Ici, nous décrivons une méthode de microscopie à intervalle de temps à long terme pour suivre longitudinalement des cellules uniques en réponse à des traitements anticancéreux.
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Article de méthode
Through the Looking Glass: Time-lapse Microscopie et le suivi longitudinal des cellules individuelles pour l'étude Therapeutics Anti-cancer
Dans cet article
Résumé
Résumé
La réponse des cellules individuelles aux médicaments anti-cancer contribue de manière significative dans la détermination de la réponse de la population, et est donc un facteur important dans le résultat global. Immunoblotting, la cytométrie en flux et les expériences cellulaires fixes sont souvent utilisés pour étudier comment les cellules répondent aux médicaments anti-cancéreux. Ces méthodes sont importants, mais ils ont plusieurs lacunes. Variabilité dans les réponses de la drogue entre le cancer et les cellules normales, et entre les cellules d'origine du cancer différents, transitoires et réponses rares sont difficiles à comprendre en utilisant des tests population de moyenne et sans être en mesure de suivre et de les analyser longitudinalement directement. Le microscope est particulièrement bien adapté à des cellules vivantes d'image. Les progrès réalisés dans la technologie permettent de routinière les cellules d'image à une résolution qui permet non seulement le suivi des cellules, mais également l'observation d'une variété de réponses cellulaires. Nous décrivons une approche en détail qui permet l'imagerie en continu time-lapse deles cellules au cours de la réponse à un médicament pour l'essentiel aussi longtemps que souhaité, typiquement jusqu'à 96 h. Utilisation de variations de l'approche, les cellules peuvent être surveillés pendant des semaines. Avec l'emploi des codés génétiquement biocapteurs fluorescents de nombreux processus, les voies et les réponses peuvent être suivies. Nous montrons que des exemples comprennent le suivi et la quantification de la croissance cellulaire et la progression du cycle cellulaire, la dynamique des chromosomes, des lésions de l'ADN et la mort cellulaire. Nous discutons également des variations de la technique et de sa flexibilité, et mettre en évidence certains pièges courants.
Introduction
La microscopie des cellules vivantes et le suivi longitudinal des cellules individuelles ne sont pas une nouvelle technique. Dès les premiers microscopes, les amateurs et les scientifiques ont observé et étudié des cellules individuelles et les organismes, leurs comportements, et le développement 1-3. Un exemple célèbre de la fin David Rogers à l' Université Vanderbilt dans les années 1950 montre un neutrophile humaine dans un frottis sanguin chassant une bactérie Staphylococcus aureus et éventuellement le processus de phagocytose 4. Ce film live-cellule est une excellente illustration de la façon dont les processus multiples peuven....
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Protocole
Le protocole suivant utilise des paramètres définis par les expériences sur les figures 4 et 6 en ce qui concerne les paramètres d'acquisition et les conditions expérimentales. Bon nombre de ces paramètres peuvent être modifiés pour adapter d' autres expériences (c. -à- temps d'exposition, binning, canaux fluorescents, etc.). Toutes les procédures doivent respecter les directives et les règlements institutionnels et être approuvé par le comité de biosécurité institutionnelle. sites fabricant de Microscope contiennent d'excellentes informations pour l'imagerie des cellules vivantes.
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Résultats
À long terme de la microscopie time-lapse et le suivi longitudinal directe permet l'étude de nombreux effets anti-cancer pendant la réponse aux médicaments. Après les grandes lignes de la figure 1, plusieurs exemples de cellules sont présentés exprimant reporters fluorescents validés traités avec des médicaments anti-cancéreux, suivis et analysés en utilisant des approches différentes.
Phase microscopie à .......
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Discussion
Avantages de Time-lapse Microscopie et le suivi longitudinal
Le microscope est un instrument idéal pour des études longitudinales de la réponse aux médicaments car il permet aux enquêteurs de suivre les cellules individuelles et leurs destins ainsi que l'ensemble de la population. Variabilité dans la réponse aux médicaments au sein d'une population de cellules est un enjeu majeur pour la conception thérapeutique anti-cancer. Le suivi longitudinal des.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.
Remerciements
Nous remercions Joshua Marcus pour son soutien technique et Jolien Tyler, Ph.D., directrice de la plateforme de microscopie optique Richard J. McIntosh, pour ses conseils techniques. Ce travail a été soutenu par des fonds de l’Université du Colorado à Boulder et de l’Université du Colorado à Boulder Graduate School à J.D.O. R.T.B. est partiellement soutenu par une subvention de formation pré-doctorale du NIH (T32 GM008759). Nous remercions Karyopharm Therapeutics, Inc. pour le selinexor et Merck Serono pour l’inhibiteur de la kinésine-5. Les plasmides FUCCI proviennent d’Atsushi Miyawaki (RIKEN, Japon) via MTA. mCherry-BP1-2 provenait d’Addgene. HeLa exprimant H2b-mCh....
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Taxol (paclitaxel) | Sigma | T7191 | médicament stabilisateur des microtubules |
| Etoposide | Selleckchem | S1225 | inhibiteur de la topoisomérase II |
| Selinexor | Karyopharm Therapeutics | na | XPO1/CRM1 inhibiteur, cadeau |
| Inhibiteur de la kinésine-5 | Merck Serono | na | cadeau, également disponible auprès de American Custom Chemicals Corporation. CAS 858668-07-2 |
| Milieu de croissance cellulaire | HyClone (Fisher) ou Mediatech | de nombreuses entreprises disponibles | |
| 5 % de CO2/air d’équilibre, certifié | Airgas | Z03NI7222004379 | |
| Antenne de 35 mm, fond en verre de 20 mm | Cellvis | D35-20-1.5-N | de nombreuses entreprises disponibles |
| Antenne de 35 mm à 4 puits, fond en verre de 20 mm | Cellvis | D35C4-20-1.5-N | de nombreuses entreprises disponibles |
| Antenne parabolique de 35 mm, fond en verre quadrillé | MatTek | P35G-2-14-CGRD | de nombreuses entreprises disponibles |
| Multi-puits, fond en verre | Cellvis | P12-1.5H-N | de nombreuses entreprises disponibles |
| Olympus IX81 microscope à épifluorescence inversée | Olympus Olympus | ||
| Olympus IX2-UCB contrôleur | Olympus | ||
| PRIOR LumenPro200 | Prior Scientific | Lumen200PRO | |
| PRIOR Platine motorisée Proscan III | Prio Scientific | H117 | |
| Chambre STEV | InVivo Scientific | STEV. ÉCU. HC5 STAGE TOP | |
| Unité de contrôle de l’environnement | InVivo Scientific | STEV. ÉCU. HC5 STAGE TOP | |
| Hamamatsu ORCA R2 CCD avec contrôleur | Hamamatsu | C10600 | |
| Nikon Eclipse Ti | Nikon | ||
| Nikon lancement laser | Nikon | ||
| SOLA light engine | lumencor | ||
| iXon Ultra 897 EM-CCD | ANDOR ; | ||
| CHAMBRE D’INCLUBATION TOKAI HIT | TOKAI HIT | TIZSH |
Références
- Abercrombie, M., Heaysman, J. E., Pegrum, S. M. The locomotion of fibroblasts in culture I. Movements of the leading edge. Exp Cell Res. 59, 393-398 (1970).
- Abercrombie, M., Heaysman, J. E. Obser....
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Réimpressions et autorisations
