L&#39;analyse de cycloheximide Chase dans la dégradation des protéines<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Résumé

L’abondance des protéines reflète les taux de synthèse et de dégradation des protéines. Cet article décrit l’utilisation de la chasse au cycloheximide suivie d’un western blot pour analyser la dégradation des protéines chez l’eucaryote unicellulaire modèle, Saccharomyces cerevisiae (levure bourgeonnante).

Résumé

Règlement de la protéine abondance est cruciale pour pratiquement tous les processus cellulaire. Abondance des protéines reflète l'intégration des taux de synthèse des protéines et la dégradation des protéines. De nombreux essais de rapports sur la protéine abondance (par exemple, un seul point de temps western blot, cytométrie en flux, la microscopie à fluorescence, ou des dosages de rapporteur basées sur la croissance) ne permettent pas la discrimination des effets relatifs de la traduction et de la protéolyse sur les niveaux de protéines. Cet article décrit l'utilisation de chasse cycloheximide suivie par western blot pour analyser spécifiquement la dégradation des protéines dans le eucaryote unicellulaire modèle, Saccharomyces cerevisiae (levure en herbe). Dans cette procédure, les cellules de levure sont incubées en présence du cycloheximide inhibiteur de la traduction. Des portions aliquotes de cellules sont prélevées immédiatement après et à des moments spécifiques après l'addition de cycloheximide. Les cellules sont lysées, et les lysats sont séparés par électrophorèse sur gel de polyacrylamide for analyse par transfert Western de protéines abondance à chaque point de temps. La procédure de poursuite de cycloheximide permet la visualisation de la cinétique de dégradation de la population de l'état d'équilibre d'une variété de protéines cellulaires. La procédure peut être utilisée pour étudier les exigences génétiques pour et les influences environnementales sur la dégradation des protéines.

Introduction

Les protéines remplissent des fonctions cruciales dans pratiquement tous les processus cellulaire. De nombreux processus physiologiques nécessitent la présence d'une protéine spécifique (ou protéines) pendant une période de temps définie ou dans des circonstances particulières. Les organismes surveillent donc et régulent l' abondance de protéines pour répondre aux besoins cellulaires ^1. Par exemple, des cyclines (protéines qui contrôlent la division cellulaire) sont présents à des phases spécifiques du cycle cellulaire et la perte des niveaux de cycline réglementés a été associée à la formation de tumeurs malignes ^2. En plus de la régula....

Protocole

1. Croissance et récolte des cellules de levure

1. Dans le cas contraire l'analyse de la cinétique de dégradation d'une protéine endogène de levure, transformer la souche (s) de levure désirée avec un plasmide codant pour la protéine d'intérêt. Des méthodes fiables pour la transformation de la levure ont été décrits précédemment ^37.
2. Inoculer levure dans 5 ml de milieu approprié (par exemple, synthétique défini (SD) milieu sélectif pour le maintien du plasmide des cellules transformées ou des levures non-sélective extrait-peptone-dextrose (YPD) moyen pour les cellules non transformées). Incuber une nuit à 30 ° C, en ro....

Résultats

Pour illustrer la méthodologie de poursuite de cycloheximide, la stabilité de deg1 -Sec62 (Figure 1), un modèle de levure réticulum endoplasmique (RE) dégradation -Associated (ERAD) substrat, a été analysé ^42-44. Dans DGAER, des enzymes ubiquitine ligase de contrôle de qualité fixer de manière covalente des chaînes de la petite protéine ubiquitine à des protéines aberrantes localisées sur la membrane du RE. De telles protéines polyubiquitylated sont e.......

Discussion

Dans cet article, un procédé d'analyse de la cinétique de dégradation des protéines est présentée. Cette technique peut être appliquée facilement à une large gamme de protéines dégradées par une variété de mécanismes. Il est important de noter que les expériences de chasse de cycloheximide rapport sur la cinétique de dégradation de la piscine de l'état d'équilibre d'une protéine donnée. D'autres techniques peuvent être utilisées pour analyser la cinétique de la dégradation des populations spécifiques.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Souches de levure, plasmides, milieux standard et composants
Tubes en verre borosilicaté jetables	Fisher Scientific	14-961-32	Disponible auprès d’une variété de fabricants
Incubateur à température régulée (par exemple Incubateur Heratherm Modèle IMH180)	Dot Scientific	51028068	Disponible auprès d’une variété de fabricants
Nouveau-Brunswick Tambour interchangeable pour tubes de 18 mm (rouleau tubulaire)	Nouveau-Brunswick	M1053-0450	Un rouleau tubulaire est recommandé pour maintenir pendant la nuit les cultures de démarrage de cellules de levure en suspension. Alternativement, si un rouleau tubulaire n’est pas disponible, un agitateur à plate-forme dans un incubateur à température contrôlée peut être utilisé pour les cultures de démarrage de nuit. Un agitateur à plate-forme ou un rouleau tubulaire peut être utilisé pour maintenir les grandes cultures en suspension.
Nouveau-Brunswick TC-7 Roller Drum 120 V 50/60 H	Nouveau-Brunswick	M1053-4004	À utiliser avec le rouleau tubulaire
Spectrophotomètre SmartSpec Plus	Bio-Rad	170-2525	Disponible auprès d’une variété de fabricants
Centrifugeuse 5430	Eppendorf	5427 000.216  ;	Le rotor vendu avec l’unité contient des tubes de microcentrifugation de 1,5 et 2,0 ml. Le rotor peut être remplacé par un autre qui contient des tubes coniques de 15 et 50 ml
Rotor à angle fixe F-35-6-30 avec couvercle et adaptateurs pour centrifugeuse Modèle 5430/R, tubes coniques de 15/50 ml, 6 places	Eppendorf	F-35-6-30
15 ml Tube à bouchon à vis sérigraphié 17 x 20 mm conique, polypropylène	Sarstedt	62.554.205	Disponible auprès d’une variété de fabricants
Tube flexible de 1,5 ml, Tubes de microcentrifugation PCR propres et naturels	Eppendorf	22364120	Disponible auprès d’une variété de fabricants
Radiateurs analogiques Dri-Bath	Fisher Scientific	1172011AQ	Il est recommandé de disposer de deux appareils de chauffage (l’un pour l’incubation des cellules pendant le traitement au cycloheximide et l’autre pour faire bouillir les lysats afin de dénaturer les protéines). Alternativement, 30 ° ; Le bain-marie C peut être utilisé pour l’incubation des cellules en présence de cycloheximide. Un bain d’eau bouillante avec plaque chauffante peut être utilisé alternativement pour dénaturer les protéines.
Bloc chauffant pour tubes coniques de 12 x 15 ml	Fisher Scientific	11-473-70	À utiliser avec le chauffage Dri-Bath pendant l’incubation de cellules en présence de cycloheximide.
Bloc chauffant pour 20 tubes coniques de 1,5 ml	Fisher Scientific	11-718-9Q	À utiliser avec Dri-Bath Heater pour faire bouillir les lysats pour la dénaturation des protéines.
SDS-PAGE Appareils de fonctionnement et de transfert, alimentations et équipements d’imagerie ou chambres noires pour SDS-PAGE et transfert sur membrane			Variera selon le laboratoire et l’application
Système d’imagerie Western blot (p. ex. Scanner Li-Cor Odyssey CLx et logiciel Image Studio)	Li-Cor	9140-01	Variera selon le laboratoire et l’application
EMD Millipore Immobilon Membranes de transfert PVDF	Fisher Scientific	IPFL00010	Variera selon le laboratoire et l’application
Anticorps primaires ( par exemple Phosphoglycérate kinase (Pgk1) Anticorps monoclonal, souris (clone 22C5D8))Life	Technologies	459250	Variera selon le laboratoire et l’application
Anticorps secondaires ( par exemple Alexa-Fluor 680 IgG anti-souris de lapin (H + L))Life	Technologies	A-21065	Variera selon le laboratoire et l’application

tampons souhaités