Le comportement des fibroblastes sous-tend un spectre d’entités cliniques, mais ils restent mal caractérisés, en grande partie en raison de leur hétérogénéité inhérente. La recherche traditionnelle sur les fibroblastes repose sur la manipulation in vitro, masquant le comportement des fibroblastes in vivo. Nous décrivons un protocole basé sur FACS pour l’isolement des fibroblastes de peau de souris qui ne nécessite pas de culture cellulaire.
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Article de méthode
Murin fibroblastes dermiques Isolation par FACS
* These authors contributed equally
Dans cet article
Résumé
Résumé
Les fibroblastes sont le type de cellules sécrétant principe responsable de la matrice extracellulaire et sont une composante essentielle de nombreux organes et tissus. Fibroblastes et la pathologie sous-tendent la physiologie un spectre d'entités cliniques, y compris les fibroses dans plusieurs organes, les cicatrices hypertrophiques brûlures suivantes, la perte de la fonction cardiaque après une ischémie, et la formation de stroma du cancer. Cependant, les fibroblastes restent un type mal caractérisé de la cellule, en grande partie en raison de leur hétérogénéité inhérente. Les procédés existants pour l'isolement des fibroblastes en culture ont besoin de temps de cellule qui influence profondément phénotype et le comportement cellulaire. Par conséquent, de nombreuses études sur la biologie fibroblastes reposent sur la manipulation in vitro et ne reflètent pas fidèlement le comportement des fibroblastes in vivo. Pour surmonter ce problème, nous avons développé un protocole à base de FACS pour l'isolement des fibroblastes de la peau du dos de souris adultes qui ne nécessite pas de culture cellulaire, ainsi preserving de la transcription physiologique et le profil protéomique de chaque cellule. Notre stratégie permet exclusion des lignées non-mésenchymateuses par une porte de lignée négative (Lin -) plutôt que d'une stratégie de sélection positive pour éviter de pré-sélection ou à l'enrichissement d'une sous-population de fibroblastes exprimant des marqueurs de surface spécifiques et être aussi inclusif que possible sur ce hétérogène type de cellule.
Introduction
Les fibroblastes sont souvent morphologiquement définies comme des cellules en forme de fuseau qui adhèrent à des substrats en matière plastique. Les fibroblastes sont le type cellulaire principe responsable de la synthèse et le remodelage de la matrice extracellulaire dans des organes embryonnaires et adultes 1. Les fibroblastes sont donc cruciale pour le développement des mammifères et contribuent sensiblement au milieu extracellulaire qui influe sur le comportement des types présents dans chaque tissus et des organes de cellule voisine.
Les fibroblastes sont aussi le type de cellule principale derrière un ensemble diversifié....
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Protocole
Ce protocole fait suite à des méthodes approuvées par la commission administrative Université de Stanford sur Laboratory Animal Care.
1. Digestion des murins derme
- Euthanasier souris par dislocation cervicale après anesthésie par une injection intraperitoneale de kétamine 100 mg / kg de xylazine + 20 mg / kg + acépromazine 3 mg / kg.
Remarque: différents âges et milieux peuvent être utilisés. - Rasage et épiler la peau du dos. Environ 100.000 cellules peuvent être isolées à partir d'un morceau de peau du dos 60 mm x 100 mm.
- Immerger la souris dans 70% d'éthanol et le placer sur une surface propr....
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Résultats
La validité de cette approche (Figure 1) a été vérifiée dans un certain nombre de façons, qui peuvent être examinés en détail dans notre publication récente 27. Ceux-ci comprennent immunocytochimie des cellules triées et la masse cellulaire et unique analyse transcriptionnelle de la cellule des cellules fraîchement triées. Tri fibroblastes directement plutôt que de compter sur la culture avec plus de précision capte leur phénotype in vivo. En utilisant une approche de la lignée négative de l'épuiseme.......
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Discussion
Le protocole décrit dans ce manuscrit offre un moyen d'isoler les fibroblastes par tri à base de FACS, par rapport aux méthodes existantes, qui soit sélectionner une sous-population ou nécessitent du temps dans la culture cellulaire avant les analyses ultérieures. Le temps nécessaire à partir de la récolte de la peau pour le tri des fibroblastes est d'environ 6 h; toutefois, le nombre de souris utilisées dans la récolte aura une influence sur cette estimation.
Plusieurs points du pro.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Remerciements
Ce travail a été financé en partie par une subvention du NIH R01 GM087609 (à HPL), un cadeau d'Ingrid Lai et Bill Shu en l'honneur d'Anthony Shu (à HPL), subvention du NIH U01 HL099776 (MTL), le Laboratoire Hagey pour pédiatrique médecine régénérative et la Fondation Oak (MTL, GCG et HPL). GMV a été soutenu par l'École de médecine de Stanford, le Programme de formation scientifique médicale de Stanford, et la subvention de formation NIGMS GM07365. ZNM a été soutenu par la chirurgie plastique Research Foundation Fellowship Grant et le Fonds de la famille Hagey. MSH a été soutenu par le California Institute for Regenerative Medicine (CIRM) la formation Fellow clinique de su....
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Pince chirurgicale | Kent Scientific | INS650916 | |
| Micro-ciseaux | Kent Scientific | INS600127 | |
| Povidone Iodine Prep Solution | Dynarex | 1415 | |
| Nair (crème dépilatoire) | Church and Dwight Co. | ||
| Collagénase IV | Gibco | 17104-019 | |
| Elastase | Abcam | ab95133 | |
| DMEM | Life Technologies | A14430-01 | |
| Sérum fœtal bovin | Gibco | 16000-044 | |
| Tampon de lyse ammoniaque-chlorure-potassium (ACK) | Gibco | A10492-01 | |
| 40 &mu ; m filtres | Fisher Scientific | 08-771-1 | |
| 70 &mu ; filtres m | Fisher Scientific | 08-771-2 | |
| 100 &mu ; filtres Fisher | Scientific | 08-771-19 | |
| CD31 | BioLegend | 102421 | |
| CD45 | BioLegend | 103125 | |
| Tie2 | BioLegend | 124005 | |
| Ter-119 | BioLegend | 116233 | |
| EpCAM (CD326) | eBioscience | 48-5791 | |
| DAPI | Invitrogen | D3571 | |
| iodure de propidium (coloration de viabilité PI) | BioLegend | 421301 |
Références
- Sorrell, J. M., Caplan, A. I. Fibroblasts-a diverse population at the center of it all. International review of cell and molecular biology. 276, 161-214 (2009).
- Wynn, T. A. Cellular and molecular mechanisms of fibrosis. The Journal of pathology.
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Réimpressions et autorisations
