Article de méthode

High Yield expression de protéines recombinantes humaines avec la transfection transitoire de cellules HEK293 en suspension

DOI :

10.3791/53568

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28 décembre 2015

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1The Roy J. Carver Department of Biochemistry, Biophysics and Molecular Biology, Iowa State University, 2Complex Carbohydrate Research Center, University of Georgia

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Résumé

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La production à l’échelle du laboratoire de protéines eucaryotes avec une modification post-traductionnelle appropriée représente un obstacle important. Voici un protocole robuste avec une mise en place et un délai d’exécution rapides pour l’expression de protéines à l’aide d’un système d’expression de mammifères. Ce système prend en charge le marquage sélectif des acides aminés, le marquage sélectif des protéines et les modulateurs de petites molécules de la composition des glycanes.

Résumé

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L'art de la production de protéines recombinantes avec des modifications post-traductionnelles complexes représente un défi majeur pour les études de structure et la fonction. La mise en place rapide et de récupération élevés de lignées cellulaires de mammifères transitoirement transfectées aborde cette barrière et est un moyen efficace d'exprimer des protéines qui sont naturellement acheminée par le ER et Golgi voie de sécrétion médiée. Voici un protocole pour l'expression de protéine en utilisant la HEK293F humain et des lignées de cellules transfectées HEK293S avec un vecteur d'expression de mammifère destiné à des rendements élevés de protéines. L'applicabilité de ce système est démontrée en utilisant trois glycoprotéines représentatives qui ont exprimé avec des rendements entre 95-120 mg de protéine purifiée récupérée par litre de culture. Ces protéines sont le FcyRIIIa humain et la sialyltransférase α2-6 de rat, ST6GalI, tous deux exprimés avec une fusion GFP N-terminale, ainsi que l'immunoglobuline humaine non modifiée G1 Fc. Cette robustes uti systèmeLizes un milieu exempt de sérum qui peut être adapté pour l'expression de protéines et d'hydrates de carbone pour des études structurales par spectrométrie de masse et spectroscopie de résonance magnétique nucléaire isotopiquement enrichis. En outre, la composition du N-glycane peut être réglée par addition d'une petite molécule pour empêcher certaines modifications glycanniques d'une manière qui ne réduit pas le rendement.

Introduction

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Produire des rendements élevés de protéines humaines pliées de manière appropriée et modifications post-traductionnelles pour l'analyse détaillée de la structure et de la fonction demeure un défi important. Un grand nombre de systèmes d'expression sont disponibles qui produisent des protéines recombinantes avec fonction native-like et le comportement. Systèmes d'expression bactériens, principalement des souches d'Escherichia coli, représentent les outils les plus accessibles et couramment utilisés dans le domaine de la recherche, en raison de la simplicité de ces systèmes d'expression, bien que la levure, des plantes, les insectes et les mammifères sont également décrits 1-4. Cependant, la plupart de ces systèmes sont incapables de modification post-traductionnelle appropriée des protéines cibles. Un intérêt fondamental des laboratoires Barb et Moremen est la production de protéines eucaryotes avec une glycosylation appropriée. Beaucoup de protéines humaines exigent glycosylation appropriée pour le bon fonctionnement (voir 5).

Le eucaryotemachines de glycosylation est vaste et capable de faire un large éventail de modifications, incluant à la fois l'asparagine (N) - et de la sérine / thréonine (O) lié en glycanes complexes 6. On estime que> 50% des protéines humaines sont N-glycosylées 7. Glycanes sont des composantes essentielles de nombreuses protéines, y compris des anticorps thérapeutiques monoclonaux, l'érythropoïétine, et les facteurs de coagulation du sang comme le facteur IX, pour ne nommer que quelques-uns. Bien que plusieurs méthodes existent pour préparer des protéines convenablement N-glycosylée et vont de purement synthétique 8-10, 11-14 à chimioenzymatiques ou la récupération de systèmes recombinants d'ingénierie 15-20, sans surprise, des systèmes d'expression humains ont jusqu'ici avéré être le plus robuste des procédés pour générer des protéines humaines.

De nombreuses glycoprotéines humaines thérapeutiques sont produits dans des systèmes recombinants en utilisant des cellules de mammifères. Systèmes de la note sont l'ovaire de hamster chinois (CHO), myélome de souris (NS0), Baby Hamster Kidney (BHK), de rein embryonnaire humain (HEK-293) et des lignées de cellules rétiniennes humaines qui sont utilisés dans l'adhésion ou de la suspension de culture pour la production de protéine 4,21,22. Cependant, les systèmes d'expression de protéines de mammifère ont nécessité la production de lignées cellulaires stables, des milieux de croissance et le substrat coûteuses procédures de transfection assistée 23.

La transfection de cellules de mammifère est obtenue à l'aide de nombreux agents, y compris les phosphates de calcium, les polymères cationiques 24,25 (DEAE-dextrane, le polybrène, la polylysine, polyéthylimine (PEI)) ou des liposomes cationiques chargés positivement 26-29. PEI est un polycationique, chargé, linéaire ou ramifié en polymère (25 kDa) 26 qui forme un complexe stable avec l'ADN et est endocytose. Lors de l'acidification de l'endosome, PEI est pensé pour gonfler, ce qui conduit à la rupture des endosomes et la libération de l'ADN dans le cytoplasme de 26,30.

Jusqu'à récemment, la transfection transitoire dans suspensila culture a été réalisée par la formation du complexe ADN / PEI avant suivie de l'addition à la culture de cellules 29. Cependant, Würm et ses collaborateurs ont rapporté un protocole est performant optimisé pour une production de protéines recombinantes dans des cellules HEK293 qui ont formé un complexe ADN / PEI in situ 31,32. Ceci évite préparation, la stérilisation du complexe, et l'échange de tampon dans un milieu de culture. Poursuite de l'optimisation en incluant des plasmides d'expression amélioration conduit à une augmentation significative de rendement 33. Est ici une méthode qui se fonde sur ces avancées et est largement applicable. Conditions d'expression peuvent aussi être modifiées pour influer sur la composition de N-glycanes.

La lignée cellulaire HEK293S, avec une deletion de gène qui interrompt le traitement de N-glycane à un stade intermédiaire, conduit à l'expression de protéines avec des uniformes N-glycanes comprenant 2 résidus N-acétylglucosamine et cinq résidus de mannose (Man 5 GlcNAc 2) 34, 35. Ces cellulespas la N-acétylglucosaminyl transférase I (GntI) gène qui est nécessaire pour la N-glycane en aval traitement 36,37. L'utilisation d'inhibiteurs de glycosyltransférase comprenant kifunensine, des analogues d'acide sialique et l'analogue de fucose et de 2-désoxy-2-fluoro-fucose a des effets de traitement et les limites de N-glycane 38-41 similaires.

Le protocole indiqué ici utilise le vecteur pGEN2 comme représenté sur la figure 1 42,43, PEI transfection transitoire dans des cellules assistée lignes de mammifères ou des cellules HEK293F (HEK293S), et la récupération des rendements élevés de protéine glycosylée de façon appropriée. Ce système est robuste et peut accueillir divers facteurs, notamment marquage isotopique et de l'ingénierie glycane pour la production de grandes titres de protéines recombinantes.

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Protocole

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Ce protocole est suffisante pour l'expression en utilisant soit HEK293F ou cellules HEK293S.

1. Cellule Création

  1. Culture inoculation
    Remarque: Toutes les procédures de manipulation de culture doivent être effectuées dans une installation BSL-2 et chaque élément introduit dans la enceinte de sécurité biologique doit être stérilisé par pulvérisation d'un éthanol à 70% dans une solution aqueuse.
    1. Actionner l'incubateur agitateur à 135 tours par minute, 80% d'humidité et à 8,0% de CO 2 et 37 ° C. Tournez "sur" la lampe UV de l'armoire de biosécurité au moins 1 h avant de travailler. Préchauffer les bouteilles scellées milieu A et le milieu B dans le bain-marie à 37 ° C pendant 1 heure.
    2. Stériliser 125 ml des flacons Erlenmeyer de croissance avec un bouchon à évent, pipettes, pipettes, bouteilles et des médias préchauffées par pulvérisation avec de l'éthanol 70% dans une solution d'eau. Placez ces articles dans l'enceinte de sécurité biologique. Remarque: Stériliser que le plastique extérieure couvrant l'Erlenmeyer de 125 ml flacon de culture, puis retirez seulement quand il is intérieur de l'armoire de biosécurité.
    3. Pour une culture de 30 ml, retirer 26 ml de milieu A et 3 ml de milieu B (10% de la culture finale) et de les transférer dans le 125 ml de culture erlenmeyer et mélanger doucement en secouant (ci-après appelé comme milieu de culture frais).
    4. Transfert d'un flacon de cellules contenant des cellules HEK293F, congelés à -80 ° C, sur de la glace et de passer à la chambre de culture. Remarque: Les cellules HEK293F sont fournis à une densité de 1 x 10 7 cellules / ml.
    5. Chauffer doucement le flacon au bain-marie à 37 ° C pour dégeler partiellement les cellules (il faut environ une minute et les cellules ne doit pas être complètement décongelés). Stériliser à l'extérieur du flacon avec l'éthanol à 70% dans une solution d'eau et de le déplacer dans l'enceinte de sécurité biologique.
    6. En utilisant une pipette ml, retirer la suspension de cellules (environ 0,7 ml) et le transférer dans le Erlenmeyer de 125 ml contenant 29 ballon ml de milieu de culture frais. Fermez le couvercle du flacon de culture et le déplacer dans le shaker incubés.
  2. Maintenance des cellules: Vérifiez densité cellulaire, la viabilité et de passages cellulaires
    1. Vérifiez la densité des cellules après 24 heures de décongélation de la culture en suivant le protocole ci-dessous. Note: Les cellules sont cultivées pendant 24 h après la décongélation afin d'assurer la croissance des cellules et la viabilité essentiels de> 80%.
    2. Stériliser le flacon de culture avec l'éthanol à 70% dans une solution d'eau et de le déplacer dans l'enceinte de sécurité biologique.
    3. En utilisant une pipette de 1 ml et pipette, retirer lentement 100 pi de la culture et le transfert suspension dans un tube Eppendorf de 0,5 ml stérile. Fermer et transférer le flacon de culture de retour dans le shaker dès que possible.
    4. Mélanger 7,5 ul d'une solution de bleu trypan à 7,5 ul de cellules. Mélanger vigoureusement avec 7,5 pi de la cellule / bleu Trypan mélange et le transférer sur le coulisseau de comptage.
    5. Allumer le compteur de cellules automatique et placer la lame de comptage dans la chambre de chargement. Le lecteur automatique est activée et les cellules sont comptés automatiquement dans les unitésdu nombre de cellules par ml et la viabilité pour cent
    6. Déterminer le volume de la culture de donneur requis pour le transfert à un milieu de culture frais à la densité de cellules de 0,3 x 10 6 cellules / ml en direct.
      Remarque: Voir un exemple de calcul dans les matériaux supplémentaires.
    7. Répétez les étapes 1.1.2 et 1.1.3 du protocole "1.1 Culture inoculation" ci-dessus pour préparer le matériel requis pour milieu de culture frais.
    8. Transfert Moyen A (23 ml) et moyennes B (3 ml) à une 125 ml flacon de culture frais. Retirez les bouteilles d'achat d'actions de moyenne A et B de la moyenne enceinte de sécurité biologique.
      Remarque: Les stocks de bouteilles de médias ne devraient pas être conservés dans l'enceinte de sécurité biologique en même temps que les cellules HEK 293F. Cela limite la possibilité de contamination des bouteilles moyennes de stock.
    9. Retirer la culture de cellules HEK293 de l'incubateur et de pulvérisation avec de l'éthanol à 70% dans une solution aqueuse. En utilisant une nouvelle pipette, retirer l'aliquote de cellules (4 ml, ce volume a été déterminé en fonction to étape 1.2.6) de la culture et le transférer dans le flacon contenant le milieu de culture frais.
    10. Transfert à la fois les cultures de l'enceinte de sécurité biologique à l'agitateur d'incubateur réglé selon 1.1.1. Cultiver les cellules à une densité approximative de 2-3 x 10 6 cellules / ml en direct.
      Remarque: Le temps de doublement approximatif de cellules est 32 h. Il prendra 3-4 jours pour atteindre cette densité. Incuber les cellules pendant 3-4 passages d'avoir modèle de croissance stable de cellules avant la première transfection.

2. Préparer le matériel pour la transfection

  1. Préparation de cellules HEK293 (Jour 1)
    1. De sous-culture des cellules à une densité de 1 x 10 6 cellules / ml dans du milieu B frais 24 heures avant la transfection selon l'étape 1.2.
      Note: le volume de la culture de transfection dépendra du nombre de cellules. Les volumes de plus de transfection (> 20 ml) auront besoin d'un plus grand volume de la culture à ce stade.
  2. Préparation Sttroupeaux de Matériaux
    1. Préparer une solution stock de Polyéthylènimine linéaire (PEI) à une concentration de 1 mg / ml dans un tampon contenant 25 mM 4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazineethanesulfonic (HEPES) et NaCl 150 mM (pH 7,5). Dissoudre complètement PEI; cela peut prendre 30-60 minutes à température ambiante. Stériliser à travers le filtre de la seringue de 0,22 um et conserver à -20 ° C pour une utilisation à long terme.
    2. Préparer l'ADN plasmidique stérile (selon les étapes 2.2.2.1-2.2.2.4). La procédure de construction de plasmide est décrit ailleurs 42. Une brève procédure de préparation de l'ADN est expliqué ici:
      1. Cultiver une culture de cellules d'Escherichia coli chimiquement compétentes, transformées par le vecteur pGEN2 dans 1 L de milieu LB (Tryptone- 10 g / L, y décompresser levure 5 g / L et chloride- de sodium 10 g / l) supplémenté avec 100 ug / ml d'ampicilline. E. coli est cultivé à 37 ° C dans un non-humidifié, incubateur à agitation.
      2. Purifier l'ADN vecteur codant pour pGEN2 cible plasmidique selon la manuLe protocole de purification de l'ADN constructeur.
      3. Pour assurer la stérilité complète de l'ADN plasmidique, effectuer les précipitations de l'isopropanol et remise en suspension dernières étapes des procédures d'extraction d'ADN à l'intérieur de l'enceinte de sécurité biologique.
      4. Ajouter le volume d'isopropanol (spécifié dans le kit de préparation de plasmide) à l'ADN élue et centrifuger à 10000 x g pendant 10 min. Stériliser l'extérieur du récipient d'ADN avec de l'éthanol à 70% dans une solution aqueuse et la transférer à l'intérieur de l'enceinte de sécurité biologique. Jeter le surnageant de l'isopropanol aide d'une pipette et sécher à l'air le culot d'ADN. Une fois sec, remettre le culot dans un tampon stérile Tris 10 mM, pH 8,0.
    3. Préparer une solution stock de 220 mM valproïque (VPA) de l'acide dans l'eau et stériliser par passage à travers un filtre de 0,22 um stérile. Conserver la solution à -20 ° C jusqu'à utilisation ultérieure.

3. Établir une transfection transitoire

  1. Transfection (jour 0)
    1. Vérifiez la densité cellulaire en suivant les étapes 1.2.2 à travers 1.2.5 de "1.2. Maintenance des cellules" ci-dessus. Déterminer la quantité de cellules pour la transfection (2,5-3,0 x 10 6 cellules / ml en direct avec la viabilité> 95%). Voir un exemple de calcul dans les matériaux supplémentaires.
    2. Transférer le volume des cellules de culture en suspension calculés dans l'étape précédente (ici 67 ml) dans un tube à centrifuger de 250 ml en utilisant une pipette sérologique stérile. Recueillir les cellules par centrifugation pendant 5 min à 100 x g.
    3. Dans le même temps, préparer un milieu de culture de transfection frais étape 1.1.3 ci-dessous en fonction de "1.1. Culture inoculation" ci-dessus. Voir les matériaux supplémentaires pour un exemple de calcul. En outre, le transfert de 5 ml de milieu de culture frais à un tube de 15 ml stérile et mettre de côté.
    4. Tubes de transfert contenant les cellules sédimentées dans l'enceinte de sécurité biologique après la stérilisation à l'extérieur des tubes avec de l'éthanol à 70% dans une solution d'eau et en utilisant une pipette stérile à décanter ee surnageant constitué de milieu de culture usé.
    5. Vigoureusement Reprendre le culot de cellules par pipetage de haut en bas en utilisant 10 ml de milieu de culture frais et le transfert dans le ballon avec un milieu de culture de transfection frais (préparé à l'étape 3.1.3 ci-dessus). Visser le bouchon sur le flacon de culture cellulaire ventilé et déplacer le ballon à l'étuve (tel que défini au point 1.1.1) pendant 15 min-1 heure avec agitation.
    6. Pendant ce temps, on dilue l'ADN de plasmide et des stocks de PEI en utilisant un milieu de culture frais (en utilisant le volume de 5 ml retiré de l'étape 3.1.3 ci-dessus) à une concentration finale de 0,5 pg / pl. Voir des exemples de calculs dans les matériaux supplémentaires pour déterminer la quantité d'ADN et PEI. Transférer le flacon de culture avec les cellules dispersées dans l'enceinte de sécurité biologique.
    7. Ajouter ADN plasmidique (300 pi de 0,5 ug / ul) à la culture à l'aide de micro-pipette et mélanger par agitation manuelle douce. Ajouter PEI (900 pi de 0,5 ug / ul) à la culture, mélanger en agitant doucement. Ajouter 3,8 ml de cul fraismilieu de ture, de l'étape 3.1.3, ci-dessus et le transfert ballon à l'agitateur incubateur pendant 24 heures.
    8. Nettoyez l'enceinte de sécurité biologique selon l'étape 1.1.
  2. Dilution (Jour 1) (Pour un volume de transfection de 50 ml)
    1. Incuber la culture transfectées pendant 24 heures.
    2. Prélever 1 ml d'acide valproïque mM préchauffé 220 (VPA; préparé selon l'étape 2.2.3.) À l'aide d'une pipette stérile de 1 ml sérologique et le transférer dans un tube de 50 ml stérile.
    3. Retirer 5,0 ml de milieu B préchauffée et 44 ml de milieu A préchauffé et ajouter cette solution à l'aide d'une pipette VPA sérologique stérile pour préparer 50 ml de milieu de culture frais avec une concentration finale de 4,4 mM de VPA.
    4. Déplacez la culture transfectées dans l'enceinte de sécurité biologique après la stérilisation de l'extérieur de la fiole avec un éthanol à 70% dans une solution d'eau, ajouter le milieu de dilution préparé et transférer le ballon vers le shaker incubés.
  3. Expression et Harvest (Jours 2-6)
    1. Incuber les cellules pendant encore 4-5 jours (5-6 jours au total depuis transfection).
    2. Prélever des aliquotes de milieu de culture après l'étape 1.2.2. à 1.2.5. décrit dans «1.2. maintenance des cellules," ci-dessus en utilisant une pipette de 1 ml sérologique stérile, pour surveiller la viabilité des cellules et économisez aliquotes pour analyser l'expression de protéines à chaque jour par SDS-PAGE (voir la section 5 ci-dessous).
    3. Cellules de récolte Après 5-6 jours par centrifugation les cellules plus moyen à 1000 g pendant 5 min. En outre, récolter le surnageant si la viabilité cellulaire tombe en dessous de 50% (voir les étapes 1.2.2-1.2.5).
    4. Décanter le surnageant qui contient la protéine sécrétée. Ajouter 5 ml d'un agent de blanchiment de 10% au culot de cellules HEK et jeter comme un danger biologique.

4. Protein Purification

  1. Préparer une colonne avec 5 ml de protéine A-Sepharose. Équilibrer la colonne avec 5 volumes de colonne de tampon A (20 mM de 3- (N-morpholino) propanesulfonique d'acide (MOPS), pH 7,4, NaCl 100 mMl).
  2. Centrifuger le surnageant recueilli avec protéine exprimée à grande vitesse (14 000 g pendant 10 minutes) pour enlever les débris de cellules restant. Recueillir par décantation dans un nouveau tube. Jeter le culot comme un danger biologique.
  3. Récupérer une aliquote de 10 ul du surnageant et de recueillir en outre un petit échantillon à chaque étape de la purification des protéines à analyser l'échantillon par SDS-PAGE (décrit dans la section 5). Chargez le surnageant clarifié et de recueillir l'écoulement à travers.
  4. Laver la colonne avec 3 volumes de colonne de tampon-A et éluer la protéine avec 5 volumes de colonne de glycine-100 mM, pH 3,0. Recueillir l'éluat dans des tubes contenant une demi-volume de tampon TRIS 1 M, pH de 8,0 à neutraliser rapidement le pH.
  5. Laver la colonne avec 10 volumes de colonne de tampon A et stocker pour une utilisation future.
  6. Échanger le tampon de protéine est éluée avec au moins un excès de 10 fois de tampon A à l'aide de 10 kDa de poids moléculaire filtres centrifuges de coupure. Note: Ne pas concentrer l'échantillon élue àun volume très faible (<2 ml) éluée dans le tampon. Utilisez les filtres centrifuges pour échanger le tampon avec le tampon A.
  7. Magasin protéine purifiée à 4 ° C jusqu'à la prochaine utilisation.
    Remarque: la protéine exprimée dans le surnageant peut être purifié par des colonnes d'affinité sélectionnés sur la base des propriétés de la protéine ou de l'utilisation de marqueurs d'affinité. Pour une procédure typique de purification, colonne de protéine A peut être utilisée pour des fragments de Fc d'IgG ou de nickel ou de colonne peut être utilisé pour des protéines exprimées avec une étiquette poly-histidine. Ici, une description des étapes de purification pour les IgG1-Fc en utilisant une colonne de protéine A.

5. Analyse des protéines par SDS-PAGE

  1. Diluer les aliquotes (7,5 ul) de chaque échantillon avec un volume égal de tampon de charge 2x (Tris 0,125 M, pH 8,0, 4% de SDS, 10% β-mercaptoéthanol, 20% de glycerol et 0,01% de bleu de bromophénol).
  2. Faire bouillir le mélange à 90 ° C pendant 5 min en utilisant un bloc chauffant ou un bain d'eau. Centrifuger les échantillons à 10000 g for 1 min. Chargez le gel préparé avec 5 pi de protéine marqueur et 14 ul d'échantillons pour analyses à l'aide d'une pipette de 20 pi avec un embout jetable.
  3. Exécutez un gel à 25 milliampères pendant 60 min. Une fois l'étape d'électrophorèse terminée, le gel à transférer un récipient avec 1 litre d'eau et micro-ondes pendant 5 min.
  4. Colorer le gel avec une solution de coloration (40% d'éthanol, acide acétique à 10% et 0,1% bleu brillant de Coomassie) pendant 2 heures et déteindre dans l'eau.

6. glycanes analyse par spectrométrie de masse

  1. Analyser glycanes comme décrit précédemment 44. En bref, 75 ug d'IgG 1-Fc a été trypsinées, puis traité par la PNGaseF pour la libération de 45 glycanes. Glycanes libérés ont été perméthylés et analysés à l'aide de laser désorption ionisation spectrométrie assistée par matrice de temps de vol de masse (MALDI-TOFMS).

7. Ajustements relatifs au protocole pour les scénarios spéciales

  1. Marquage des protéines avec 15 N-acides aminés marqués (pour un volume de transfection 50 ml)
    1. Distribuer 5 mg de chaque acide aminé dans un seul flacon en verre stérile. Reprendre avec 4 ml d'eau à l'autoclave (note Tyr ne pas solubiliser complètement, contrairement Lys et Phe). Stériliser la solution par passage à l'autoclave à 121 ° C pendant 15 min. Laisser refroidir la solution à environ 50-60 ° C.
    2. Pour un volume de transfection de 50 ml, suivez l'étape 3.1.3 selon "3.1 Établir une transfection transitoire". Voir la section matériaux supplémentaires pour un exemple avec des volumes appropriés.
    3. Pour la transfection, suivez les étapes de "3. Établir une transfection transitoire" en utilisant un milieu de culture frais substituée avec des résidus d'acides aminés étiquetés comme préparé ci-dessus.
    4. Après 24 heures de transfection, le jour de culture dilution, retirer 5,0 ml de préchauffée milieu B, 40 ml d'préchauffé milieu A et un fraîchement passés à l'autoclave 4 ml aliquote du mélange d'acides aminés (préparé comme dans l'étape 7.1.1. Ci-dessus) et ajouter 1ml préchauffé solution stock de solution APV pour préparer 50 ml de milieu de culture frais de dilution avec une concentration finale de 4,4 mM d'APV. Ajouter ce milieu à la culture de transfection en utilisant une pipette sérologique stérile.
    5. Transférer la culture transfectées dans l'enceinte de sécurité biologique après la stérilisation de l'extérieur de la fiole avec un éthanol à 70% dans une solution d'eau, ajouter le milieu de dilution préparé et transférer le ballon vers le shaker incubés.
      Note: Moyen A est un milieu chimiquement défini, sans sérum. Ainsi, il est possible de préparer une formulation différente. Contactez le fournisseur pour obtenir une mesure moyenne Une préparation qui manque de certains acides aminés. Il est possible d'avoir tous les acides aminés en reste, cependant, nous préférons utiliser milieu qui ne lui manque que quelques résidus sélectionnez car un moyen d'abandon complet nécessiterait une adaptation de l'osmolarité après la supplémentation. Nous avons choisi un moyen d'abandon Lys-Tyr-Phe qui peut être complétée et ne nécessite pas de réglage de l'osmolarité. Furthermore, le milieu Un fournisseur ne partage pas librement les concentrations de composants de milieu; nous avons utilisé 100 mg / L pour le Lys, Tyr et Phe avec succès. Les volumes de milieu de transfection et d'expression doivent être adaptés pour tenir compte des acides aminés supplémentaires. Voici les ajustements au protocole ci-dessus pour l'étiquetage isotopique
  2. Compléter la transfection avec une petite molécule
    1. Préparer mM solution 100 de 2-désoxy-2-fluoro-L-fucose utilisant de l'eau à l'autoclave et stériliser cette solution en utilisant un filtre de 0,22 pm.
    2. Pour une culture de 50 ml, ajouter 125 ul (à 250 pM) de la solution fucose analogique pour la transfection et la dilution médias. Note: Nous avons négligé d'accomplir un réglage du volume en outre parce que l'ajout le substituant à ces comptes de concentration pour seulement 0,25% du volume total .Il de culture est possible de modifier l'expression en utilisant des petites molécules inhibitrices de traitement des glycanes. Nous décrivons ici les conditions pour y compris 2-désoxy-2-fluoro-L-fucose, un inhibiteur de la fucosylation glycane. Nous avons trouvé> 90% de réduction dans fucosylation en ajoutant l'analogue de fucose à une concentration de 250 uM dans la transfection et dilution médias.

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Résultats

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Expression de la protéine de haut niveau et de la pureté

Ce système d'expression optimisé généré un rendement élevé de protéines glycosylées. Un motif typique est montrée dans l'expression de Fc-IgG1 (figure 1). Dans ce cas, jour 0 est le jour de la transfection suivie par Jour 1 (dilution) et les jours de culture subséquentes jusqu'à Jour 5. expression de la protéine est analysée en utilisant la fraction d'ex...

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Discussion

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Ce protocole illustre l'expression de la protéine par l'intermédiaire de la transfection transitoire de cellules HEK293F ou S. Les conditions de transfection optimales établies dans les laboratoires et Barb Moremen emploient une combinaison critique de concentrations de densité de cellules et de réactifs pour réaliser la transfection à haut rendement. Considérations critiques lors de la mise en œuvre de ce protocole comprennent: le maintien d'une culture stable avant la transfection (avec la culture cohérent...

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Déclarations de divulgation

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Tous les auteurs ne déclarent aucun intérêt financier concurrent dans ce manuscrit.

Remerciements

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Ce travail a été soutenu financièrement par les subventions K22AI099165 (AWB), P41GM103390 (KWM) et P01GM107012 (KWM) des Instituts nationaux de la santé, et par des fonds provenant du Roy J. Carver Département de biochimie, biophysique et biologie moléculaire à l'Université de l'Iowa . Le contenu de ce travail est de la seule responsabilité des auteurs et ne représentent pas nécessairement les vues officielles de la NIH.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Enceinte de biosécurité  ;NuAire, Inc.CellGard ES NU-S475-400Classe II, Type A2 Armoire de sécurité biologique
Agitateur d’incubationINFORS HTMultitron Cell  ;
Medium A : Medium d’expression FreeStyle  ;Life Technologies12338-018
Medium B : ExCell 293 Sans Sérum  ;SIGMA14571C  ;
125 Erlenmeyer avec capuchon ventiléCorning Incorporated/Life Sciences431143
250 Erlenmeyer avec capuchon ventiléCorning Incorporated/Life Sciences431144
FreeStyle HEK 293F CellsLife TechnologiesR790-07
1 ml Pipette sérologique jetableFisher Scietific13-676-10B
10 ml Pipette sérologique jetableFisher Scietific13-676-10J
25 ml Pipette sérologique jetableFisher Scietific13-676-10K
Pipette (Pipet-Aid XP)Drummond Scientific161263
Trypan Blue Solution  ;Thermo Scientific  ;SV30084.01
Comptage des diapositives  ;Bio-Rad145-0011
TC20 Compteur de cellules automatiséBio-Rad  ;145-0102
Polyéthylénimine (Î.-P.-É)Polysciences Inc.23966Préparer une solution mère à une concentration de 1 mg/ml dans un tampon contenant 25 mM d’acide 4-(2-hydroxyéthyl)-1-pipérazinethanesulfonique (HEPES) et 150 mM de NaCl (pH 7,5). Dissoudre complètement l’Île-du-Prince-Édouard ; Stériliser par 0,22 &mu ; M seringue filtrer et stocker à -20 ° ;C.
Acide 4-(2-hydroxyéthyl)-1-pipérazineéthanesulfonique (HEPES)EMD Chemicals Inc.7365-45-9
Filtre à seringue de 25 mm, 0,22 &mu ; MFisher Scietific09-719A
Trisaminométhane (base Tris)Fisher ScietificBP152-1
XL1-BlueStratagene222249
TryptonFisher ScietificBP1421-2
Extrait de levureFluka Analytical  ;92144
Chlorure de sodiumProduits chimiques BDHBDH8014
Kit de purification de plasmidesQIAGEN12145
Valproic (VPA)SIGMAP4543Préparer une solution mère de 220 mM dans l’eau, stériliser par passage à travers un filtre stérile de 0,22 mm et conserver à -20 ° ; C
CentrifugeuseThermo Scientific  ;EW-17707-65
Protéine A-Colonne de sépharoseSIGMAP9424
Ni-NTA superflowQIAGEN30430
Acide 3-(N-morpholino)propanesulfonique (MOPS)Fisher ScietificBP308-500
GlycineFisher ScietificBP381-500
10 kDa seuil de coupure de poids moléculaire Amicon® ; Filtres ultra centrifuges  ;MilliporeUFC901096
Dodécylsulfate de sodiumALDRICHL3771
Bêta-mercaptoéthanolALDRICHM6250
GlycérolSIGMAG5516
Precision Plus Protein All Blue StandardsBio-Rad161-0373
Acide acétique, glacial  ;Fisher Scietific64-19-7
coomassie bleu brillant  ;Bio-Rad  ;161-0406
MALDI-TOFMS Voyager-DE PRO  ;Applied Biosystems
15N marqué L-TyrosineALDRICH332151
15N marqué L-LysineALDRICH592900
Non marqué L-PhénylalanineSIGMA-ALDRICHP2126
13C6-GlucoseALDRICH389374
2- désoxy-2-fluoro-l-fucose  ;SANTA CRUZ Biotechnologiesc-283123

Références

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Erratum

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Formal Correction: Erratum: High Yield Expression of Recombinant Human Proteins with the Transient Transfection of HEK293 Cells in Suspension
Posted by JoVE Editors on 9/08/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: High Yield Expression of Recombinant Human Proteins with the Transient Transfection of HEK293 Cells in Suspension. The Authors section was updated. from:

Ganesh P. Subedi1
Roy W. Johnson2
Heather A. Moniz2
Kelley W. Moremen2
Adam Barb1
1The Roy J. Carver Department of Biochemistry, Biophysics and Molecular Biology, Iowa State University
2Complex Carbohydrate Research Center, University of Georgia

to

Ganesh P. Subedi1
Roy W. Johnson2
Heather A. Moniz2
Kelley W. Moremen2
Adam W. Barb1
1The Roy J. Carver Department of Biochemistry, Biophysics and Molecular Biology, Iowa State University
2Complex Carbohydrate Research Center, University of Georgia

Mots-clés

Expression de prot ines recombinantesPurification de glycoprot inesCulture en suspensionPurification par affinitSuivi de la densit cellulaireTraitement au VPAAnalyse du rendement prot iqueModification des glycanes

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