Une méthode pour Lineage Tracing de cellules de la cornée Utilisation du Multi-couleurs Souris rapporteur fluorescent

Résumé

Dans cet article, nous décrivons les principes de conception et de réalisation d’une expérience de traçage de lignage multicolore à l’aide de souris R26R-Confetti. Nous fournissons un protocole spécifique pour le suivi des cellules épithéliales cornéennes qui peuvent être modifiées pour d’autres tissus d’intérêt.

Résumé

Les expériences de traçage de lignées définissent l’origine, le destin et le comportement des cellules d’un tissu ou d’un organisme spécifique. Cette technique a été appliquée avec succès pendant de nombreuses décennies, révélant des découvertes fondamentales en biologie du développement. Plus récemment, il a été adopté par les biologistes des cellules souches pour identifier et suivre différentes populations de cellules souches avec une intervention expérimentale minimale. Les développements récents de la génétique de la souris, la disponibilité d’un grand nombre de souches de souris et les progrès de la microscopie fluorescente permettent de concevoir facilement de puissants systèmes de traçage de lignées pour divers tissus avec une expertise de base, à l’aide d’outils disponibles dans le commerce. Nous avons récemment tiré parti de cette puissante méthodologie pour explorer l’origine et le devenir des cellules souches à la surface de l’œil à l’aide de souris R26R-Confetti. Ce modèle propose un système génétique multicolore, pour l’expression de 4 gènes fluorescents de manière aléatoire. Nous décrivons ici les principes de cette méthodologie et fournissons un protocole adaptable pour la conception d’expériences de traçage de lignées ; spécifiquement pour l’épithélium cornéen ainsi que pour d’autres tissus.

Introduction

Pendant le développement embryonnaire, le tissu et la morphogenèse d'organes ont lieu grâce à un programme précis qui peut être décrite en termes de prolifération cellulaire, la migration cellulaire et la spécification de la lignée ^1-4. Ces processus biologiques sont également impliqués dans le maintien de l'homéostasie tissulaire adulte, qui nécessite endiguer la régénération cellulaire. Le traçage de Lineage, l'identification et le suivi de la descendance d'un type spécifique de la population de la cellule, fournit un outil important pour l'étude de l'embryogenèse et l'homéostasie des cellules souches. En effet, il est de plus en plus utilisé dans de nombreux domaines de la recherche. En particulier, la lignée traçage est devenu un outil essentiel dans identifier l'origine et le destin des cellules souches dans l'homéostasie et le développement du cancer. En effet, il peut fournir des informations sur la façon essentielle la cellule se comporte dans le cadre de l'organisme ou tissu intact, avec intervention minimale d'expérimentation, à la différence de l'isolement des cellules en culture et in vitro ou transplantatisur risquant d'entraîner polarisation indésirable.

Traditionnellement, les colorants tels que liposoluble carbocyanine, qui intègrent dans la membrane plasmique des cellules, ont été utilisées pour la lignée de traçage. Bien que ces types d'expériences ont conduit à des découvertes majeures avec succès et de concepts séminales façonnés dans la biologie du développement ^5,6, ils présentent certaines limites, notamment la difficulté de contrôler la spécificité des cellules cibles, l'effet indésirable du colorant sur ​​le comportement des cellules et la dilution de l'étiquette dans le temps. Nucléotidiques approches d'étiquetage analogique ont permis de documenter l'existence de slow-vélo "label conservant cellules" qui correspondent vraisemblablement à quiescent cellules souches ^7,8. Toutefois, bien que cette technique pourrait démontrer la présence de cellules de cyclisme lente basé sur la cinétique de prolifération sur une période de temps limité, il ne pouvait pas fournir des indications importantes en ce qui concerne la fonctionnalité des cellules souches. Un optimale meth lignée de traçagedologie devrait minimiser l'effet de l'étiquetage sur les propriétés de la cellule marquée, ses descendants ou ses voisins. En outre, il serait bénéfique d'avoir le contrôle sur l'induction de l'étiquetage, à savoir, d'avoir la possibilité de marquer la population de cellules d'intérêt à un stade et d'une manière dépendant du temps ainsi que dans une seule cellule (clonale) manière. Procédé de marquage irréversible et stable qui est transmis à toute la descendance de la cellule fondateur est important de sorte que l'étiquette serait maintenue dans le temps, et pas transféré aux cellules voisines.

Plus récemment, des approches génétiques de marquage des cellules ont été développées. Dans ces systèmes, des promoteurs spécifiques de cellules peuvent être utilisés pour déclencher la recombinase Cre expression afin d'éliminer un barrage-loxP flanquée et permettre l'expression des gènes rapporteurs tels que la protéine fluorescente verte ou Β-galactosidase gènes rapporteurs ^9-13. Cette approche permet non seulement le suivi des cellules et de leur progéniture, mais permet également de cellule estolation et caractérisation moléculaire. Suivi de cellule au niveau de la cellule unique est devenu possible grâce à l'induction de l'expression d'un seul gène rapporteur fluorescent. Une limitation importante de ce système est le fait que lorsque seulement une très faible pourcentage de cellules est marqué, il est possible de séparer et de tracer des clones individuels. Pour surmonter cette limitation reporters multicolores peuvent être utilisés. Lors de l'utilisation étiquetage multicolore, le suivi du sort différentielle des cellules voisines dans le même créneau peut être réalisé efficacement ^14-17. Récemment, une variété de Brainbow (Br) allèles ont été développés pour les expériences de la lignée de traçage, ce qui permet une expression de multiples gènes stochastiques reporter fluorescentes en utilisant le / lox système Cre. Le système Cre / lox comprend la recombinase Cre enzyme, qui reconnaît et se lie à des séquences d'ADN spécifiques tels que des sites loxP. Après la liaison de la recombinase Cre, recombinaison site spécifique se produit, ce qui provoque l'élimination des séquences loxP flanquée resulting dans l'expression aléatoire des différentes protéines fluorescentes (le mécanisme est décrit ci-dessous). Une variété de lignes Br sont disponibles pour l'utilisation (voir les commentaires ^16,18,19). Les principales différences entre les souches Br comprennent (i) des différences dans le nombre de gènes fluorescents inclus dans la cassette, allant de 2 (Br 2.0), 3 (Br1.0) à 4 (Br1.1, Br2.1) gènes fluorescents , (ii) la présence de sites lox réciproquement orientés pour permettre l'inversion de gène (Br2.0-2.1), (iii) le type de sites lox utilisées, et (iv) l'expression ou de silence de l'expression du gène fluorescent avant l'activation Cre. Le Br3 récemment établi propose un procédé amélioré de formation d'image multicolore des neurones. Une des principales caractéristiques de cette transcription est qu'il contient un nouvel ensemble de protéines photostables farnésylées fluorescentes, qui permettent à une coloration, même de la plus belle neuronal traite ^20.

Surtout, les différentes versions de cassettes Br peuvent contenir spécifique neuronale Thy1 promoter ou exprimée de manière ubiquitaire CAG (CMV). Enfin, alors que certains des souris transgéniques Br peut contenir un seul transgène Br, d'autres peuvent consister en de multiples copies du transgène, ce qui permet la production d'un nombre immense de possibilités de combinaisons de couleurs pour être exprimé dans chaque cellule (voir par exemple ^16).

Dans notre étude, nous avons utilisé la souris R26R-Confetti qui contient la cassette de ²¹ Br 2.1. Br2.1 est spécialement conçu pour permettre à des inversions de l'ADN Cre-médiation et non seulement des excisions en raison de l'orientation réciproque des sites loxP (Figure 1). Ainsi, ces événements inversion / excision qui conduisent à changement de couleur peuvent continuer aussi longtemps que Cre est présente ^16. Pour cette raison, un système d'expression inductible Cre temporelle est essentielle pour le suivi cellulaire fiable à l'aide Br2.1. Comme le montre la Figure. 1, le Br2.1 contient un promoteur CAG omniprésente suivie par loxP flanquée Neo ^R -casseTTE, qui agit comme un barrage routier de la transcription, qui est suivie par 4 gènes rapporteurs fluorescents, l'encodage pour verte (GFP), jaune (YFP), rouge (RFP) et cyan (CFP) des protéines fluorescentes, positionnés dans deux tandems. Pas de fluorescence est exprimé avant l'activation Cre. L'induction de la recombinase Cre provoque le retrait de la cassette néo-R permettant l'expression statistique de l'une des protéines fluorescentes 4 dans une cellule donnée. Le premier segment contient GFP-loxP flanquée et une YFP inversée, tandis que le second segment contient DP-loxP flanquée et un PCP inversée. Ces segments d'ADN peuvent être inversés en continu (en utilisant loxP qui est en orientation inverse), ou excisés, aussi longtemps que la recombinase Cre est présente. Par conséquent, un transgène Cre transitoire et contrôlée doit être utilisé. La cassette Br2.1 fournit un excellent système pour distinguer entre les émissions se chevauchent sur l'emplacement de signal: l'expression de la YFP et RFP est cytoplasmique, la GFP est nucléaire et la PCP est lié à la membrane cellulaire. GFPet les émissions DP sont facilement séparés par microscopie à fluorescence conventionnelle. Afin de séparer les émissions YFP / GFP / PCP, un système d'imagerie confocale spectrale est nécessaire. Au total, la cassette Br2.1 permet l'expression spécifique aléatoire, inductible, et le tissu d'un sur quatre gènes fluorescents distincts dans chaque cellule ciblée. En fait, quand un plus grand nombre de combinaisons de couleurs est nécessaire, on peut générer des souris homozygotes contenant 2 allèles de Br2.1, conduisant ainsi à l'expression de 2 étiquettes de couleur pour chaque cellule et dans l'augmentation du nombre de combinaisons possibles de couleurs à 10 ^22. Certaines des souches de souris Br permettre l'expression d'un plus grand nombre de combinaisons possibles de couleurs depuis de multiples copies de la cassette ont été intégrées dans leur génome ^16. Cependant, dans la plupart des cas, les quatre combinaisons de couleurs fournis par un seul allèle Br2.1 sont suffisantes. Après le protocole fourni ici, on peut établir cette méthode en utilisant une configuration relativement simple de spectral microscopie avec peu ou pas de nécessité d'un étalonnage.

Ici, nous fournissons un protocole adaptable pour l'utilisation de la souris R26R-confettis qui contiennent un seul allèle Br2.1, de la lignée de traçage expériences de l'épithélium cornéen. Cette souche de souris transgénique a été utilisé pour étudier l'origine et le devenir du côlon ^21,23 et des cellules souches epitheliales cornéennes ^22,24, la présence d'une activité de cellules souches dans le cancer intestinal ^25, et pour la caractérisation de rein podocytes dans glomérulosclérose segmentaire et focale (FSGS) ^17.

Protocole

Déclaration éthique: Dans ce soin des animaux de l'étude et l'utilisation ont été conforme à la Déclaration ARVO pour l'utilisation d'animaux dans ophtalmique et Vision Research. Toutes les expériences ont été approuvés par le comité d'éthique local.

1. Choisissez une recombinase Cre Convient Exprimant souris de souche

1. Rupture de la grande variété de lignées transgéniques Cre disponibles à l'achat ²⁶ et selon le tissu cible à étudier, pour choisir une souche de souris transgénique Cre dans laquelle le gène de la recombinase Cre est contrôlée par un promoteur qui est spécifique pour le tissu d'intérêt. En cas de contrôle temporel est nécessaire, choisissez une ligne Cre inductible.
   Note: Nous avons choisi le inductible transgène Cre-K14 tamoxifène ^ERT d'étiqueter spécifiquement les cellules souches / progénitrices épithéliales limbiques et la cornée ^24. Notez qu'il peut y avoir des différences entre les souches, comme Di Girolamo et ses collègues ont signalé la spécificité limbique sans expression de la cornée pour leur K14-Cre ^{ERT 22.} Un avantage à l'utilisation de souris transgéniques inductibles Cre est qu'il permet l'induction de la lignée de traçage à des délais polyvalents.

2. Choisissez un Convient Strain Br souris

1. Choisissez la cassette Br appropriée en fonction de la question de recherche et disponible en ligne Cre ^16,18,20.
   1. Si une souche non-inductible Cre souris est utilisée, choisissez une cassette Br qui ne permet pas continues ADN inversions / excisions et donc donner naissance à des produits de dead-end (par exemple Br1.0 ou Br1.1) ^16.

3. Traverser les lignées transgéniques d'intérêt

1. Pour le protocole illustré ici, traverser la souche homozygote R26R-Confetti (Br2.1 / Br2.1) avec la souche homozygote Cre ^ERT (Cre ^ERT / Cre ^ERT) pour obtenir descendants hémizygotes (Br2.1 / +; Cre / +) qui sont prêts à mono-allélique lignée de traçage car ils contiennent tous un seul allèle Br2.1 et unseul allèle Cre.
   Remarque: Pour augmenter l'efficacité de l'étiquetage, on pourrait générer des souris qui contiennent deux allèles (CRE Br2.1 / +; Cre / Cre), tandis que deux allèles Br2.1 (Br2.1 / Br2.1; Cre / +) serait augmenter combinaisons de couleurs (comme détaillé dans ^22).

Induction 4. recombinase Cre

Remarque: L'administration de tamoxifène dans ces expériences a été effectuée par injection intraperitoneale tous les jours, pendant la durée de 3-4 jours, afin d'induire la translocation de Cre recombinase ^ERT dans le noyau de la cornée limbique et tige de base positif K14 / progénitrices cellules épithéliales. Le protocole suivant peut être utilisé pour l'injection de quatre souris. En variante, l'application topique de tamoxifène à la surface oculaire donne un rendement plus élevé. La solution Tamoxifen peut être conservé dans l'obscurité à 4 ° C pendant jusqu'à une semaine. Chauffez la solution avant de l'utiliser.

1. Peser 100 mg de tamoxifène et le dissoudre dans 5 ml d'huile de maïs àformer un / ml solution tamoxifène 20 mg.
2. Injecter 200 ul de tamoxifène (4 mg) à une solution par voie intraperitoneale des souris âgées de 8 semaines pendant 3-4 jours consécutifs.
   Remarque: La solution Tamoxifen peut être conservé dans l'obscurité à 4 ° C pendant jusqu'à une semaine. Chauffez la solution avant de l'utiliser.
3. Pour une application topique: peser 60 mg de tamoxifène et le dissoudre dans 1 ml d'huile de maïs pour former une / ml solution de 60 mg de tamoxifène. Vortex et définir la solution dans un bain d'eau agité maintenu à 65 ° C jusqu'à ce qu'il devienne clair congé dans le bain jusqu'à utilisation.
   1. Appliquer soigneusement 100 ul de la solution de tamoxifène à chaque surface oculaire de la souris.

5. Préparation des tissus pour l'imagerie

1. Animaux de sacrifice en utilisant l'isoflurane (2% vaporisés en oxygène) anesthésie (confirmer anesthésie appropriée par l'absence de réflexes) suivie par _inhalation de CO 2 à des moments appropriés après l'injection tamoxifène et coltionner le tissu concerné.
   1. Pour ces expériences, énucléer yeux aux points de temps suivants: 1, 4, 8, 12, et 16 semaines après l'injection tamoxifène. Atteindre l'énucléation en utilisant pince courbe. Appuyez sur les paupières à l'origine du globe oculaire pour le faire sortir de l'orbite de l'œil. Placez la pince derrière le globe oculaire en maintenant le nerf optique. Tirez doucement sur le globe oculaire et le détacher.
      Note: A ce stade, comme décrit ci-dessous, les tissus peuvent être préparés pour l'analyse wholemount de cellules marquées. Sections de tissus congelés réguliers peuvent également être préparés, fixe en PFA et imagé comme décrit ci-dessous (voir la section 6 et ^22).
2. Placez chaque oeil dans une boîte de 60 mm rempli avec du PBS.
3. Sous un microscope stéréo à l'aide de forceps détiennent l'œil près du nerf optique avec la cornée vers le bas et utilisent un scalpel pour enlever le nerf optique, le muscle et le tissu conjonctif et de faire une petite incision dans la partie postérieure de l'œil.
4. Avec des ciseaux de printemps attentivement l'agrandircoupé en laissant la lentille pop et retirez l'iris en utilisant une pince.
5. Aplatir la cornée en faisant des incisions radiales 4-5 à partir du centre vers la périphérie à l'aide d'un scalpel.
6. Utiliser un scalpel pour couper les tissus périphériques excès au-delà du limbe.
7. Fixer des cornées en PFA 4% pendant 10 min, puis les laver rapidement avec du PBS.
8. Incuber les échantillons avec DAPI pendant 10 minutes et laver rapidement avec du PBS.
9. Cornées de montage sur des lames de verre avec le côté épithélial vers le haut. Déposer une goutte de milieu de montage sur le dessus de la cornée et de la couverture d'un couvercle en verre. Laissez sécher diapositives O / N en RT. Gardez diapositives à 4 ° C.

6. microscopie confocale et analyse d'imagerie

1. Utiliser un système de confocale spectrale qui permet la séparation des émissions YFP / GFP / PCP. Set excitation de fluorescence et de longueurs d'onde d'émission en fonction des protéines fluorescentes de la cassette Br. Choisissez la longueur d'onde d'excitation la plus appropriée pour chaque protéine visant à minimiser croixexcitation. Choisir les plages d'émission étroites afin de minimiser la fuite des signaux provenant des différentes protéines.
   1. Pour la cassette Br2.1, utilisez la commande suivante mise en place de l'excitation de fluorescence (ex) et d'émission (em) comme point de départ: DAPI - ex 405 nm / em 420-480 nm, PCP - ex 458 nm / em 470-500 nm, GFP - ex 488 nm / em 497-508 nm, YFP - ex 514 nm / em 529-540 nm, et RFP - ex 561 nm / em 575-615 nm.
2. Afin de visualiser les zones grandes de tissus à haute résolution, l'imagerie acquérir de tuiles. Pour les résultats présentés à la figure image de la totalité de la cornée par l'obtention d'une matrice de 12 x 12 images 2A-B, c.-à acquérir des champs 144 (512 x 512) à l'aide de 4 canaux fluorescents dans chaque champ. Au total, la collecte de 576 images, puis de fusionner.
3. Pour explorer la localisation de cellules marquées dans différentes profondeurs et les structures du tissu, acquérir des images Z-stack de différentes régions d'intérêt. Afin to l'image toute la profondeur de la cornée, acquérir 8 sections optiques à 3 pm intervalles. Les vues orthogonales des sections recueillies ainsi que des projections d'images sur la base des intensités maximales peuvent être construits en utilisant des logiciels d'imagerie conventionnelles ^24.

7. cornée blessures combinée avec le tamoxifène induction

1. Anesthésier la souris avec de l'isoflurane (2% vaporisé en oxygène) et d'administrer des analgésiques (10 mg / kg Carpofen, injection sous-cutanée). Confirmez anesthésie appropriée par l'absence de réponse à l'orteil-pincement.
2. Peser 1 g de poudre tamoxifène et le dissoudre dans 5 ml de DMSO stérile pour produire 200 mg / ml de solution de concentration.
3. Chauffez la solution tamoxifène à 65 ° C dans un bain d'eau jusqu'à ce que la solution devient limpide. Conserver la solution dans le bain jusqu'à l'utilisation.
4. Appliquer une pommade oculaire à l'oeil controlatéral non traitée pour éviter la déshydratation pendant l'anesthésie. Ne pas laisser un animal sans surveillance tant qu'il a retrouvé suffisamment conconscience de maintenir décubitus sternal. Ne retournez pas les souris qui avaient subi oeil blessant à la compagnie d'autres souris jusqu'à guérison complète. Souris doit être étroitement surveillée après la blessure. Dans le cas où ils perdent plus de 10% de leur poids corporel, souffrent de l'érosion de la cornée, ou de l'inconfort, l'expérience devrait être arrêtée. Répétez l'administration de tous les analgésiques de 24 heures tout au long de toute l'expérience.
5. Utiliser une seringue stérile, sans l'aiguille attachée à elle; 200 ul de solution appliquer tamoxifène par voie topique sur toute la surface de la cornée d'un œil de chaque souris.
   Remarque: Le liquide se solidifie rapidement la solution sur la surface de l'oeil à la température ambiante. L'effet de la lésion de la cornée dépend de la gravité de la blessure. Suite à une application de solution Tamoxifen / DMSO pas d'effets indésirables sont observés chez les souris. En cas d'applications répétées opacité de la cornée peut être observée.
6. Continuer avec la préparation des tissus et de l'imagerie (voir sections 5 et 6) à des moments pertinents. Pour les résultats présentés ici, le sacrifice des souris (comme détaillé dans l'étape 5.1) après la blessure d'une semaine (Figure 2 ^et 24).

Résultats

Récemment, nous avons cherché à identifier l'origine, la survie et la migration des cellules souches et les cellules progénitrices de l'épithélium cornéen ^24. L'accumulation des données prend en charge le dogme que l'épithélium cornéen est régénéré par cellules souches situées exclusivement dans la niche limbique, une zone en forme d'anneau à la périphérie de la cornée. Cette théorie est soutenue par in vitro et in vivo de données, et par des preuves cliniques qui a fourni la base de pionnier qui a réussi souches limbiques thérapie cellulaire ^27-29. Toutefois, ce sujet est resté très débattue dans les dernières années en raison d'une étude basée sur les expériences de greffage limbiques qui suggéraient que le limbe de la souris ne participe pas au renouvellement de la cornée ^30. Pour tester cette hypothèse intéressante, la lignée de traçage des expériences utilisant des souris R26R-Confetti ont été effectuées, à suivre le destin des cellules épithéliales souches / progénitrices limbiques et de la cornée sous conditions stables jusqu'à 120 ^jours 24.Les yeux ont été énucléés et plats de montage cornées ont été analysés par fluorescence confocale spectrale de microscopie à balayage laser 10 et 120 jours après l'injection tamoxifène. Comme prévu, les petites grappes sporadiques de cellules fluorescentes ont été observés tout au long de la surface oculaire 10 jours après l'injection, tandis que 1-4 mois plus tard (figure 2B et ^24), des stries allongées qui se prolongent à partir du limbe cornéen vers le centre développées lentement. Ce résultat suggère que la cornée est régénéré par des cellules qui migrent à partir du limbe vers le centre de la cornée. Ensuite, la régénération de la cornée dans des conditions blessant a été examiné. Afin de tester le sort de cellules de la cornée / limbiques K14-positifs sous blessant conditions tout en induisant suivi cellulaire efficace, nous a dissous le tamoxifène dans le diméthylsulfoxyde (DMSO), ce qui provoque des lésions cornéennes lors de l'application topique. De cette façon, nous avons réussi à induire une blessure légère si une application topique unique a été appliquée (figure 2C), mo déclasser blessant si un traitement supplémentaire DMSO seul a été appliqué à la veille de tamoxifène induction ou une blessure grave lorsque DMSO seul a été appliqué par voie topique à 2 jours consécutifs avant le tamoxifène induction.

En contraste avec les rayures minces limbiques qui se sont développées lentement et atteint le centre de la cornée dans les 4 mois en vertu de l'état d'équilibre, la migration cellulaire suite à une lésion a été rapide. Remarquablement, rayures limbiques longs et épais ont déjà été développés dans ces conditions, dans les 7 jours. Fait intéressant, la diversité des couleurs est parfois minime (figure 2D). Dans nos mains, parfois, principalement les globules rouges ont été identifiés dans l'ensemble de la cornée, ce qui indique que la diversité de couleur peuvent être biaisées en faveur des fluorophores spécifiques. Ce biais indésirables peut être calibré par des essais de réponse à la dose comme indiqué précédemment dans Br1.0L ³¹ et ²¹ Br2.1.

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Figure 1. Représentation schématique de la construction R26R-confettis. (A) La construction R26R-confetti contient un promoteur CAG pour les niveaux élevés d'expression, un loxP (triangle noir) -flanked Neo ^R -roadblock et la cassette Brainbow2.1 au locus Rosa26 ^16,21. La cassette Brainbow2.1 comprend deux tête-à-queue dimères loxP flanquée. Un dimère se compose de protéine nucléaire localisée vert fluorescent (GFP) et un cytoplasmique protéine fluorescente jaune orientée inverse (YFP, l'orientation inversée est désigné - PFY). Le second dimère contient DP et une membrane cytoplasmique-captif protéine fluorescente cyan orientée inverse (PCP, l'orientation inversée est désigné - PFC) ^16. (B - E) Lors de l'activation recombinase Cre, différents excision et d'inversion événements peuvent se produire; résultats possibles sont exemplified in B - E. L'activité Cre induit réarrangement stochastique de la cassette conduisant à des déménagements de gènes et / ou les inversions et entraîne donc l'expression aléatoire de l'une des quatre protéines fluorescentes. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2. De la lignée de la cornée traçage dans l'homéostasie et des blessures. R26R-confetti / souris K14-Cre ont été injectés avec 4 mg de tamoxifène comme indiqué dans le protocole. Dans l'heure indiquée de points après l'induction aplati cornées ont été imagées (A - B). La blessure de la cornée couplé avec Cre induction a été réalisée par application topique de tamoxifène dissous dans du DMSO (C - D). Mosaic Images obtenuespar multicanal carrelages microscopie confocale spectrale sont montré (A - D). Dans l'homéostasie, rayures limbiques radiales de cellules migrantes lents étendues entre le limbe et le centre de la cornée. Ces bandes se développe lentement, pour atteindre le centre de la cornée dans les 4-5 mois (B). Des grappes de cellules de la cornée étaient évidents aussi bien (flèches blanches, B). En revanche, les grandes stries limbiques sont apparus dans une seule semaine dans des conditions blessant (C). Un exemple pour le biais de la diversité de couleur vers les globules rouges (D). La frontière de limbique-cornéen est annoté par une ligne pointillée. La barre d'échelle est de 500 um. Abréviations: la PCP, la protéine fluorescente cyan; GFP, protéine fluorescente verte; DP, la protéine fluorescente rouge; YFP, protéine fluorescente jaune. Ce chiffre a été modifié depuis ^24. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande decette figure.

Discussion

Expériences de la lignée de traçage ont été menées depuis de nombreuses années. Les améliorations technologiques récentes et l'émergence des souches de souris Confetti ont ouvert de nouvelles pistes de recherche. Aujourd'hui, les chercheurs peuvent bénéficier d'un grand nombre de lignes disponibles dans le commerce Cre tissu-spécifiques, souris knock-out et des souris transgéniques. Ceci constitue une opportunité pour la conception de systèmes expérimentaux polyvalente pour aborder les questions scientifiques ayant une expertise de base, en évitant la pratique laborieuse, tout en fournissant des données robustes et fiables.

Souris R26R-Confetti sont un outil élégant pour le suivi efficace et l'étude de la nature et le comportement des cellules dans un organisme vivant. Le système est facile à mettre en place et il permet le traçage lignée non-invasive de cellules isolées au cours de l'embryogenèse, la régénération des cellules souches sous l'homéostasie, ou dans des circonstances différentes, comme des blessures, l'inflammation et le cancer. Les données obtenue fournit une descript robusteion de la survie des cellules cibles, l'expansion clonale de cellules et la migration cellulaire, d'une manière quantifiable. Une étape cruciale serait de choisir la souche de souris génétique approprié qui peut sûrement permettre un étiquetage spécifique des tissus efficace à un stade de développement précis. Une limitation de ce système est que, pour la surveillance d'un organisme vivant, le tissu doit être accessible et transparent. De même, le suivi d'un épais tissu dans un animal vivant peut être que facilitée par deux photons ou la microscopie multi-photon. Toutefois, le suivi de la cellule est possible sur des coupes de tissus post-mortem et peut-être le tissu intact peut être étudiée après qu'elle a été transformée pour devenir transparent par le procédé de CLARTE ^32,33. Une autre limite à prendre en compte est que, bien que les cellules adjacentes qui expriment le même fluorophore appartiennent vraisemblablement la même lignée clonale, il est également possible qu'ils peuvent être dérivés d'origine cellulaire indépendante qui exprime de façon aléatoire le même gène fluorescent. Cette PossiblesTy devient très peu probable lorsque vous utilisez plusieurs allèles Br pour permettre de nombreuses combinaisons de couleurs.

Dans le futur, combinant le système Confetti avec des outils génétiques disponibles (c.-à-KO, modèles knock et souris transgéniques) permettra l'étude des gènes et leurs mutations en matière de santé et de la pathologie. De même, la lignée de traçage sous différentes perturbations du système (c.-à enrayer la destruction de niche cellulaire, laser ablation à médiation cellulaire, traitement de la toxicomanie) va apporter de nouvelles idées sur l'implication des voies dans les décisions du destin de la signalisation cellulaire. En fin de compte, l'utilisation combinatoire de marquage fluorescent et bioluminescence, les journalistes génétiques des voies de signalisation et de coupe microscopie bord fournira aux chercheurs un système robuste d'apprendre comment les cellules seule répondre à leur environnement dans leur environnement natif.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
R26R-Confetti souris transgéniques homozygotes pour la cassette Brainbow 2.1		Jackson souche #013731
K14-CreERT souris	Jackson	souche #005107
tamoxifène	Sigma	T5648
isoflurane USP Terrell	Piramal Critical Care
Carprieve 30	b.wt
DMSO	Sigma	D2650
DAPI	Sigma	D9542	utilisé à une concentration de 4  ; et micro ; g/ml
Monture Immu	Thermo Scientific	9990402
LSM 510 Système confocal à balayage laser Meta relié à un microscope motorisé inversé (Axiovert 200M) équipé d’une platine motorisée	Zeiss		Le chevauchement spectral entre GFP, YFP et CFG nécessite l’utilisation d’une imagerie spectrale qui permet la séparation des spectres d’émission des protéines fluorescentes. Ici, nous utilisons le microscope confocal spectral Zeiss LSM 510 Meta. Le détecteur Meta inclus dans ce système comporte 32 éléments de détection, chacun collectant des émissions à partir d’une bande d’ondes de 10 nanomètres. Cette technique, appelée « empreinte spectrale », permet à l’utilisateur de fixer les limites les plus adéquates pour le filtrage en bande d’ondes. Il existe une variété de systèmes confocaux spectraux qui peuvent être utilisés, notamment Leica SP5 (ref #21), SP8, Zeiss LSM 780 (ref #22).
Zen 2009 Logiciel d’imagerie	Zeiss
Duratears-pommade pour les yeux	Alcon