assistée par laser microdissection (LAM) comme outil de profilage transcriptionnel des types cellulaires individuels

Ana Marcela Florez Rueda; Ueli Grossniklaus; Anja Schmidt

doi:10.3791/53916

Article de méthode

assistée par laser microdissection (LAM) comme outil de profilage transcriptionnel des types cellulaires individuels

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DOI :

10.3791/53916

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10 mai 2016

Ana Marcela Florez Rueda¹ , Ueli Grossniklaus¹ , Anja Schmidt¹

¹University of Zürich & Zürich-Basel Plant Science Center

Dans cet article

Résumé

Nous présentons ici un protocole de microdissection assistée par laser de types spécifiques de cellules végétales pour le profilage transcriptionnel. Bien que le protocole convienne à différentes espèces et types de cellules, l’accent est mis sur les cellules hautement inaccessibles de la lignée germinale féminine importantes pour la reproduction sexuée et apomictique dans le genre de crucifères Boechera.

Résumé

La compréhension des processus de développement au niveau moléculaire nécessite des connaissances sur la régulation transcriptionnelle, et donc le transcriptome, au niveau des types de cellules individuelles. Bien que les méthodes décrites ici soient généralement applicables à un large éventail d’espèces et de types de cellules, nos recherches se concentrent sur la reproduction des plantes. La culture des plantes et la production de semences sont d’une importance cruciale pour la nutrition humaine et animale. Une compréhension détaillée des réseaux régulateurs qui régissent la formation de la lignée reproductive (germinale) et, en fin de compte, des graines est une condition préalable à la manipulation ciblée de la reproduction des plantes. En particulier, l’ingénierie de l’apomixie (reproduction asexuée par graines) dans les plantes cultivées promet de grandes améliorations, car elle conduit à la formation de graines clonales génétiquement identiques à la plante mère. Par conséquent, les types de cellules de la lignée germinale féminine sont d’une importance majeure pour la compréhension et l’ingénierie de l’apomixie. Cependant, comme les cellules correspondantes sont profondément ancrées dans les tissus floraux, elles sont très difficiles d’accès pour des analyses expérimentales, y compris la transcriptomique spécifique au type de cellule. Pour surmonter cette limitation, des sections de cellules individuelles peuvent être isolées par microdissection assistée par laser (LAM). Bien que la LAM en combinaison avec le profilage transcriptionnel permette d’identifier des gènes et des voies actifs dans tout type de cellule avec une spécificité élevée, l’établissement d’un protocole approprié peut être difficile. Plus précisément, la qualité de l’ARN obtenu après la LAM peut être compromise, en particulier lorsque de petites cellules uniques sont ciblées. Pour contourner ce problème, nous avons établi un flux de travail pour LAM qui se traduit de manière reproductible par une qualité d’ARN élevée qui convient bien à la transcriptomique, comme illustré ici par l’isolement de cellules de la lignée germinale féminine chez Boechera apomictique. Dans ce protocole, les procédures sont décrites pour la préparation des tissus et la LAM, également en ce qui concerne l’extraction de l’ARN et le contrôle de la qualité.

Introduction

Dans les études de transcription effectuées au niveau des tissus, les transcriptomes de types de cellules hautement spécialisées, mais rares sont souvent masqués par les cellules environnantes plus abondantes. Un exemple de ces types de cellules hautement spécialisées sont les cellules de la lignée de reproduction féminin (germinale) dans les plantes. La lignée germinale femelle est spécifié dans les ovules en développement, les précurseurs de graines à l' intérieur du gynécée du ^1,2 fleur. La cellule mégaspore mère (MMC) est la première cellule de la lignée germinale femelle. Il subit la méiose pour former une tétrade de mégaspores réduits. En règle g....