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Article de méthode

Coculture Assays pour étudier macrophage et microglie Stimulation de glioblastome Invasion

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DOI :

10.3791/53990

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20 octobre 2016

 ,  ,  , 
1New Jersey Center for Science, Technology and Mathematics, Kean University, 2Department of Physiology and Medical Physics, Royal College of Surgeons in Ireland, 3The Feinstein Institute for Medical Research at North Shore-LIJ, 4Department of Anatomy and Structural Biology, Gruss Lipper Biophotonics Center, Albert Einstein College of Medicine

Dans cet article

Résumé

Pour comprendre le comportement malin du cancer, il faut créer des modèles précis de la façon dont les cellules tumorales interagissent avec les composants du microenvironnement tumoral, tels que les macrophages. Ici, nous décrivons deux méthodes pour étudier l’interaction des cellules de glioblastome avec les macrophages associés aux tumeurs et la microglie où l’effet sur l’invasion du glioblastome est évalué.

Résumé

Le glioblastome multiforme (grade IV gliome) est un cancer très agressif humain avec une survie médiane de diagnostic 1 an après. En dépit de la meilleure compréhension des événements moléculaires qui donnent lieu à des glioblastomes, ce cancer reste encore très réfractaire au traitement conventionnel. La résection chirurgicale des tumeurs cérébrales de haut grade est rarement complète en raison de la nature hautement infiltrant des cellules de glioblastome. Les approches thérapeutiques qui atténuent l'invasion des cellules de glioblastome est donc une option intéressante. Notre laboratoire et d'autres ont montré que la tumeur des macrophages et des cellules microgliales (macrophages résidents du cerveau) stimulent fortement l'invasion de glioblastome sont associés. Le protocole décrit dans le présent document est utilisé pour modéliser le glioblastome-macrophage / microglie interaction en utilisant des tests de culture in vitro. Cette approche peut grandement faciliter le développement et / ou la découverte de médicaments qui perturbent la communication avec les macrophages qui permet à cette behav maligneIOR. Nous avons établi deux essais d'invasion de coculture robustes où microglie / macrophages stimulent l'invasion des cellules de gliome par 5-10 fois. les cellules de glioblastome marquées avec un marqueur fluorescent ou exprimant constitutivement une protéine fluorescente sont plaquées sans et avec les macrophages / microglie en polycarbonate inserts de chambre de matrice revêtue ou enrobée dans une matrice à trois dimensions. L'invasion cellulaire est évaluée en utilisant la microscopie de fluorescence à l'image et compter uniquement les cellules invasives sur le côté inférieur du filtre. L'utilisation de ces essais, plusieurs inhibiteurs pharmacologiques (JNJ-28312141, PLX3397, géfitinib et Semapimod), ont été identifiés qui bloquent les macrophages / microglie stimulé l'invasion de glioblastome.

Introduction

Le glioblastome multiforme est un cancer du cerveau humain agressif avec une survie médiane d'environ 12 mois à partir du moment du diagnostic 1,2. Glioblastome est l'un des cancers les plus mortels et cliniquement difficile car il est réfractaire à une chimiothérapie standard et la résection chirurgicale. Le caractère diffus de glioblastome permet aux cellules tumorales de se propager dans le cerveau normal rendant la tumeur avancée pratiquement impossible de chirurgicalement réséquer complètement. Cet aspect très invasive est une caractéristique marque de glioblastome et d'autres astrocytomes avancées. Par conséquent, l'objet de beaucoup de recherches a été mis sur le mécanisme moléculaire de l'invasion des cellules de glioblastome. Le microenvironnement glioblastome tumorale joue un rôle essentiel dans l' établissement d'une tumeur maligne 3-6. Tumeur associée macrophages / microglie se sont révélés être responsable de la promotion glioblastome invasion 7,8. La plupart de ces études ont cependant mesuré l'effet des macrophages / microglie utilisantdes essais qui les séparent physiquement à partir des cellules de glioblastome. Notre laboratoire a défini pour générer des tests améliorés qui nous permettent d'étudier la façon dont l'invasion de glioblastome dépend de macrophages / microglie dans cocultures et nous permettent à l'image de l'interaction physique entre eux lors de l'invasion.

tests classiques pour mesurer l'invasion des cellules comprennent les Boyden chimiotaxie "standard" de la chambre et les formats de chemoinvasion. Ici, les cellules à étudier sont plaquées dans une chambre en matière plastique qui contient un filtre en polycarbonate sur le fond qui comporte des pores d'une taille donnée (généralement comprise entre 0,4 et 8 um de diamètre). Le processus d'invasion cellulaire implique une barrière physique, habituellement composé de protéines de la matrice extracellulaire. Dans l'essai de chemoinvasion, la matrice utilisée est préférée Matrigel (ci-après dénommée «matrice»), un mélange de protéines de la matrice extracellulaire sécrétée par Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) des cellules de sarcome de souris et se compose essentiellement de colType lagen IV et la laminine. Les chambres sont ensuite placées dans une culture bien de tissu qui contient des milieux de culture de cellules avec ou sans facteurs de croissance qui sont soupçonnés de stimuler l'invasion. Les cellules qui ont une capacité d'invasion ultérieure va envahir à travers la matrice extracellulaire filtre revêtu à une fréquence supérieure et adhèrent à la face inférieure du filtre. Nous avons modifié cet essai afin d'évaluer le rôle de la microglie et des macrophages associés à une tumeur sur l'invasion des cellules de glioblastome.

Nous avons été en mesure de déterminer en utilisant des tests de coculture décrits dans le présent document que les microglies peuvent stimuler l'invasion de deux lignées de cellules de glioblastome par 5-10 fois 9,10. Cela reflète ce que l'on observe dans les modèles animaux de glioblastome. En outre, nous avons développé un essai de trois invasion dimensions où les interactions entre les cellules de glioblastome et les macrophages / microglie peuvent être examinés plus directement. L'étendue de l'invasion des cellules stimulées par le glioblastome macrophaGes / microglie dans le test 3D est comparable à ce qui est vu en utilisant l'approche de la chambre de matrice recouverte. Des essais similaires ont déjà été mis au point pour étudier les interactions de carcinome du sein avec les macrophages lors de l' invasion 11-13. Les deux procédés décrits dans le présent document devraient contribuer à la capacité à disséquer les mécanismes moléculaires (s) de macrophages / microglies invasion stimulée par des cellules de glioblastome.

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Protocole

1. Le marquage fluorescent des cellules

Des lignées de cellules de glioblastome étiquettes et microglie avec des colorants fluorescents 9: NOTE. En variante, générer des lignées cellulaires qui expriment constitutivement les protéines fluorescentes telles que la GFP / DP comme décrit dans le 14.

  1. cellules de la plaque sur une plaque à 6 puits de telle sorte qu'ils seront 70 - 80% de confluence le jour de la coloration. Pour la lignée murine de cellules de glioblastome GL261 et cellules de glioblastome ligne U87 humaine, plaque 1 x 10 6 et 1,5 x 10 6 cellules, respectivement sur une boîte de 6 cm 24 heures avant la coloration.
  2. Préparer la solution de colorant fluorescent tache de cellules dans du DMSO et ajouter 5 uM de colorant aux médias, soit rpmi (RPMI) ou macrophage milieu sans sérum (MSFM), vortex bien.
  3. Incuber les cellules avec le colorant pendant 30 min à 37 ° C et 5% de CO 2.
  4. Retirez le support contenant des colorants et ajouter du milieu frais (RPMI ou MSFM) aux cellules.
  5. Incuber les cellules pendant 30 min. Note: Les cellules sont désormaisteinté et prêt à être utilisé dans l'expérience.

2. Dosage prélaqué Matrice chambre coculture Invasion

  1. Différencier cellules THP-1 en utilisant l' acétate de phorbol myristate (PMA) 15.
    1. Planche 2 - 3 x 10 5 cellules THP-1 dans 1,5 ml de RPMI / 10% de FBS dans une plaque de culture 6 puits. Immédiatement après le placage ajouter 100 nM de PMA et incuber à 37 ° C, 5% de CO2 pendant 48 heures.
      NOTE: Après 48 h, THP-1 cellules qui ont subi avec succès la différenciation seront adhérentes et se propager au fond du puits prenant une morphologie ronde.
    2. Retirer PMA par lavage une fois avec PBS 1x et remplacer avec des produits frais RPMI / 10% de FBS. Attendre une autre 48 heures jusqu'à ce que les cellules sont prêtes à l'emploi dans le test.
  2. Equilibrer la matrice des chambres de pré-revêtues en les plaçant dans un puits contenant 500 ul de milieu seul (sans sérum) et en ajoutant 500 ul de milieu seul vers le haut. Incuber les chambres pendant 2 heures à 37 ° C et 5% de CO 2.
    NOTE: chambres pré-revêtues ont été achetées auprès du fabricant; voir le tableau des matériaux / équipement.
  3. Pour les cellules (lignées cellulaires de glioblastome marquées par fluorescence et les microglie / macrophages) détacher doucement, retirer les supports des cellules par aspiration. Laver les cellules sur le plat avec 2 mM EDTA / PBS. Ajouter 500 ul de 2 mM d' EDTA / PBS et incubation pendant 5 - 10 min dans un incubateur de cellules à 37 ° C et 5% de CO 2.
  4. Resuspendre les cellules dans 5 ml de milieu contenant 0,3% de sérumalbumine bovine (BSA).
  5. Centrifuger pendant 5 min à 120 x g.
  6. Aspirer le surnageant et remettre en suspension le culot dans MSFM / 0,3% de milieu de BSA (pour les cellules de GL261 et la microglie) ou RPMI / 0,3% de SAB (pour U87 et cellules THP-1) , de telle sorte que la concentration des cellules est égale à 1 x 10 6 cellules / ml . Utilisez un hémocytomètre pour compter les cellules.
  7. Ajouter 500 ul media / 0,3% de BSA par puits de plaque à 24 puits.
  8. Retirez le support de chambres qui ont été équilibrées pendant au moins 2 h (étape 2.2). Lieu chambers en puits contenant 500 ul media / 0,3% de BSA (étape 2.7).
  9. Si les inhibiteurs sont utilisés pour étudier leur effet sur macrophage / microglie stimulé l'invasion de gliome, ajouter la concentration appropriée à la fois le fond et les parties supérieures de la chambre.
    NOTE: Les concentrations de CSF-1R inhibiteur utilisé pour inhiber totalement la microglie stimulée GL261 glioblastome invasion peut être trouvée dans la référence 9.
  10. Selon les lignées cellulaires utilisées, ajouter des cellules à la chambre supérieure comme décrit dans les deux étapes suivantes: glioblastome de la souris (2.10.1) et glioblastome humain (2.10.2).
    1. Mélanger 1,5 x 10 5 GL261 (glioblastome) cellules (150 pi) et 5 x 10 4 microglies de souris (50 pi) (voir l' étape 2.6 pour plus de détails dans les médias). Amener le volume à 500 pi en ajoutant 300 ul MSFM / 0,3% de BSA. Ajouter le mélange de cellules dans la chambre supérieure et faire incuber à 37 ° C, 5% de CO2 pendant 48 heures.
      NOTE: microglie murin sont isolées à partir de souris néonatales comme décrit in 1 6.

Mélanger 7,5 x 10 4 U87 (glioblastomes) des cellules (75 pi) et 2,5 x 10 4 THP1 (macrophage) des cellules (25 pi). Amener le volume dans 500 ul en ajoutant 400 pl RPMI / 0,3% de BSA. Ajouter le mélange de cellules à la chambre supérieure. Incuber les cellules à 37 ° C, 5% de CO2 pendant 24 heures.

  1. Après incubation, éliminer les cellules du haut de la chambre par aspiration douce et fixer des chambres en plaçant dans 3,7% de formaldéhyde dans du PBS. Les chambres permettent de rester dans un fixatif pendant 15 min à température ambiante (ou pendant une nuit à 4 ° C). Retirer fixateur par aspiration douce et le remplacer par 500 ul 1x PBS. Passez à la section 4 pour l'analyse d'image.
    NOTE: L'expérience peut être interrompue à ce moment et enregistré pour l'imagerie dans PBS 1x. des signaux de colorant fluorescent peut être détectée pendant jusqu'à 2 semaines après la fixation.

3. Invasion Assay "3D" -embedding gliome et Macrophages / microglie dans Matrix

  1. Décongeler mélange de matrice à 4 ° C pendant une nuit. Effectuer toutes autres manipulations à l'aide de la matrice sur la glace dans la hotte.
  2. Préparer 10 mg / ml de concentration de la matrice dans les médias (MSFM ou RPMI) avec 0,3% de BSA sur la glace.
    NOTE: la concentration du stock de matrice est généralement autour de 15 mg / ml.
  3. Pour préparer les cellules (marquées à l'étape 1) de suspension dans la matrice, retirer les supports des cellules par aspiration. Laver les cellules sur le plat avec 2 mM EDTA / PBS. Ajouter 500 ul de 2 mM d' EDTA / PBS aux cellules et incuber pendant 5 - 10 min dans un incubateur à 37 ° C et 5% de CO 2.
  4. Resuspendre les cellules dans 5 ml de milieu contenant 0,3% de BSA.
  5. Centrifuger pendant 5 min à 120 x g.
  6. Aspirer le surnageant de pastille. Resuspendre le culot dans du milieu / 0,3% de BSA , de telle sorte que la concentration des cellules est égale à 1 x 10 6 cellules / ml. Utilisez un hémocytomètre pour compter les cellules.
  7. Ajouter 1,5 x 10 5 cellules GL261 (dans 150 ul) + 5 x 10 4 cellules microgliales (dans 50 ul) dans un tube de 1,5 ml.Ajouter 2 x 10 5 cellules GL261 (200 pi) dans un tube de 1,5 ml microfuge séparé.
    NOTE: les cellules GL261 seul sans microglie sert de contrôle.
  8. cellules de spin dans microcentrifugeuse pendant 5 min à 120 x g.
  9. Resuspendre les cellules dans 200 pi matrice froide sur la glace.
  10. 50 ul de la plaque (50.000 cellules) sur le centre du compartiment supérieur de la chambre 8 pm de taille de pore insert.
  11. Incuber à 37 ° C pendant 30 minutes pour la polymérisation de se produire.
  12. Ajouter du milieu sans sérum 200 ul de la chambre supérieure et contenant un milieu de croissance cellulaire 700 ul de sérum dans le puits inférieur.
  13. Incuber à 37 ° C, 5% de CO2 pendant 48 heures.
  14. Après incubation, éliminer les cellules du haut de la chambre par aspiration douce et fixer des chambres en plaçant dans 3,7% de formaldéhyde dans du PBS. Les chambres permettent de rester dans un fixatif pendant 15 min à température ambiante (ou pendant une nuit à 4 ° C). Retirer fixateur par aspiration douce et le remplacer par 500 ul 1x PBS. Passez à la section 4 foanalyse de l'image r.

4. Imagerie Assays

  1. Retirer les chambres de 3,7% de formaldéhyde et laver à puits contenant 500 ul frais 1x PBS.
    REMARQUE: Ne laissez pas les chambres à sécher.
  2. L'aide d'un coton-tige, nettoyer doucement les cellules non-invasives de la partie supérieure du filtre (côté tourné vers l'intérieur de la chambre), en grattant la surface du filtre. Commencez doucement et augmenter progressivement la pression. Pour ce faire, au moins 3 fois par chambre.
  3. Placez chambres soit dans un plat à fond de verre ou de laisser dans une plaque 24 puits.
  4. Placer l' échantillon sur la scène d'un épifluorescence ou laser confocal microscope à fluorescence équipé d' une caméra et la capture d' image logiciel 9,10.
  5. Prenez plusieurs 10X ou 20X images de champs représentatifs.
  6. En utilisant un logiciel d'analyse d'image, comme ImageJ, compter le nombre de cellules de glioblastome qui ont traversé le filtre sur le côté inférieur 9,10.
  7. Si l'imagerie de la "3D. "Essai d'invasion (décrit dans la section 3), générer une série Z de pile à l' aide d' un laser fluorescent microscope confocal 5-6 Pour l' image de la population cellulaire invasive sur la face inférieure du filtre, suivez les étapes du protocole 04/02 à 04/06 décrit ci - dessus.

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Résultats

En utilisant les méthodes décrites ici, nous avons montré que la microglie et les macrophages peuvent stimuler considérablement l'invasion des cellules de glioblastome. Deux tests d'invasion différents sont utilisés et sont représentés sur la figure 1. Sur la figure 2, les cellules qui expriment constitutivement GL261 la protéine fluorescente mCherry ont été étalées sur des chambres de pré-enduit avec ou sans microglie pendant 48 heures. cellules...

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Discussion

La nature hautement invasive des astrocytomes de haut grade et glioblastome rendre ces cancers du cerveau très meurtrière. Il est donc d'une importance primordiale pour comprendre les mécanismes moléculaires et cellulaires de l'invasion de glioblastome. On a beaucoup appris sur le processus de glioblastome invasion déjà 17. En utilisant les formats d'analyse détaillés dans ce document, notre laboratoire a montré à la fois la souris et des modèles humains que les macrophages associés aux tumeurs pe...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Nous tenons à remercier le Dr Konstantin Dobrenis d’avoir fourni une microglie murine pour ces études.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Chambre d’invasion Corning BioCoat Matrigel : avec matrice BD MatrigelCorning/Fisher ScientificChat : 354481
Milieu sans sérum de macrophage (MSFM) (500 ml)Life Technologies12065-074
CellTracker Red CMTPX DyeLife Technologies/Sondes moléculairesC34552
CellTracker Green CMFDA DyeLife Technologies/Sondes moléculairesC2925
Lignée cellulaire GL261National Cancer Institute (NCI)
U87 Lignée cellulaireAmerican Tissue Type Culture CollectionHTB-14
THP-1 Lignée cellulaireAmerican Tissue Type Culture CollectionATCC TIB-202
RPMI 1640 Medium (500 ml)Life Technologies/Gibco11875-093
Solution de formaldéhydeSigma AldrichF1635
Inserts de culture cellulaire à membrane polycarbonate Corning Transwell (8 & micro ; M pore) 48 par paquet.CorningCLS3422
Cultrex Matrice de culture 3D Facteur de croissance réduit Extrait de membrane basale, PathClearTrevigen3445-005-01
Sérum de veau fœtal (FBS)Life TechnologiesCat : 10500064
Sérum bovin Albumine, fraction V, Traité par chocthermique FisherscientificBP1600-100
0,5 m EDTAThermoFisher Scientific15575-020
phorbol 12-myristate 13-acétate (PMA)Sigma AldrichP8139-1MG

Références

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Réimpressions et autorisations

Mots-clés

Stimulation des macrophagesCoculture de microglieEssai in vitroMicroscopie fluorescenceInvasion cellulaireDiff renciation des THP 1Chambres rev tues de matriceInhibiteurs pharmacologiquesMicroenvironnement tumoral
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