Coculture Assays pour étudier macrophage et microglie Stimulation de glioblastome Invasion

Résumé

Pour comprendre le comportement malin du cancer, il faut créer des modèles précis de la façon dont les cellules tumorales interagissent avec les composants du microenvironnement tumoral, tels que les macrophages. Ici, nous décrivons deux méthodes pour étudier l’interaction des cellules de glioblastome avec les macrophages associés aux tumeurs et la microglie où l’effet sur l’invasion du glioblastome est évalué.

Résumé

Le glioblastome multiforme (grade IV gliome) est un cancer très agressif humain avec une survie médiane de diagnostic 1 an après. En dépit de la meilleure compréhension des événements moléculaires qui donnent lieu à des glioblastomes, ce cancer reste encore très réfractaire au traitement conventionnel. La résection chirurgicale des tumeurs cérébrales de haut grade est rarement complète en raison de la nature hautement infiltrant des cellules de glioblastome. Les approches thérapeutiques qui atténuent l'invasion des cellules de glioblastome est donc une option intéressante. Notre laboratoire et d'autres ont montré que la tumeur des macrophages et des cellules microgliales (macrophages résidents du cerveau) stimulent fortement l'invasion de glioblastome sont associés. Le protocole décrit dans le présent document est utilisé pour modéliser le glioblastome-macrophage / microglie interaction en utilisant des tests de culture in vitro. Cette approche peut grandement faciliter le développement et / ou la découverte de médicaments qui perturbent la communication avec les macrophages qui permet à cette behav maligneIOR. Nous avons établi deux essais d'invasion de coculture robustes où microglie / macrophages stimulent l'invasion des cellules de gliome par 5-10 fois. les cellules de glioblastome marquées avec un marqueur fluorescent ou exprimant constitutivement une protéine fluorescente sont plaquées sans et avec les macrophages / microglie en polycarbonate inserts de chambre de matrice revêtue ou enrobée dans une matrice à trois dimensions. L'invasion cellulaire est évaluée en utilisant la microscopie de fluorescence à l'image et compter uniquement les cellules invasives sur le côté inférieur du filtre. L'utilisation de ces essais, plusieurs inhibiteurs pharmacologiques (JNJ-28312141, PLX3397, géfitinib et Semapimod), ont été identifiés qui bloquent les macrophages / microglie stimulé l'invasion de glioblastome.

Introduction

Le glioblastome multiforme est un cancer du cerveau humain agressif avec une survie médiane d'environ 12 mois à partir du moment du diagnostic ^1,2. Glioblastome est l'un des cancers les plus mortels et cliniquement difficile car il est réfractaire à une chimiothérapie standard et la résection chirurgicale. Le caractère diffus de glioblastome permet aux cellules tumorales de se propager dans le cerveau normal rendant la tumeur avancée pratiquement impossible de chirurgicalement réséquer complètement. Cet aspect très invasive est une caractéristique marque de glioblastome et d'autres astrocytomes avancées. Par conséquent, l'objet de beaucoup ....

Protocole

1. Le marquage fluorescent des cellules

Des lignées de cellules de glioblastome étiquettes et microglie avec des colorants fluorescents ^9: NOTE. En variante, générer des lignées cellulaires qui expriment constitutivement les protéines fluorescentes telles que la GFP / DP comme décrit dans le ^14.

1. cellules de la plaque sur une plaque à 6 puits de telle sorte qu'ils seront 70 - 80% de confluence le jour de la coloration. Pour la lignée murine de cellules de glioblastome GL261 et cellules de glioblastome ligne U87 humaine, plaque 1 x 10 ⁶ et 1,5 x 10 ⁶ cellules, respectivement sur une boîte de 6 cm 24 heu....

Résultats

En utilisant les méthodes décrites ici, nous avons montré que la microglie et les macrophages peuvent stimuler considérablement l'invasion des cellules de glioblastome. Deux tests d'invasion différents sont utilisés et sont représentés sur la figure 1. Sur la figure 2, les cellules qui expriment constitutivement GL261 la protéine fluorescente mCherry ont été étalées sur des chambres de pré-enduit avec ou sans microglie pendant 48 heures. cellules.......

Discussion

La nature hautement invasive des astrocytomes de haut grade et glioblastome rendre ces cancers du cerveau très meurtrière. Il est donc d'une importance primordiale pour comprendre les mécanismes moléculaires et cellulaires de l'invasion de glioblastome. On a beaucoup appris sur le processus de glioblastome invasion déjà ^17. En utilisant les formats d'analyse détaillés dans ce document, notre laboratoire a montré à la fois la souris et des modèles humains que les macrophages associés aux tumeurs pe.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Chambre d’invasion Corning BioCoat Matrigel : avec matrice BD Matrigel	Corning/Fisher Scientific	Chat : 354481
Milieu sans sérum de macrophage (MSFM) (500 ml)	Life Technologies	12065-074
CellTracker Red CMTPX Dye	Life Technologies/Sondes moléculaires	C34552
CellTracker Green CMFDA Dye	Life Technologies/Sondes moléculaires	C2925
Lignée cellulaire GL261	National Cancer Institute (NCI)
U87 Lignée cellulaire	American Tissue Type Culture Collection	HTB-14
THP-1 Lignée cellulaire	American Tissue Type Culture Collection	ATCC TIB-202
RPMI 1640 Medium (500 ml)	Life Technologies/Gibco	11875-093
Solution de formaldéhyde	Sigma Aldrich	F1635
Inserts de culture cellulaire à membrane polycarbonate Corning Transwell (8 & micro ; M pore) 48 par paquet.	Corning	CLS3422
Cultrex Matrice de culture 3D Facteur de croissance réduit Extrait de membrane basale, PathClear	Trevigen	3445-005-01
Sérum de veau fœtal (FBS)	Life Technologies	Cat : 10500064
Sérum bovin Albumine, fraction V, Traité par choc	thermique Fisherscientific	BP1600-100
0,5 m EDTA	ThermoFisher Scientific	15575-020
phorbol 12-myristate 13-acétate (PMA)	Sigma Aldrich	P8139-1MG