Article de méthode

L'analyse de cycloheximide Chase dans la dégradation des protéines

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DOI :

10.3791/53975

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18 avril 2016

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1Department of Biology, Ball State University, 2Bioproduct Research & Development, Eli Lilly and Company

Dans cet article

Résumé

L’abondance des protéines reflète les taux de synthèse et de dégradation des protéines. Cet article décrit l’utilisation de la chasse au cycloheximide suivie d’un western blot pour analyser la dégradation des protéines chez l’eucaryote unicellulaire modèle, Saccharomyces cerevisiae (levure bourgeonnante).

Résumé

Règlement de la protéine abondance est cruciale pour pratiquement tous les processus cellulaire. Abondance des protéines reflète l'intégration des taux de synthèse des protéines et la dégradation des protéines. De nombreux essais de rapports sur la protéine abondance (par exemple, un seul point de temps western blot, cytométrie en flux, la microscopie à fluorescence, ou des dosages de rapporteur basées sur la croissance) ne permettent pas la discrimination des effets relatifs de la traduction et de la protéolyse sur les niveaux de protéines. Cet article décrit l'utilisation de chasse cycloheximide suivie par western blot pour analyser spécifiquement la dégradation des protéines dans le eucaryote unicellulaire modèle, Saccharomyces cerevisiae (levure en herbe). Dans cette procédure, les cellules de levure sont incubées en présence du cycloheximide inhibiteur de la traduction. Des portions aliquotes de cellules sont prélevées immédiatement après et à des moments spécifiques après l'addition de cycloheximide. Les cellules sont lysées, et les lysats sont séparés par électrophorèse sur gel de polyacrylamide for analyse par transfert Western de protéines abondance à chaque point de temps. La procédure de poursuite de cycloheximide permet la visualisation de la cinétique de dégradation de la population de l'état d'équilibre d'une variété de protéines cellulaires. La procédure peut être utilisée pour étudier les exigences génétiques pour et les influences environnementales sur la dégradation des protéines.

Introduction

Les protéines remplissent des fonctions cruciales dans pratiquement tous les processus cellulaire. De nombreux processus physiologiques nécessitent la présence d'une protéine spécifique (ou protéines) pendant une période de temps définie ou dans des circonstances particulières. Les organismes surveillent donc et régulent l' abondance de protéines pour répondre aux besoins cellulaires 1. Par exemple, des cyclines (protéines qui contrôlent la division cellulaire) sont présents à des phases spécifiques du cycle cellulaire et la perte des niveaux de cycline réglementés a été associée à la formation de tumeurs malignes 2. En plus de la régulation des niveaux de protéines pour répondre aux besoins cellulaires, les cellules utilisent des mécanismes de contrôle de la qualité de dégradation pour éliminer un repliement des molécules de protéines unassembled, ou autrement aberrantes 3. Le contrôle de l'abondance des protéines implique la régulation à la fois la synthèse macromoléculaire (transcription et traduction) et de la dégradation (de désintégration de l'ARN et la protéolyse). la dégradation des protéines avec facultés affaiblies ou excessive contribue à de multiples pathologies, Y compris le cancer, la fibrose kystique, des maladies neurodégénératives et des troubles cardio - vasculaires 4-8. Mécanismes protéolytiques représentent donc des cibles thérapeutiques prometteuses pour une gamme de maladies 9-12.

Analyse des protéines à un seul point du temps (par exemple, par western blot 13, cytométrie en flux 14, ou la microscopie à fluorescence 15) donne un aperçu de la protéine abondance à l'état stable sans révéler la contribution relative de la synthèse ou de dégradation. De même, des dosages de rapporteur à base de croissance reflètent stables les taux de protéines de l' État sur ​​une période de temps prolongée sans discrimination entre les influences de la synthèse et la dégradation 15-20. Il est possible de déduire la contribution des processus de dégradation à des niveaux de protéines de l' état ​​d' équilibre en comparant l' abondance avant et après l' inhibition des composants spécifiques du mécanisme de dégradation (par exemple, en inactivant pharmacologiquement la proteasome 21 ou assommant un gène hypothétique d'être requis pour la dégradation 13). Un changement dans les niveaux de protéines de l' état ​​d' équilibre après l' inhibition des voies de dégradation fournit des preuves solides pour la contribution de la protéolyse au contrôle de la protéine abondance 13. Cependant, une telle analyse ne fournit toujours pas d'informations sur la cinétique de renouvellement des protéines. Chase cycloheximide suivie par western blot surmonte ces faiblesses en permettant aux chercheurs de visualiser la dégradation des protéines dans le temps 22-24. En outre, parce que la détection de la protéine suivante chase cycloheximide est généralement effectuée par Western blot, les isotopes radioactifs et les étapes d'immunoprécipitation longues ne sont pas nécessaires pour la chasse de cycloheximide, contrairement à de nombreuses techniques de chasse d'impulsions couramment utilisés, qui sont également effectuées pour visualiser la dégradation des protéines 25.

Cycloheximide a d'abord été identifié comme étant un composé anti-fongique appropriéeliens produits par les Streptomyces bactérie à Gram positif griseus 26,27. Elle est une molécule cellulaire perméable qui inhibe spécifiquement cytosoliques eucaryotes (mais pas des organites) en altérant la traduction ribosomique translocation 28-31. Dans une expérience de chasse à la cycloheximide, le cycloheximide est ajouté aux cellules, et des aliquotes de cellules sont prélevées immédiatement et à des moments spécifiques après l' addition du composé 22. Les cellules sont lysées, et l'abondance de protéines à chaque point de temps est analysé, typiquement par western blot. Des diminutions de l'abondance des protéines après l'addition de cycloheximide peuvent être en toute confiance attribuée à la dégradation des protéines. Une protéine instable va diminuer en abondance au fil du temps, tandis que d'une protéine relativement stable présentera peu de changements dans l'abondance.

Mécanismes de dégradation sélective des protéines ont été hautement conservée tout au long de Eukarya. Une grande partie de ce qui est connu à propos de la dégradation des protéines a été appris en premierle modèle eucaryote unicellulaire, Saccharomyces cerevisiae (levure de bourgeonnement) 25,32-36. Des études avec des levures sont susceptibles de continuer à fournir des idées nouvelles et importantes dans la dégradation des protéines. Une méthode pour la chasse de cycloheximide dans les cellules de levure suivie d'une analyse western blot de protéines abondance est présentée ici.

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Protocole

1. Croissance et récolte des cellules de levure

  1. Dans le cas contraire l'analyse de la cinétique de dégradation d'une protéine endogène de levure, transformer la souche (s) de levure désirée avec un plasmide codant pour la protéine d'intérêt. Des méthodes fiables pour la transformation de la levure ont été décrits précédemment 37.
  2. Inoculer levure dans 5 ml de milieu approprié (par exemple, synthétique défini (SD) milieu sélectif pour le maintien du plasmide des cellules transformées ou des levures non-sélective extrait-peptone-dextrose (YPD) moyen pour les cellules non transformées). Incuber une nuit à 30 ° C, en rotation.
    NOTE: 30 ° C est la température optimale de croissance pour de type sauvage typique des souches de laboratoire de levure 38. Cependant, parce que certaines souches de levure mutantes ne se développent pas de façon optimale à 30 ° C et certaines protéines subissent une dégradation dépendant de la température, les températures utilisées pour la croissance des cellules de levure et de poursuite de la cycloheximide doivent être déterminées empiriquement 39.
  3. Mesure ee densité optique à 600 nm (DO 600) de chaque culture d'une nuit.
    REMARQUE: Les cellules peuvent être en phase de croissance logarithmique ou stationnaire , mais aurait au minimum atteint une densité qui permet une dilution à une DO600 = 0,2 dans 15 ml de milieu frais.
  4. Diluer les cultures d'une nuit à une DO 600 valeur de 0,2 à 15 ml de milieu frais.
  5. Incuber la levure à 30 ° C, en agitant jusqu'à ce que les cellules atteignent la phase de croissance logarithmique moyenne ( par exemple, une DO600 comprise entre 0,8 et 1,2).
  6. Au cours de la croissance des cellules de levure, effectuer les opérations suivantes en préparation de la procédure de poursuite de cycloheximide:
    1. Définir un bloc chauffant qui peut recevoir 15 ml tubes coniques à 30 ° C pendant l'incubation des cellules en présence de cycloheximide. Ajouter de l'eau dans les puits du bloc thermique pour permettre une distribution efficace de la chaleur vers les cultures. Ajouter de l'eau à chaque puits de telle sorte qu'un tube conique de 15 ml provoquera le niveau d'eau monte, mais sans déborder, la lèvre du puits,.
    2. Définir un second bloc de chaleur qui peut recevoir 1,5 ml microtubes à 95 ° C pour la dénaturation des protéines suivantes lyse cellulaire.
    3. milieu de croissance frais Préchauffer (1,1 ml par point de temps par la culture à doser) à 30 ° C.
    4. Ajouter 50 ul 20x Arrêter Mix pré-étiquetés microtubes (un tube par point de temps par la culture à doser). Placer les tubes sur la glace.
      ATTENTION: L'azoture de sodium, un ingrédient 20x Arrêter Mix, est toxique par ingestion ou par contact cutané. Suivez les recommandations du fabricant lors de la préparation, le stockage et la manipulation de l'azoture de sodium. En cas d'exposition accidentelle, consulter les documents fiche de données de sécurité fournies par le fabricant.
  7. Lorsque les cellules ont atteint une croissance de mi-logarithmique, recueillir 2,5 OD 600 unités de chaque culture par point de temps à analyser (par exemple, 7,5 OD 600 unités pour analyser l' abondance de protéines à trois points de temps). Centrifugeuse recueilli les cellules dans 15 ml tubes coniques à 3,000 g à la température ambiante pendant 2 min.
    REMARQUE: une unité DO600 est égale à la quantité de levure présente dans 1 ml de culture à une DO600 de 1,0. Le volume de la culture (en ml) nécessaire pour récolter X OD 600 unités (V) peut être déterminée en utilisant l'équation suivante: V = X OD 600 unités / OD 600 mesurée. Par exemple, la récolte de 7,5 unités DO 600 de la culture de cellules de levure à une DO600 de 1,0, de recueillir 7,5 DO 600 unités / 1,0 = 7,5 ml de culture de levure.
  8. Resuspendre chaque culot cellulaire dans 1 ml de 30 ° C (préchauffée) milieu de croissance frais par 2,5 OD 600 unités de cellules (par exemple, 3 ml pour 7,5 OD 600 unités).

2. cycloheximide Chase

  1. Equilibrer suspensions de cellules de levure par incubation pendant 5 min dans le bloc C de chaleur de 30 °.
  2. Préparer une minuterie pour compter de 0:00.
  3. Pour commencer la chasse de cycloheximide, appuyez sur "Démarrer" sur la minuterie. Rapidement,mais soigneusement, procédez comme suit:
    1. Ajouter la cycloheximide à une concentration finale de 250 ug / ml à la suspension de cellules de levure (par exemple, ajouter 37,5 ul de 20 mg / ml de bouillon de cycloheximide à 3 ml de suspension cellulaire), et le vortex brièvement pour mélanger.
      ATTENTION: cycloheximide est un irritant cutané et est toxique par ingestion orale. Suivez les recommandations du fabricant lors de la préparation, le stockage et la manipulation cycloheximide. En cas d'exposition accidentelle, consulter les documents fiche de données de sécurité fournies par le fabricant.
    2. Immédiatement après l' addition de cycloheximide et tourbillonnement, transférer 950 pi (~ 2,4 unités DO 600) de la suspension de cellules de levure avec du cycloheximide ajouté à un microtube contenant préétiqueté 50 ul 20x mélange d' arrêt glacée. Vortex du tube à centrifuger et placer sur la glace jusqu'à ce que tous les échantillons ont été recueillis.
    3. Retour à la suspension de cellules de levure à 30 ° C.
  4. Répéter les étapes 2.3.1 à 2.3.3 Pour chacune des autres suspensions de cellules de levure à des intervalles de temps réguliers (par exemple, toutes les 30 secondes, de telle sorte que le cycloheximide est ajouté à l' échantillon n ° 1 à 0:00, l' échantillon n ° 2 à 0:30, l' échantillon n ° 3 à 1:00 etc.).
  5. A chaque point de temps suivant, des suspensions de cellules de levure de vortex et transfert 950 pi à microtubes étiquetés contenant 50 pi pré-réfrigérés 20x Arrêter Mix. Vortex et de placer les cellules recueillies sur la glace. Retour 15 ml tubes coniques à 30 ° C bloc de chaleur.
    1. Par exemple, pour la collecte de cellules 30 minutes après l'addition de cycloheximide (en supposant que 30 s intervalles entre l'addition de cycloheximide à des suspensions de cellules de levure au début du cours du temps), vortexer et retirer 950 pi de suspension cellulaire de l'échantillon n ° 1 à 30:00 . Répétez l'opération pour l'échantillon n ° 2 à 30:30, et ainsi de suite.
      REMARQUE: Pour empêcher la sédimentation de la levure, des suspensions de cellules de vortex dans 15 ml tubes coniques environ toutes les 5 min pendant toute la durée de la chasse. En variante, la suspension de cellules de levures peut être maintenue dans un bain d'eau en agitant de façon continue pendant toute la durée de l'expérience de chasse à la cycloheximide.
  6. Quand tous les échantillons ont été collectés, culot recueilli les cellules par centrifugation à 6500 x g à température ambiante pendant 30 sec. Retirer le surnageant par pipetage ou aspiration. Les cellules sont maintenant prêts pour la lyse alcaline. Alternativement, snap-gel cellules sédimentées dans de l'azote liquide et conserver à -80 ° C.

3. Extraction des protéines post-alcaline (Modifié à partir de 16,40)

  1. Ajouter 100 ul d'eau distillée à chaque culot cellulaire. Resuspendre par pipetage de haut en bas ou de tourbillonnement.
  2. Ajouter 100 ul de NaOH 0,2 M à chaque échantillon. Mélanger par pipetage de haut en bas ou de tourbillonnement.
  3. Incuber les cellules en suspension à température ambiante pendant 5 min. A ce stade, les cellules de levure n'a pas été lysées et les protéines ont pas été libérés 40.
  4. cellules à pellets par centrifugation à 18.000 xg à la chambre humeurature pendant 30 sec. Retirer le surnageant par pipetage ou aspiration.
  5. À lyser les cellules, ajouter 100 ul de tampon d'échantillon de Laemmli à chaque culot cellulaire. Resuspendre par pipetage de haut en bas ou de tourbillonnement.
    NOTE: incubation séquentielle de cellules avec un tampon d'échantillon libère NaOH et Laemmli protéines sous une forme compatible avec dodécylsulfate de sodium électrophorèse sur gel de polyacrylamide-sulfate (SDS-PAGE) en utilisant un système tampon de course Tris-glycine.
  6. Incuber à 95 ° C pendant 5 min pour dénaturer complètement les protéines.
    REMARQUE: L' incubation à 95 ° C ne peut pas être adapté à l' analyse des protéines qui sont sujettes à l' agrégation (par exemple, des protéines ayant plusieurs segments transmembranaires). Ces protéines peuvent devenir insolubles lorsqu'ils sont incubés à des températures élevées 41. Ainsi, pour l'analyse de ces protéines, des lysats doivent être incubées à des températures plus basses (par exemple 37 ° C - 70 ° C) pendant 10 - 30 minutes, comme déterminé de manière empirique.
  7. lysats Centrifugeuse à 18.000 xg à rotempérature om pour 1 min à pellet matière insoluble. Le surnageant (extrait protéique solubilisé) est prêt pour une séparation par SDS-PAGE et après une analyse Western Blot. Alternativement, lysats conserver à -20 ° C.

4. Représentant SDS-PAGE et de la procédure Western Blot (Adapté de 16)

  1. protéine de charge des étalons de poids moléculaire et un volume déterminé de façon empirique de lysats sur un gel SDS-PAGE.
    REMARQUE: Choisir le pourcentage d'acrylamide et de bis-acrylamide dans le gel SDS-PAGE sur la base du poids moléculaire de la protéine d'intérêt. En général, la baisse des gels de pourcentage sont mieux adaptés à la résolution de protéines de poids moléculaire élevé.
  2. Gel de fonctionner à 200 V jusqu'à ce que le front de colorant ait atteint le bord inférieur du gel.
  3. Transfert des protéines du gel au fluorure de polyvinylidène (PVDF) par virement humide à 20 V pour 60-90 min à 4 ° C.
  4. Bloquer la membrane par incubation dans du Tris-solution saline tamponnée (TBS) contenant 5% de lait écrémé, à bascule, à la température ambiante pendant 1 heure ou à 4 ° C pendant la nuit.
    Remarque: pour empêcher la croissance microbienne en présence d'une membrane incubée pendant une nuit, il est recommandé d'inclure azoture de sodium dans la solution de blocage à une concentration finale de 0,02%.
  5. Incuber membrane avec un anticorps primaire spécifique pour la protéine d'intérêt dans TBS avec 0,1% de Tween-20 (TBS / T) et 1% de lait écrémé, à bascule, à la température ambiante pendant 1 h.
  6. Laver la membrane à la température ambiante 3 x 5 min avec TBS / T, à bascule.
  7. Incuber membrane avec un anticorps secondaire approprié fluorophore conjugué dans TBS / T avec 1% de lait écrémé à température ambiante pendant 1 heure, à bascule.
    NOTE: Les fluorophores sont sensibles à la lumière. Par conséquent, des dilutions d'anticorps conjugués à des fluorophores doivent être préparées dans l'obscurité, et l' incubation de membranes en présence d'anticorps conjugués à des fluorophores et des étapes de lavage ultérieures devraient se produire dans lightproof (par exemple, une feuille enveloppée) containers.
  8. Laver la membrane à la température ambiante 3 x 5 min avec TBS / T, à bascule.
  9. membrane d'image en utilisant LI-COR Odyssey CLx et logiciel Image Studio (ou de l'équipement d'imagerie comparable et logiciel), suivant les recommandations du fabricant.
  10. Après l'acquisition de l'image de la membrane, incuber la membrane avec un anticorps primaire spécifique pour une protéine de contrôle de chargement dans TBS / T avec 1% de lait écrémé à température ambiante pendant 1 heure, à bascule.
  11. Laver la membrane à la température ambiante 3 x 5 min avec TBS / T, à bascule.
  12. Incuber membrane avec un anticorps secondaire approprié fluorophore conjugué dans TBS / T avec 1% de lait écrémé à température ambiante pendant 1 heure, à bascule.
  13. Laver la membrane à la température ambiante 3 x 5 min avec TBS / T, à bascule.
  14. Membrane d'image comme à l'étape 4.9.

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Résultats

Pour illustrer la méthodologie de poursuite de cycloheximide, la stabilité de deg1 -Sec62 (Figure 1), un modèle de levure réticulum endoplasmique (RE) dégradation -Associated (ERAD) substrat, a été analysé 42-44. Dans DGAER, des enzymes ubiquitine ligase de contrôle de qualité fixer de manière covalente des chaînes de la petite protéine ubiquitine à des protéines aberrantes localisées sur la membrane du RE. De telles protéines polyubiquitylated sont e...

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Discussion

Dans cet article, un procédé d'analyse de la cinétique de dégradation des protéines est présentée. Cette technique peut être appliquée facilement à une large gamme de protéines dégradées par une variété de mécanismes. Il est important de noter que les expériences de chasse de cycloheximide rapport sur la cinétique de dégradation de la piscine de l'état d'équilibre d'une protéine donnée. D'autres techniques peuvent être utilisées pour analyser la cinétique de la dégradation des populations spécifiques...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Les auteurs remercient les membres actuels et anciens du laboratoire Rubenstein d’avoir fourni un environnement de recherche favorable et enthousiaste. Les auteurs remercient Mark Hochstrasser (Université de Yale) pour le partage de ses réactifs et de son expertise. E.M.R. remercie Stefan Kreft (Université de Constance) et Jennifer Bruns (Université de Pittsburgh) d’avoir partagé leur expertise inestimable en analyse cinétique des protéines. Ce travail a été soutenu par une subvention des National Institutes of Health (R15 GM111713) à E.M.R., une bourse de recherche ASPiRE de l’Université Ball State à E.M.R., une bourse de recherche de la section Sigma Xi de l’Université Ball State à S.M.E., et des fonds du bureau du doyen et du département de biologie de l’Université Ball State.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Souches de levure, plasmides, milieux standard et composants
Tubes en verre borosilicaté jetablesFisher Scientific14-961-32Disponible auprès d’une variété de fabricants
Incubateur à température régulée (par exemple Incubateur Heratherm Modèle IMH180)Dot Scientific51028068Disponible auprès d’une variété de fabricants
Nouveau-Brunswick Tambour interchangeable pour tubes de 18 mm (rouleau tubulaire)Nouveau-BrunswickM1053-0450Un rouleau tubulaire est recommandé pour maintenir pendant la nuit les cultures de démarrage de cellules de levure en suspension. Alternativement, si un rouleau tubulaire n’est pas disponible, un agitateur à plate-forme dans un incubateur à température contrôlée peut être utilisé pour les cultures de démarrage de nuit. Un agitateur à plate-forme ou un rouleau tubulaire peut être utilisé pour maintenir les grandes cultures en suspension.
Nouveau-Brunswick TC-7 Roller Drum 120 V 50/60 HNouveau-BrunswickM1053-4004À utiliser avec le rouleau tubulaire
Spectrophotomètre SmartSpec PlusBio-Rad170-2525Disponible auprès d’une variété de fabricants
Centrifugeuse 5430Eppendorf5427 000.216  ;Le rotor vendu avec l’unité contient des tubes de microcentrifugation de 1,5 et 2,0 ml. Le rotor peut être remplacé par un autre qui contient des tubes coniques de 15 et 50 ml
Rotor à angle fixe F-35-6-30 avec couvercle et adaptateurs pour centrifugeuse Modèle 5430/R, tubes coniques de 15/50 ml, 6 placesEppendorfF-35-6-30
15 ml Tube à bouchon à vis sérigraphié 17 x 20 mm conique, polypropylèneSarstedt62.554.205Disponible auprès d’une variété de fabricants
Tube flexible de 1,5 ml, Tubes de microcentrifugation PCR propres et naturelsEppendorf22364120Disponible auprès d’une variété de fabricants
Radiateurs analogiques Dri-BathFisher Scientific1172011AQIl est recommandé de disposer de deux appareils de chauffage (l’un pour l’incubation des cellules pendant le traitement au cycloheximide et l’autre pour faire bouillir les lysats afin de dénaturer les protéines). Alternativement, 30 ° ; Le bain-marie C peut être utilisé pour l’incubation des cellules en présence de cycloheximide. Un bain d’eau bouillante avec plaque chauffante peut être utilisé alternativement pour dénaturer les protéines.
Bloc chauffant pour tubes coniques de 12 x 15 mlFisher Scientific11-473-70À utiliser avec le chauffage Dri-Bath pendant l’incubation de cellules en présence de cycloheximide.
Bloc chauffant pour 20 tubes coniques de 1,5 mlFisher Scientific11-718-9QÀ utiliser avec Dri-Bath Heater pour faire bouillir les lysats pour la dénaturation des protéines.
SDS-PAGE Appareils de fonctionnement et de transfert, alimentations et équipements d’imagerie ou chambres noires pour SDS-PAGE et transfert sur membraneVariera selon le laboratoire et l’application
Système d’imagerie Western blot (p. ex. Scanner Li-Cor Odyssey CLx et logiciel Image Studio)Li-Cor9140-01Variera selon le laboratoire et l’application
EMD Millipore Immobilon Membranes de transfert PVDFFisher ScientificIPFL00010Variera selon le laboratoire et l’application
Anticorps primaires ( par exemple Phosphoglycérate kinase (Pgk1) Anticorps monoclonal, souris (clone 22C5D8))LifeTechnologies459250Variera selon le laboratoire et l’application
Anticorps secondaires ( par exemple Alexa-Fluor 680 IgG anti-souris de lapin (H + L))LifeTechnologiesA-21065Variera selon le laboratoire et l’application
tampons souhaités

Références

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