Isolement physique des Endospores partir d'échantillons environnementaux par ciblé lyse des cellules végétatives

Résumé

Une méthode permettant de distinguer les endospores bactériennes des communautés microbiennes complexes a été développée pour effectuer des études de culture ou moléculaires sur mesure de ce groupe de bactéries.

Résumé

La formation d’endospores est une stratégie de survie que l’on retrouve chez certaines bactéries de l’embranchement des Firmicutes. Au cours de la formation des endospores, ces bactéries entrent dans un état de repos morpho-physiologique qui améliore la survie dans des conditions environnementales défavorables. Même si les firmicutes endosporulés sont l’un des groupes bactériens les plus fréquemment enrichis et isolés dans les études de culture, ils sont souvent absents des études de diversité basées sur des méthodes moléculaires. La résistance du noyau des spores est considérée comme l’un des facteurs limitant la récupération de l’ADN des endospores. Nous avons mis au point une méthode qui tire parti de la résistance plus élevée des endospores pour les séparer des autres cellules d’une communauté microbienne complexe en utilisant des méthodes de lyse physique, enzymatique et chimique. La préparation d’endospores uniquement obtenue peut être utilisée pour la re-culture ou pour effectuer des analyses en aval telles que l’extraction d’ADN sur mesure optimisée pour les endospores et le séquençage ultérieur de l’ADN. Cette méthode, appliquée à des échantillons de sédiments, a permis l’enrichissement des endospores et, après séquençage, a révélé une grande diversité de formateurs d’endospores dans les sédiments lacustres d’eau douce. Nous nous attendons à ce que l’application de cette méthode à d’autres échantillons donne un résultat similaire.

Introduction

Le but de ce travail est de fournir un protocole pour la séparation des endospores bactériennes partir de cellules bactériennes végétatives dans les échantillons environnementaux. La formation d'endospores bactériennes est une stratégie de survie, généralement déclenchée par la famine, trouvé dans un certain nombre de groupes de bactéries appartenant à l'embranchement des Firmicutes ^1. Bactéries endospores sont bien étudiés, principalement en raison d'un certain nombre de souches sont pathogènes et donc d'une importance médicale (par exemple, Bacillus anthracis ou Clostridium difficile). Souches environnementales de bactéries endospores ont été isolés à partir de pratiquement chaque environnement (sol, eau, sédiments, l'air, la glace, intestin humain, les animaux intestin et plus) ^1-3. Par conséquent, Firmicutes sont le deuxième embranchement le plus abondant dans les collections de cultures ^4.

En raison de leurs protéines du cortex externe et fondamentales de protection robustes, endospores peuvent survivre dans des conditions environnementales extrêmes allant from dessiccation à rayonnement élevé, des températures extrêmes et des produits chimiques nocifs ^5. Cette résistance remarquable en fait un défi pour extraire l'ADN des endospores ^6-8. Cela explique probablement pourquoi ils ont été négligés dans les études de séquençage de l'environnement ^9,10. D'autres méthodes, telles que le ciblage des endospores dans les échantillons environnementaux par des anticorps fluorescents ^11, quantification de l'acide dipicolinique (DPA) dans le sol et les sédiments ^{13 12,} la cytométrie de flux ¹⁴ ou la pasteurisation et la culture subséquente ^15,16 ont été utilisés pour récupérer ou de quantifier dans endospores les échantillons environnementaux. Au cours des dernières années, les méthodes d'extraction d'ADN optimisée, ainsi que des amorces moléculaires spécifiques pour cibler des séquences de gènes spécifiques ont été développés endospores ^10,17-20. Cela a contribué à révéler plus de biodiversité au sein de ce groupe de bactéries ^{21 et} a également conduit à des applications dans l'industrie et la médecine pour la détection des endospores, Par exemple dans le lait en poudre ^19.

Le protocole présenté ici est basé sur la différence de résistance à physico-chimiques nocifs (conditions telles que la chaleur et détergents) de endospores bactériennes par rapport à des cellules végétatives. Pour détruire les cellules végétatives dans un échantillon, nous appliquons consécutivement la chaleur, le lysozyme et de faibles concentrations de détergents. La durée et la force de ces traitements ont été optimisés afin de ne pas détruire les spores, mais pour lyser toutes les cellules végétatives. Certaines cellules dans une piscine de la cellule de l'environnement sont plus résistants que d'autres, afin d'augmenter la probabilité de détruire toutes les cellules végétatives, nous appliquons trois traitements différents. L'avantage de la nouveauté et cette méthode est que les endospores après le traitement sont encore intacts et peuvent être utilisés pour d'autres analyses en aval. Ceux-ci comprennent l'extraction de l'ADN, la PCR quantitative (qPCR) et amplicon ou le séquençage métagénomique (ciblant spécifiquement le groupe des endospores et donc de réduire dIVERSITÉ, tout en augmentant la couverture). Les endospores pourraient également être utilisés pour la culture ou la quantification en aval par microscopie par fluorescence, cytométrie de flux, ou la détection de DPA. Une caractéristique importante de ce procédé est que, en comparant un échantillon non traité avec un échantillon traité, on peut déduire la quantité et la diversité des endospores dans un échantillon environnemental, en plus de la composante correspondant à des cellules végétatives.

Protocole

1. Préparation des produits chimiques et de l'équipement

1. Ajouter 500 ml d'un hexamétaphosphate de sodium à 1% (SHMP) (NaPO _{3) n} solution et stériliser par autoclavage.
2. Stériliser nitrocellulose (NC) filtres (taille de pores de 0,22 um, diamètre 47 mm) par autoclavage en verre fermé des boîtes de Pétri.
3. Stériliser les filtres NC (taille de pores 0,22 pm, diamètre 25 mm) à l'autoclave fermé en verre boîtes de Pétri.
4. Peser et noter le poids à vide des tubes de 50 ml stériles (avec Cap sur) (un tube par échantillon).
5. Préparer Tris-EDTA-tampon (tampon TE) 1x: effectuer solution de Tris 10 mM (tris (hydroxyméthyl) aminométhane de) et le tampon EDTA 1 mM. Ajuster le pH à 8 et stériliser à l'autoclave.
6. Préparer la solution de lysozyme (20 mg / ml) en dissolvant 0,02 g de lysozyme dans 1 ml de tampon TE. Idéalement, faire des frais à chaque fois. Conserver à 4 ° C pendant pas plus de 1 semaine.
7. Préparer la solution physiologique en dissolvant 8 g / L de chlorure de sodium(NaCl) dans l'eau distillée. Stériliser à l'autoclave.

2. La séparation de la biomasse à partir des sédiments

1. Ajouter 3 g d'échantillon de sédiments pré-pesée stérile tubes de 50 ml à l'aide de boules métalliques éthanol flambé. Effectuez cette dans un endroit propre, stérilisée par UV enceinte de biosécurité pour éviter la contamination.
2. Ajouter 15 ml d'une solution stérile (autoclave) solution de SHMP de 1% à l'aide d'un échantillon stérile gradué burette. La solution SHMP peut également être filtré pour éviter la contamination.
3. Homogénéiser le sédiment et la solution SHMP avec une dispersion liquide / homogénéisation (par exemple, homogénéisateur Ultra-Turrax). 70% d'éthanol-stériliser à l'autoclave ou le rotor de dispersion avant l'utilisation. Exécutez l'homogénéisation pendant 1 min à 17 500 rpm. Laisser l'échantillon reposer pendant 2 min et répéter l'homogénéisation pendant 1 min à la même vitesse du rotor.
4. Laissez l'échantillon reposer pendant 10 min. À cette étape, les particules les plus lourdes (minéraux) se déposent. Les cellules et les composants organiques de l'échantillon cependant wmalades restent en solution. Ensuite, transférer la solution de surnageant (contenant de la biomasse cellulaire) dans un tube de 50 ml propre, tout en prenant soin de ne pas perturber le culot de sédiments.
5. Pour le culot de sédiments ajouter encore 15 ml d'une solution stérile (autoclave) solution de SHMP 1% en utilisant une burette graduée stérile. Puis répétez les étapes 2.3 et 2.4. Cette répétition assure la séparation de la quantité maximale des cellules et des particules organiques dans le composant minéral du sédiment. Le surnageant de cette deuxième séparation peut être fusionné avec le surnageant provenant de la première séparation.
   Remarque: Les étapes suivantes sont toutes effectuées sur le surnageant (contenant la biomasse cellulaire). Le composant minéral (pastille sédiment) peut être mis au rebut.
6. Centrifuger l'échantillon à 20 x g pendant 1 min. Cette étape augmente la suffisant pour régler les petites particules minérales force g tandis que le matériau de cellule biologique reste encore en solution. Après centrifugation, transférer la solution de surnageant (contenant de la biomasse cellulaire) dans unpropre tube de 50 ml. Jeter le culot minérale.
7. Déterminer le volume final de la solution contenant la biomasse en pesant l'échantillon. La détermination du poids évite d'avoir à transférer l'échantillon dans un cylindre gradué et réduit les risques de contamination.

3. Collection de la biomasse sur le filtre à membrane

1. Préparer unité de filtration (membranes de 47 mm de diamètre) et la pompe à vide. Stériliser l'unité de filtration soit par autoclavage ou (si le verre Pyrex) par pulvérisation avec 70% d'éthanol et enflammé par un bec Bunsen. Laissez-le refroidir avant de continuer avec le protocole.
2. Ajouter membrane NC stérile à l'unité de filtration à l'aide de pinces stériles éthanol flambé.
3. Ajouter la moitié de l'échantillon de surnageant (de l'étape 2.6) sur l'unité de filtration à membrane et recueillir les cellules sur la membrane en utilisant la pompe à vide.
4. Lorsque le liquide est complètement passé à travers le filtre, arrêter la pompe à vide et retirer délicatement la membrane en utilisant Ethanol-flamme pince stérilisée. Placez la membrane dans une boîte de Pétri stérile.
   1. Couper la membrane de moitié l'aide de ciseaux stérilisés éthanol flambé. Ajouter chaque moitié de la membrane dans un tube de 2 ml distinct. La moitié de la membrane sera utilisé pour l'extraction et l'analyse de l'ensemble de la communauté bactérienne ADN. L'autre moitié du filtre est stockée à -80 ° C et sert comme une sauvegarde.
5. Placez nouvelle membrane NC sur l'unité de filtration et de collecter la biomasse à partir de la seconde moitié du volume de l'échantillon (de l'étape 2.6) en utilisant la pompe à vide.
6. Lorsque le liquide est complètement passé à travers le filtre, arrêter la pompe à vide et retirer délicatement la membrane en utilisant des pinces stérilisées éthanol flambé. Placer l'ensemble de membrane dans un tube de 2 ml distinct. Cet exemple sera utilisé pour le traitement de séparer les endospores de cellules végétatives. L'échantillon peut être stocké à -20 ° C jusqu'à utilisation.

4. La lyse des cellules végétatives

1. Effectuer latraitement pour séparer les endospores de cellules végétatives sur la biomasse déjà recueillis sur une membrane NC (étape 3.6).
   1. Si la membrane a été gelé, le laisser à température ambiante pendant 10 min à décongeler. Ensuite, placez la membrane dans une boîte de Pétri stérile et couper (environ 4 fois) en petits morceaux avec des ciseaux stérilisés éthanol flambé. Ensuite, placer tous les éléments de filtre à membrane dans un tube stérile de 2 ml.
2. Ajouter 900 pi de 1x TE (Tris-EDTA) tampon (voir 1.5) dans le tube contenant la membrane de l'échantillon et bien mélanger au vortex. A ce stade, la biomasse est enlevée de la membrane dans la solution tampon TE.
3. Placer le tube dans un incubateur à 65 ° C pendant 10 min et 80 tours par minute. Ensuite retirer le tube de l'incubateur et le laisser refroidir pendant 15 min.
4. Ajouter 100 ul de lysozyme fraîchement préparé (voir 1.5) pour atteindre une concentration finale de 2 mg / ml. Ne pas ajouter le lysozyme avant que l'échantillon est refroidi à 37 ° C, car cela pourrait degRade l'enzyme.
5. Incuber l'échantillon à 37 ° C pendant 60 min et 80 tours par minute, les conditions optimales pour le lysozyme pour lyser des cellules végétatives.
6. Après la lyse est complète, ajouter 250 ul de 3 N d'hydroxyde de sodium (NaOH) et 250 pi de dodécylsulfate de sodium (SDS) solution à 6% de l'échantillon. En ajoutant cela, le volume d'échantillon de 1,5 ml et atteint il y a une concentration finale de 0,5 N de NaOH et la concentration finale de 1% de SDS.
7. Incuber ce mélange à température ambiante pendant 60 min et 80 tours par minute. Ajout de la base et des détergents aidera en finale de la lyse cellulaire. La concentration de ces détergents a été optimisée pour ne pas endommager les endospores, tandis que la lyse des cellules végétatives.
8. Préparer une unité de filtration stérile qui contient 25 membranes mm de diamètre à l'autoclave, ou (si le verre Pyrex) pulvérisation d'éthanol à 70% et enflammé par un bec Bunsen. Laissez refroidir.
9. Placer une membrane NC 0,2 um (diamètre 25 mm) sur l'unité de filtration en utilisant une pince-éthanol flamme stérilisés.
10. Ajouter l'échantillon provenant de l'étape 4.7 sur la membrane et le liquide au moyen d'un filtrage de la pompe à vide. Lorsque le liquide est passé à travers, éteignez la pompe à vide. A cette étape, le matériau cellulaire lysé végétatif est éliminé, car il ne sont pas retenus sur la membrane. Seulement des endospores resteront sur la membrane.
11. Ajouter 2 ml de solution physiologique stérile pour laver détergents résiduels et filtrer le liquide en utilisant la pompe à vide.
12. Lorsque le liquide est entièrement filtrée, éteignez la pompe à vide. Laisser la membrane de l'unité de filtration.

5. Traitement DNase

Remarque: effectuer le traitement à la DNase directement sur la membrane filtrante. Il est important que l'unité de filtration ne fuit pas et la pompe à vide est éteint.

1. Ajouter 450 ul d'eau stérile, 50 ul de tampon de réaction de DNase (1 x) et 0,5 ul de DNase X enzyme directement sur la membrane filtrante et laisser reposer pendant 15 min. Si possible, faire la digestion dans une chambre qui est légèrement guerreRT mer que la moyenne, étant donné que l'enzyme fonctionne mieux à des températures de 25 ° C et au-dessus.
   Remarque: En gardant le bec Bunsen de côté de l'unité de filtration augmente également la température et a l'avantage supplémentaire de conserver stérile l'environnement, donc réduit le risque de contamination des échantillons.
2. Lorsque la digestion de DNase est terminée, tourner sur la pompe à vide pour éliminer l'enzyme de l'échantillon.
3. Laver enzyme résiduelle et à filtrer en ajoutant 1 ml de solution physiologique.
4. Si du liquide a pleinement réussi, éteignez la pompe à vide et retirer la membrane de filtration contenant des endospores l'aide de pinces stériles et le placer dans une boîte de Pétri stérile.
   Remarque: L'échantillon d'endospores séparés est maintenant prêt pour l'analyse en aval. Conserver à -20 ° C si utilisé pour l'extraction de l'ADN ou bien à 4 ° C si elle est utilisée pour la germination et la culture.

Résultats

Les résultats présentés ici ont été publiés plus tôt ^10,21. S'il vous plaît se référer à ces articles pour l'interprétation de l'environnement et la discussion des données.

La procédure générale est résumée sur la figure 1 et correspond à trois étapes principales: d'abord, la séparation de la biomasse à partir de sédiments ou de toute autre matrice de l'environnement; d'autre part, la destruction de cellules végétatives; et la troisième, l'analyse...

Discussion

La résistance des endospores à des facteurs physico-chimiques agressifs externes (par exemple, la température ou détergents) a été utilisé pour mettre au point une méthode pour séparer les endospores bactériennes à partir de cellules végétales dans des échantillons environnementaux. Ceci est la première méthode complète pour isoler à partir d'échantillons environnementaux endospores d'une manière non-destructive. Les procédés antérieurs pour quantifier, détecter ou analyser endospores dans les ...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Filtres à membrane nitrocellulosique Whatman, 0,2 μ ; taille des pores, 47 mm de diamètre	Sigma-Aldrich	WHA7182004 Aldrich  ;
Tris(hydroxyméthyl)aminométhane	Sigma-Aldrich	252859 Sigma-Aldrich	CAS 77-86-1
EDTA	Sigma-Aldrich	E9884 Sigma-Aldrich	CAS  ; 60-00-4  ;
Lysozyme à partir de blanc d’oeuf de poule	Sigma-Aldrich	62971 Fluka	en poudre, CAS 12650-88-3  ;
Homogénéisateur Ultra-Turrax T18 basic	IKA	3720000
Porte-filtres en verre pour 47  ; mm membranes, verre Pyrex	EMD Millipore	XX10 047 00
Pompe à vide chimique	Millipore	WP6122050	220 V/50 Hz
Filtration d’échantillonnage sur collecteur pour 25  ; mm membranes	Millipore	1225 Sampling Manifold	polypropylène
Dnase	New England Biolabs	M0303S	Rnase free
NaOH	Sigma-Aldrich	S5881 Sigma-Aldrich	CAS  ; 1310-73-2  ;
Dodécylsulfate de sodium (FDS)	Sigma-Aldrich	L3771 Sigma  ;
Filtres à membrane nitrocellulosique Whatman, 0,2 μ ; taille de pores, 25 mm de diamètre	Sigma-Aldrich	WHA7182002 Aldrich