation s (paraformaldéhyde à 2 %, 0,3 % saturé d’acide picrique dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS), pH 7,4) à 4 ° C du jour au lendemain.
    2. Rincer avec une solution de sucrose à 30 % des échantillons dans du PBS à 4 ° C pendant 16 à 24 heures ou jusqu'à ce que l’échantillon coule.
      3. Composé de
    3. Embed échantillons à la température de coupe optimale (OCT) à l’aide d’un cryomold. Placer la biopsie ensemble 3 mm avec l’épiderme vers le bas dans le moule et remplir le moule avec environ 2 mL de gel octobre le moule sur glace pilée. Magasin à-80 ° C jusqu'à utilisation.
    4. Couper 50 µm d’épaisseur cross sections à l’aide d’un cryostat et stocker dans les puits d’une plaque 96 puits à l’aide de 180 µL de solution de stockage antigel / puits (30 % d’éthylène glycol, 30 % de glycérol dans du PBS). Les indications ci-dessous sont pour 8 puits d’une plaque 96 puits. Détachant des sections de chaque site de la biopsie qui sont 200 à 300 µm de l’autre.

jour 1 :

  1. étancher non spécifiques d’étiquetage du stratum corneum :
    1. Label 96 puits plaque tel qu’illustré à la Figure 1.
    2. Pipette 150 µL de solution de renforceur de signal stock afin de réduire la liaison non spécifique de l’anticorps secondaire 34 , 35 dans chaque puits. Transfert des sections dans la solution de renforceur de signal à l’aide d’une boucle d’inoculer.
      Remarque : prendre soin tout en travaillant avec les tissus pour éviter d’endommager ou de déchirer les coupes de tissus. Garder en signal enhancer solution pendant 30 minutes à température ambiante sur un rocker plat.
    3. Rinçage Prepare des puits dans les rangées 2 et 3 de la plaque à 96 puits en ajoutant 150 µL de 1 x en solution saline tamponnée au phosphate (PBS) dans chaque puits.
    4. Transvaser avec soin les sections dans la rangée 2 et rincer dans du PBS 1 x pendant 10 min à température ambiante.
    5. Rinçage une seconde fois dans du PBS 1 x pendant 10 min à température ambiante (ligne 3).
  2. Préparer 5 % sérum d’albumine bovine (BSA) bloquant la solution :
    1. préparer 5 bloquant la solution qui contient 5 % de BSA et 0,3 % Triton X 100-TX-100 à 0,1 M PBS (voir tableau 1), tandis que les sections sont en incubation dans solution de renforceur de signal. BSA ne va pas facilement dans la solution. Solution de Vortex jusqu'à ce que le BSA se dissout complètement.
    2. Préparer les puits bloquants au 4ème rang de la plaque de 96 puits en ajoutant 150 µL de 5 % de BSA bloquant la solution dans chaque puits.
    3. Transfert de sections dans les puits individuels de 5 % de BSA bloquant la solution et incuber des sections de 5 % de BSA bloquant la solution pendant 1-2 h à température ambiante sur un rocker plat.
  3. Préparer 1 % BSA rincer la solution et dilution des anticorps primaires :
    1. Prepare 1 % solution de rinçage contenant 1 % de BSA et 0,3 % TX-100 en 0,1 M PBS (voir tableau 2), tandis que les sections sont incubation dans une solution 5 % BSA blocage. BSA ne va pas facilement dans la solution. Solution de Vortex jusqu'à ce que le BSA se dissout complètement.
    2. Diluer les anticorps primaires dans la solution de rinçage de BSA 1 % tandis que les sections sont en incubation dans une solution 5 % BSA blocage.
      1. Faire 1 500 µL de solution d’anticorps primaire et ajouter à chaque bien dans le rang 5.
      2. Diluer l’anticorps primaires : utiliser l’étiquette nerveuses spécifiques, produit de gène de la anti-protéine polyclonal de lapin 9,5 (PGP9.5) à 1:1, 000. Utiliser le label de mitochondries spécifiques, souris des anticorps de E2/E3bp anticorps monoclonal anti-pyruvate déshydrogénase (PDH) au 1/100 à 1 % de BSA solution de rinçage.
  4. Prepare anticorps primaire :
    1. pipette 150 µL d’anticorps primaire dans chaque bien en rang 5 de la plaque à 96 puits.
    2. à l’aide de l’outil de la boucle, transférer des sections de la solution de saturation (rang 4) dans la rangée 5 contenant l’anticorps primaire.
    3. Envelopper la plaque étroitement avec parafilm pour l’empêcher de se dessécher.
    4. Placer les échantillons sur un rocker plat à température ambiante pendant 1 h et puis incuber les échantillons à 4 ºC sur un rocker plat du jour au lendemain.

jour 2 :

  1. rincer les échantillons :
    1. puits rinçage Prepare dans les lignes 6, 7 et 8 de la plaque de 96 puits en ajoutant 150 µL de BSA 1 %, solution de rinçage dans chaque puits.
    2. Transfert de sections dans la première solution de rinçage BSA à 1 % (ligne 6) et incuber pendant 1 heure à température ambiante. Répéter deux fois plus en incubant des sections de BSA 1 %, solution de rinçage dans les rangées 7 et 8 pour chaque 1 h à température ambiante rinçages.
  2. Diluer l’anticorps secondaires chez BSA 1 %, solution de rinçage :
    1. faire 1 500 µL de solution d’anticorps secondaire tandis que les sections sont en incubation dans le dernier rinçage de 1 % de BSA rinçage solution (ligne 8).
    2. Diluer l’anticorps secondaires : pour PGP9.5 (anticorps de anti-lapin chèvre conjugué fluorescent vert, 1/1000), pour PDH (rouge fluorescent conjugués chèvre anti-souris, 1:1, 000) BSA 1 %, solution de rinçage.
  3. Prepare anticorps secondaire :
    1. pipette 150 µL d’anticorps secondaire en ligne 9 de la plaque à 96 puits.
    2. Transférer doucement les sections de 1 % de BSA rinçage solution (ligne 8) dans les puits de l’anticorps secondaire (ligne 9).
    3. Using parafilm, enrouler la plaque étroitement pour l’empêcher de se dessécher. Recouvrir de papier d’aluminium. Placer les échantillons sur un rocker plat à température ambiante pendant 1 h et puis incuber les échantillons à 4 ° c sur un rocker plat du jour au lendemain.

jour 3 :

  1. Prepare nettoyer 1 x PBS en filtrant à travers un filtre de 0,22 µm :
    1. pipette 150 µL de filtré solution 1 PBS x dans la ligne 10, 11 et 12.
    2. Transfert des échantillons à la ligne 10 et rincer dans 1 x PBS pendant 1 h à température ambiante. Couvrir la plaque 96 puits avec du papier aluminium et placer sur un rocker plat pendant le rinçage. Répétez filtrée 1 x rinçage PBS deux fois plus pour chacune 1 h à température ambiante dans les rangées 11 et 12.
  2. Préparer des lames de microscope pour le montage des sections de tissu :
    1. Place 50 µL de filtration 1 x PBS sur une diapositive.
    2. Section de transfert de PBS 1 x (ligne 12) dans le 50 µL drop. Placez soigneusement la section dans le menu déroulant de PBS de déplier le tissu et aplatissant délicatement sur la lame de verre. Enlever l’excès PBS avec une pipette de verre pour éviter la dilution du réactif de montage. Ne touchez pas les sections avec l’ampoule de verre.
    3. Pipette 1 - 2 gouttes de réactif montage contenant DAPI directement sur le dessus de la section sur la glissière de microscope à l’aide de soins ne pas déranger l’orientation de la section. Placez délicatement une lamelle de verre 50 mm x 24 mm #1.5 microscope sur la mèche.
    4. Effacer les bulles d’air forment en plaçant la lamelle et essuyer le liquide en excès sur les bords de la lamelle. Préparer une nouvelle diapositive et répéter le pr montageprocessus pour chaque section.
    5. Cure/sec les supports de montage en plaçant les diapositives dans la sombre nuit à température ambiante. Transférer les lames à 4 ° C à court terme (1 à 2 semaines) ou à-20 ° C pour un stockage à long terme (plu de 2 semaines).
      NOTE : Les contrôles négatifs omis des anticorps primaires pour PGP9.5 ou PDH dans étape 1.4.2.2 et n’affichent aucun étiquetage distinguables des nerfs ou des mitochondries dans l’épiderme. Positive, les contrôles ont été effectués pour la PDH anticorps pour le prouver étiquettes toutes les mitochondries (données non présentées). Les contrôles positifs ont été réalisés sur les neurones des ganglions de la racine dorsale cultivés de souris primaire qui étaient transduites avec un baculovirus aux mitochondries étiquette avec un signal de la protéine fluorescente verte (GFP) et ensuite fixés et colorés avec l’anticorps PDH et rouge fluorescent anticorps secondaire. Toutes les mitochondries qui exprimaient la GFP ont été conjointement étiquetés avec l’étiquette rouge pour immunohistochemistry PDH (données non présentées).

2. Imagerie confocale

  1. effectuer l’imagerie confocale :
    1. collecter des images à l’aide d’un laser scanning microscope confocal avec un 40 X objectif immersion dans l’huile (ouverture numérique 1,25 (N.A.)) sur un microscope inversé.
      1. Dans chaque plan focal séquentiellement acquérir des signaux fluorescents :
        noyaux : λ excitation = 405 nm, émission spectrale filtre λ = 420-480 nm
        des fibres nerveuses : excitation λ = 488 nm, émission spectrale filtre λ = 505-560 nm
        Mitoch Ondria : excitation λ = 543 nm, émission spectrale filtre λ = 606-670 nm
    2. entrer les paramètres suivants de la numérisation dans le logiciel de microscope : vitesse de balayage de 600 Hz avec cadre en moyenne 2 et le zoom de 2,2 ; résolution de 12 bits intensité (4096 gris niveaux).
      1. Définie le logiciel microscope pour résolution latérale optimisée (résolution de numérisation = 1 024 x 1 024) et sectionnant la résolution optique/axial (ouverture confocal = 1 unité aérée (UA) avec volume de z-étape de 210 nm).
        Remarque : La résolution XYZ qui en résulte est 172,2 nm x 172,2 nm x 210 nm, avec une taille d’image de 176,1 µm x 176,1 µm x 30 à 50 µm.
    3. Activer un balayage direct pour le signal de nerf (vert-fluorescence) et régler la commande de mise au point z pour trouver et mettre la partie supérieure et abaissez les plans focaux dans le logiciel de microscope qui englobent le signal nerveux au sein de la section de tissu. Z-variation totale est généralement de 30 à 50 µm pour une section de tissu de 50 µm.
    4. Faire pivoter le champ de balayage avec le logiciel de microscope pendant un balayage direct afin que l’épiderme est positionné horizontalement ou verticalement dans l’image.
    5. Analyser chaque signal séparément et régler le détecteur (tube photomultiplicateur, PMT) tension et offset pour minimiser ou supprimer toute au-dessus et sous pixel saturé.
      NOTE : Temps de balayage avec les paramètres ci-dessus prennent environ 20 à 40 min selon le nombre de tranches de z.

3. 3D de visualisation et d’analyse des mitochondries dans les fibres nerveuses humaines intra-épidermiques

  1. isoler l’épiderme 3D :
    1. Dupliquer l’image d’origine et utiliser l’intensité maximale projection (étendu en vue de la mise au point) de l’image pour identifier et isoler l’épiderme.
    2. Utiliser une région de l’outil d’intérêt à la trace le long des bords supérieurs et inférieurs de l’épiderme pour éliminer les zones non désirées telles que la couche cornée et le derme qui sont absents des fibres nerveuses intra-épidermiques. Récolte à cette sélection.
  2. Déconvolution d’utilisation sur le nerf et les signaux fluorescents mitochondriales :
    Remarque : déconvolution contribue à rétablir l’intégrité des signaux fluorescents. La restauration utilisée dans le présent protocole est appelée déconvolution aveugle parce qu’il utilise les signaux fluorescents dans les images pour déterminer combien les signaux propagé à partir de leur source d’origine (point spread function). Le processus améliore la résolution du signal en réassignant le signal de se propager dans son emplacement d’origine.
    1. Calculer un point répandre fonction (PSF) pour le signal vert fluorescent nerf (fluorescence verte) avec les paramètres suivants :
      1. la valeur calculée de PSF confocale. La valeur moyenne indice de réfraction 1,515 et numérique ouverture à 1,25. Affectez à sténopé détecteur 1 unité aérée (U.A.). Longueur d’onde de laser Set excitation à 488 longueur d’onde, nm et d’émission, à 515 nm.
    2. Calculer un PSF pour le signal mitochondrial fluorescent rouge (rouge-fluorescence) avec les paramètres suivants :
      1. calculée PSF à confocale. La valeur moyenne indice de réfraction 1,515 et numérique ouverture à 1,25. La valeur sténopé détecteur 1 UA. Longueur d’onde de laser Set excitation 543 longueur d’onde, nm et émission, à 617 nm.
    3. Optimiser les signaux fluorescents nerveuses et des mitochondries par déconvolution utilisant le PSF correspondantes indiquées ci-dessus et la fonctionnalité de restauration itératif fixé à 100 % de confiance et une limite de 10 cycles d’itération.
  3. Créer des surfaces nerveuses spécifiques :
    1. utiliser le " créer surface " outil pour rendre une surface solide des nerfs de la deconvolved vert fluorescent secondaire étiquetage de le PGP9.5 identifié nerfs.
    2. Décochez la " lisse " en vedette et utiliser la fonction de l’intensité absolue pour régler le seuil pour le signal nerveux car il est beaucoup plus lumineux que la fluorescence de fond.
    3. Permet de définir le seuil pour le signal nerveux car il est beaucoup plus lumineux que la fluorescence de fond la fonction de l’intensité absolue. La valeur seuil assez bas pour identifier avec précision les nerfs.
    4. Filtre les surfaces petites, non-nerf selon la taille.
      Remarque : Si nécessaire, modifiez manuellement sur des surfaces non-nerf supplémentaires au sein de la " édition " onglet en maintenant la touche Ctrl pour sélectionner plusieurs objets et ensuite de les supprimer avec la touche Suppr.
  4. Isolat signal mitochondrial fluorescent nerveuses spécifiques :
    1. Sélectionnez l’onglet édition de la surface de nerf pour afficher la " propriétés de masque " caractéristique. La surface du nerf créée aux étapes 3.3 est utilisée pour isoler des mitochondries dans les nerfs de signaux mitochondriales associés avec les kératinocytes.
    2. Comme le " masque tous les ' bouton ouvre un " canal masque " fenêtre, choisissez le signal fluorescent rouge deconvolved dans le menu déroulant le menu sous " sélection de canal " pour le signal mitochondrial.
    3. Cliquez dans la zone de mettre une coche dans la " en double canal avant d’appliquer le masque " option.
    4. Cliquez sur la radio bouton en face de la " constante à l’intérieur/extérieur " option des paramètres du masque et cliquez dans la zone de mettre une coche dans la " Set voxel en dehors de la surface à " option et tapez 0,00 pour la valeur. Le bouton cliquez sur OK pour créer la nouvelle chaîne qui représente des signaux mitochondriales dans la surface de nerf.
  5. Créer des surfaces spécifiques mitochondries :
    1. emploi la " créer surface " outil pour réaliser une surface solide des mitochondries du canal fluorescent nouvellement créé des signaux mitochondriales nerveuses spécifiques de les étapes 3,4.
    2. Décochez la " lisse " en vedette, puis sélectionnez la " soustraction de fond " fonction pour régler le seuil. Cette fonctionnalité utilise le contraste local autour du signal mitochondrial pour identifier les mitochondries des fond.
    3. Set seuil assez bas pour identifier avec précision les mitochondries. Dans cet exemple, le seuil a été fixé à 2 000 pour une échelle de 16 bits (65 536).
    4. Filtre mitochondriales surfaces selon la taille. Dans cet exemple, que la limite de voxel a été fixée à 1,0 voxels, qui est le plus bas limiter le possible. Si nécessaire, modifiez manuellement les surfaces non-mitochondries dans la " édition " onglet en maintenant la touche Ctrl pour sélectionner plusieurs objets et ensuite de les supprimer avec la touche Suppr.
      Remarque : Parfois, le logiciel créera des surfaces qui ne sont pas associés avec un signal mitochondrial fluorescent distinguable. Dans ces cas, il est possible de les enlever avec la " édition " Tab
  6. Exportation et calculer les valeurs morphométriques pour analyse :
    1. exporter des valeurs de nerf et surfaces mitochondriales de la " statistique " onglet pour une analyse ultérieure avec le logiciel de chiffrier électronique.
    2. Exporter les valeurs de volume pour le nerf et surfaces mitochondriales.
    3. Compter le nombre de fibres nerveuses individuelles présents dans chaque image et enregistrez la valeur dans la feuille de calcul électronique.
    4. Pour chaque image, calculer les valeurs possibles suivantes pour l’analyse de la feuille de calcul électronique :
      1. somme les volumes pour toutes les surfaces de nerf.
      2. Filtre les surfaces mitochondriales nerveuses spécifiques sous un volume de moins de 0,02 µm 3 et bin les surfaces de taille. Par exemple, utiliser des emplacements tels que 0,02 - 0,04 0,04 - 0,08 0,08 - 0,16, 0,16 - 0,32, 0,32 - 0,64, 0,64 - 1,28, 1,28-2,56, supérieure à 2,56 µm 3.
        Remarque : La limite inférieure du volume mitochondrial a été mises à 0,02 µm 3 basée sur les volumes déjà publiés de mitonchodria 36 , 37 , 38.
      3. Compter le nombre de surfaces mitochondriales nerveuses spécifiques au sein de chaque emplacement et le nombre total de surfaces sur les bacs (0,02 - supérieur à 2,56 µm 3).
      4. Calculer la proportion des surfaces mitochondriales nerveuses spécifiques dans chaque emplacement. Utiliser le compte par bac divisé par le nombre total des surfaces de mitochondries.
      5. La somme des volumes pour toutes les surfaces mitochondriales nerveuses spécifiques.
      6. Calculer la proportion de nerf avec signal mitochondriale en divisant le volume de surface total de nerf par la somme de tous les volumes de surface mitochondriales.
      7. Calculer le nombre de mitochondries par volume de nerf en divisant le volume de surface total de nerf par le comte de toutes les surfaces mitochondriales.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Visualisation et la quantification des mitochondries dans les IENFs humaines

Fluorescence immunohistochimie permet l’étiquetage simultanée de signaux multiples dans les biopsies de la peau humaine pour visualiser les nerfs, les mitochondries et les noyaux. Une plaque à 96 puits constitue un moyen pratique d’organiser les étapes de la procédure de l’immunohistochimie. La figure 1 mon...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce protocole est conçu pour isoler, de quantifier et d’analyser la taille et la distribution des mitochondries nerveuses spécifiques au sein de la IENFs en 3D de biopsies de la peau humaine. Il y a plusieurs étapes cruciales dans le protocole. L’immunohistochimie de fluorescence flottant est conçu pour souiller et analyser des signaux multiples dans chaque échantillon, fournissant une méthodologie plus souple pour la recherche exploratoire44,45. Cette procédure p...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aucun conflit d’intérêts à déclarer.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce travail a été soutenu par les instituts nationaux de santé subventions K08 NS061039-01A2, le programme de recherche de neurologie & découverte et l’a. Alfred Taubman Medical Research Institute à l’Université du Michigan. Ce travail a utilisé la morphologie et l’Image analyse Core du Michigan Diabetes Research Center, financé par les instituts nationaux de santé subvention 5P 90 DK-20572 du National Institute of Diabetes et digestives et les maladies des reins. Les auteurs tiens à remercier J. Robinson Singleton et A. Gordon Smith (Université de l’Utah) pour leur généreux don d’échantillons de peau humaine.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
2 % Zamboni’s FixativeNewcomer Supply, Middleton, WI  ;1459A2 % de paraformaldéhyde, 0,2 % d’acide picrique saturé dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS), pH 7,4
10x solution saline tamponnée au phosphate (PBS)  ;Fisher Scientific, Pittsburgh, PABP399-4Pour constituer 1x PBS
Image-iT FX Signal EnhancerThermoFisher Scientific, Waltham, MassachusettsI36933améliore les signaux de colorant Alexa Fluor en réduisant la liaison non spécifique
Produit génique anti-protéine 9.5 Anticorps (polyclonal de lapin)Proteintech Group Inc. Rosemont, IL14730-1-APabrégé en PGP9.5, remplace AbD Serotec (Cat. N° 7863-0504) anticorps
anti-pyruvate déshydrogénase E2/E3bp Anticorps (monoclonal de souris)abcam, Cambridge, MAab110333abrégé en PDH
Chèvre anti-souris Anticorps secondaire Alexa Fluor 594 conjuguéThermoFisher Scientific, Waltham, MassachusettsA-11034rouge fluorescent conjugué secondaireanticorps
Chèvre anti-lapin Anticorps secondaire Alexa Fluor 488 conjuguéThermoFisher Scientific, Waltham, MassachusettsA-11032Albumine secondaire conjuguée verte-fluorescente
partir de sérum bovinSigma-Aldrich, St. Louis, MOA7906-100abrégée en BSA
Triton X-100Sigma-Aldrich, St. Louis, MOT9284abrégée en TX-100
0.22 µ ; m FiltreEMD Millipore, Billerica
MA		MILLEX GP SLGP 033NS0.22 µ ; m Filtre Millipore
Parafilm MFisher Scientific, Pittsburgh, PA13-374-10Curwood Wisconsin LLC Parafilm M (PM-996)
Boucle non calibréeFisher Scientific, Pittsburgh, PA22-032092inoculation Loop par Decon LeLoop (MP 199-25)
Plaque de dosage à 96 puitsCorning Incorporated, Corning, NY3603Plaque à fond plat à 96 puits
Réactif anti-décoloration Prolong Gold avec DAPIThermoFisher Scientific, Waltham, MassachusettsP-36931Coloration DAPI des noyaux
Couvercle de microscope Verre 50 x 24 mmFisher Scientific, Pittsburgh, PA12-544ELames de
microscope Superfrost Plus FisherScientific, Pittsburgh, PA12-550-15Lames de microscope
Leica SP5 Microscope confocal à balayage laserLeica Microsystems, Buffalo Grove, ILSP5Microscope confocal
Volocity x64 Logiciel  ;Perkin Elmer, Waltham , MAversion 4.4.0Le logiciel Volocity est utilisé pour les étapes 3.1 et 3.2 dans le protocole de traitement d’image
Imaris x64 Logiciel d’analyse tridimensionnelleBitplane, Concord, MAversion 7.7.1Le logiciel Imaris est utilisé pour les étapes 3.3 à 3.5 dans le protocole d’analyse d’images
ExcelMicrosoft, Redmond, WAversion Office 2013Un tableur Excel est utilisé pour l’étape 3.6 du protocole afin de résumer les caractéristiques morphométriques
Optimum Cutting Temperature CompoundSakura Finetek USA, Inc., Torrance, CA4583abrégé en OCT
Leica CryostatLeica Biosystems, Buffalo Grove, ILCM1850Cryostat pour la coupe 50 µ ; Sections m
CellLight Mitochondries-GFP, BacMam 2.0ThermoFisher Scientific, Waltham, MassachusettsC10600Utilisé comme contrôle positif pour marquer les mitochondries avec un signal fluorescent vert
à

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