Méthodes à découvrir Alternative Utilisation de promoteur et la régulation transcriptionnelle de Murine BCRP1

Résumé

Avec les anticorps monoclonaux transporteur ABC BCRP1 (ABCG2) à titre d'exemple, dans le silico protocoles sont présentés pour détecter l' usage alternatif du promoteur des gènes exprimés dans des tissus de souris, et pour évaluer la fonctionnalité des promoteurs alternatifs identifiés en utilisant des dosages de rapporteur.

Résumé

L'expression des gènes dans différents tissus est souvent contrôlée par des promoteurs alternatifs qui aboutissent à la synthèse d'ARNm avec uniques - - généralement non traduites premiers exons. BCRP1 (ABCG2), l'orthologue murin de l'ABC Breast transporteur Résistance cancer Protein (BCRP, ABCG2), a au moins quatre autres promoteurs qui sont désignés par les quatre premiers exons correspondants alternatifs produits: E1U, E1A, E1B et E1C. Ici, in-silico protocoles sont présentés pour prédire l' utilisation de promoteur alternative pour BCRP1. En outre, les méthodes de dosage de rapporteur sont décrits pour produire des constructions rapporteurs de promoteurs alternatifs et pour déterminer la fonction de promoteurs putatifs en amont des autres premiers exons identifiés.

Introduction

Plus de la moitié des gènes humains sont réglementés par des promoteurs alternatifs ^1. Chaque promoteur alternative peut contenir des éléments régulateurs qui peuvent être différentes de celles des autres promoteurs alternatifs. Le promoteur (s) utilisé dans un tissu peut être différent de ceux utilisés dans un autre tissu. Par exemple, il est possible que l'activation d'une voie de signalisation donnée peut déclencher le promoteur d'un gène de remplacement utilisé dans un tissu, mais n'a aucun effet sur ou réprimer un promoteur alternatif distinct pour le même gène qui est utilisé dans un autre tissu.

L'exp....

Protocole

1. In Silico Prediction of Alternative premiers exons de BCRP1 Utilisation de l' analyse BLAST de la base de données de souris EST

Remarque: Ce protocole décrit comment rechercher l'étiquette de séquence exprimée de la souris (HNE) base de données pour écotechnologies avec similarité de séquence exon 2 de BCRP1 (qui contient le site d'initiation de traduction), puis comment aligner les correspondants séquences EST à des séquences génomiques pour vérifier leur BCRP1 emplacement dans le gène de la souris par rapport à l'extrémité 5 'de l'exon 2 BCRP1.

1. Obtenir la séquence pour BCRP1 de la souris ex....

Résultats

Identification de Bcrp 1 variante promoteur utilisation dans les testicules de souris par l' analyse des exons leader

Lorsque la base de données EST au NCBI a été sondé (Avril 2015) en utilisant les étapes décrites dans le protocole 1, les écotechnologies trouvé qui étaient contiguës à l' extrémité 5 'de l' exon 2 dans Bcrp.......

Discussion

La majorité des méthodes et des résultats représentatifs présentés sont décrits dans les travaux antérieurs intitulé "B CRP1 transcription dans les testicules de souris est contrôlée par un promoteur en amont d'un premier roman exon (E1U) régulé par stéroïdogénique factor-1," qui a été publié en 2013 ⁵ . En plus des résultats représentatifs décrits ici, le document précédent a fourni des estimations de remplacement première utilisation de l'exon en utilisant la méthodologie de PCR e.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
MATÉRIEL ET KITS DE BIOLOGIE COMMERCIALE :
First Choice RLM-RACE kit	Ambion Inc., Austin, TX, actuellement disponible via Life Technologies	AM1700	5'-RACE PCR
kit TOPO TA kit de clonage	Life Technologies	K450001	Ce kit contient le TOP10 bactéries E. coli chimiquement compétentes.
T4 DNA ligase kit de ligature rapide	New England Biolabs	M2200
Faststart haute fidélité Taq- ADN polymérase	Sigma-Aldrich/Roche	3553400001/RMB-4738284001  ;	Contient un mélange d’enzymes Taq polymérase haute fidélité
Réactif de transfection d’ADN XtremeGENE HP	Roche	6366236001
Kit de dosage rapporteur à double luciférase	Promega	E1910	Comprend le vecteur rapporteur vide pGL3-basic (luciférase de luciole), le vecteur exprimant la renilla luciferase pRLTK et d’autres vecteurs de contrôle.
QIAprep	Qiagen	27104	Pour le miniprep plasmidique - isolement et purification de l’ADN plasmidique des colonies bactériennes
vecteur pCR2.1	faisant partie du kit
vecteur contenant de la luciférase pGL3 basic	Promega	E1751
pRL-TK Renilla luciferase vecteur exprimant	Promega	E2241
Chromosome artificiel bactérien	Centre de ressources BACPAC, Enfants s Hospital Oakland Research Institute, Oakland, CA	RP23-285A12 et RP24-314E24	http://bacpac.chori.org/clones.htm
REAGENTS/CHEMICALS/MEDIA/SUPPLIES
TRIzol	Life Technologies	15596026
Wizard® ; SV Gel et système de nettoyage PCR  ;	Promega	A9281	Utile pour purifier les produits PCR après digestion avec des endonucléases de restriction
CRYOVIALS	Denville Scientific	V9012
SOFTWARE :
Ensembl software	Ensembl project	http ://Ensembl.org  ;	Le projet Ensembl produit des bases de données sur le génome des vertébrés et d’autres espèces eucaryotes, et rend ces informations disponibles gratuitement en ligne.
Logiciel Blast	NCBI	http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?CMD= Web& PAGE_TYPE=Logiciel BlastHome
Primer 3	Simgene	http://simgene.com/Primer3	Utile pour la conception d’amorces pour 5'-RACE PCR
NCBI Nucleotide database	NCBI	http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/
CELL LINES :
TM4 cellules Sertoli murines	ATCC, Manassas, Virginie	CRL-1715&trade ;
INSTRUMENTS :
Luminomètre	Turner Biosystems	TD-20/20	Il s’agit d’un luminomètre manuel relativement peu coûteux. Des systèmes automatisés sont également disponibles auprès du même fabricant qui utilisent des plaques de 96 puits.
Spectrophotomètres NanoDrop	Thermo Scientific, Inc.	NanoDrop 2000	peut utiliser de très petites quantités d’échantillons, un
spectrophotomètre UV/VIS DU 800 et un logiciel d’analyse des acides nucléiques II	. BeckmanCoulter Inc, Fullerton, CA	DU 800

de clonage TOPO TALe spectrophotomètre