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Time-lapse Extended Imagerie intravitale du temps réel multicellulaire Dynamics dans le microenvironnement de la tumeur

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DOI :

10.3791/54042

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12 juin 2016

 ,  ,  , 
1Department of Anatomy & Structural Biology, Albert Einstein College of Medicine, 2Department of Radiology, Albert Einstein College of Medicine, 3Gruss-Lipper Biophotonics Center, Albert Einstein College of Medicine, 4Integrated Imaging Program, Albert Einstein College of Medicine

Dans cet article

Résumé

Ce protocole décrit l'utilisation de la microscopie multiphotonique pour effectuer prolongée imagerie time-lapse d'interactions multicellulaires en temps réel, in vivo à la résolution d'une seule cellule.

Résumé

Dans le microenvironnement tumoral, les cellules stromales de l’hôte interagissent avec les cellules tumorales pour favoriser la progression tumorale, l’angiogenèse, la dissémination des cellules tumorales et les métastases. Les interactions multicellulaires dans le microenvironnement tumoral peuvent entraîner des événements transitoires, notamment la motilité directionnelle des cellules tumorales et la perméabilité vasculaire. La quantification de la perméabilité vasculaire tumorale a souvent utilisé des expériences finales pour mesurer l’extravasation des colorants vasculaires. Cependant, en raison de la nature transitoire des interactions multicellulaires et de la perméabilité vasculaire, la cinétique de ces événements dynamiques ne peut pas être discernée. En marquant les cellules et le système vasculaire avec des colorants injectables ou des protéines fluorescentes, la microscopie intravitale à haute résolution a permis de visualiser directement et en temps réel les événements transitoires dans le microenvironnement tumoral. Nous décrivons ici une méthode d’utilisation de la microscopie multiphotonique pour effectuer une imagerie intravitale étendue chez des souris vivantes afin de visualiser directement la dynamique multicellulaire dans le microenvironnement tumoral. Cette méthode détaille les stratégies de marquage cellulaire, la préparation chirurgicale d’un lambeau de peau mammaire, l’administration de colorants ou de protéines injectables par cathéter de veine caudale et l’acquisition d’images en time-lapse. Les séquences time-lapse obtenues à partir de cette méthode facilitent la visualisation et la quantification de la cinétique des événements cellulaires de motilité et de perméabilité vasculaire dans le microenvironnement tumoral.

Introduction

Dissémination des cellules tumorales de la tumeur mammaire primaire a été montré que des cellules tumorales implique non seulement, mais les cellules hôtes stromales, y compris les macrophages et les cellules endothéliales. En outre, le système vasculaire tumoral est anormale avec une augmentation de la perméabilité. Ainsi, la détermination de la façon dont les cellules tumorales, les macrophages et les cellules endotheliales interagissent pour médier la perméabilité vasculaire et intravasculaire de cellules tumorales dans le microenvironnement de la tumeur primaire est importante pour la compréhension des métastases. La compréhension de la cinétique de la perméabilité vasculaire, intravasculaire de cellules tumorales et le mécanisme de signalisation sous-jacente des interactions multicellulaires dans le microenvironnement tumoral peut fournir des informations cruciales dans le développement et l'administration des traitements anti-cancéreux.

Le moyen principal de l' étude de la perméabilité vasculaire tumorale in vivo a été la mesure des colorants extravasculaires tels que le bleu d' Evans 2, les dextrans de haut poids moléculaire (155 kDa)3 et fluorophore ou des protéines de radiotraceurs conjugués (y compris l' albumine) 4 en des points fixes de temps après l' injection du colorant. Les progrès de la microscopie, des modèles animaux et des colorants fluorescents ont permis la visualisation des processus cellulaires et la perméabilité vasculaire chez les animaux vivants par microscopie intravitale 5.

Imagerie animale en direct avec l'acquisition d'images statiques ou de courtes séquences time-lapse sur plusieurs points de temps ne permet pas à la compréhension complète des événements dynamiques dans le microenvironnement de la tumeur 6,7. En effet, l' acquisition d'image statique au cours de 24 heures a montré que le système vasculaire tumoral est non étanche, mais la dynamique de la perméabilité vasculaire n'a pas été observée 6. Ainsi, l'imagerie en continu prolongé le temps écoulé jusqu'à 12 heures capture la cinétique d'événements dynamiques dans le microenvironnement tumoral.

Ce protocole décrit l'utilisation de longue time-lapse multiphotla microscopie intravitale pour étudier les événements dynamiques multicellulaires dans le microenvironnement tumoral. plusieurs types de cellules dans le microenvironnement tumoral sont marquées avec des colorants injectables ou en utilisant des animaux transgéniques exprimant des protéines fluorescentes. Au moyen d'un cathéter veine de la queue des colorants ou des protéines vasculaires peuvent être injectées après le début de formation d'image pour acquérir des données d'événements cinétique multicellulaires dans le microenvironnement tumoral. Pour l'imagerie des cellules vivantes de la tumeur mammaire est exposée à travers la préparation chirurgicale d'un lambeau de peau. Les images sont acquises jusqu'à 12 heures en utilisant un microscope multiphoton équipé de tubes photomultiplicateurs multiples (PMT) détecteurs 8. À l'aide de filtres appropriés, un algorithme de soustraction permet de 4 détecteurs pour acquérir PMT 5 signaux fluorescents dans le microenvironnement tumoral simultanément 9. La microscopie à haute résolution multiphotonique intravitale capture seule résolution cellulaire imagerie des interactions tumeur-stroma dans le microenvironnement de la tumeur, ce qui conduit à une meilleure uCOMPRENDRE de la perméabilité vasculaire et des cellules tumorales intravasation 10-13. Plus précisément, l' imagerie intravitale révélés très localisés, les accidents vasculaires transitoires étendues de perméabilité sélective qui se produisent au niveau des sites d'interaction entre une cellule tumorale, un macrophage et une cellule endothéliale (défini comme le microenvironnement tumoral des métastases, TMEM 14) 13. En outre, intravasculaire de cellules tumorales se produit uniquement à TMEM et est spatialement et temporellement corrélée avec la perméabilité vasculaire 13. résolution cellulaire unique de la dynamique de ces événements a été rendue possible grâce à l'utilisation de longue time-lapse multiphoton microscopique des cellules marquées par fluorescence dans le microenvironnement de la tumeur.

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Protocole

Toutes les procédures décrites doivent être effectuées conformément aux directives et réglementations relatives à l'utilisation des animaux vertébrés, y compris l'approbation préalable de l'Albert Einstein College of Medicine Institutional Animal Care et utilisation Comité.

1. Génération de fluorescence Tumeurs Labellisées et Macrophages associés aux tumeurs

  1. Générer des cellules tumorales marquées par fluorescence en traversant le autochthonous modèle spontané, une souris transgénique mammaire cancer , où le virus de la tumeur longue répétition terminale mammaire de la souris entraîne l'antigène polyome du milieu T (MMTV PyMT) avec des souris transgéniques avec des rapporteurs fluorescents [ à savoir, une meilleure fluorescente verte protéines (EGFP), amélioré la protéine fluorescente cyan (ECFP) ou Dendra2] 8,9.
  2. Macrophages de l' étiquette par fluorescence chez les animaux PyMT avec marquées par fluorescence des cellules tumorales par le croisement des modèles de souris génétiquement modifiées avec des journalistes fluorescents spécifiques myeloid- et macrophages [ie, MacGreen 15 ou souris MacBlue CSF1R -GAL4VP16 / UAS-ECFP 16].
  3. En variante, de générer des tumeurs marquées par fluorescence par la transplantation orthotopique de cellules marquées par fluorescence (PyMT tumorales syngéniques), de lignées cellulaires de cancer du sein humain ou de tumeurs primaires patient humain dérivées (11,17) xénogreffes.
    1. Implant marqué par fluorescence des cellules tumorales dans des souris syngéniques PyMT avec des cellules myéloïdes de la protéine marquée par fluorescence pour générer des animaux avec des cellules tumorales marquées par fluorescence et les cellules myéloïdes 13.
  4. Injecter 100 ul de 10 mg / kg fluorescent 70 kDa dextran par voie intraveineuse (iv) veine de la queue des souris déficit immunitaire combiné sévère (SCID) avec des tumeurs de xénogreffes de lignées cellulaires humaines ou de tumeurs primaires provenant de patients à macrophages d'étiquettes par fluorescence 2 heures avant le début de l'imagerie intravitale.

2. Installation de Microscope et imagerie Préparation

Remarque: Cette procédure décrit la mise en placepour l' imagerie intravitale sur un microscope multiphoton 8.

  1. Allumez tous microscope laser et composants, y compris les lasers à deux photons et les détecteurs.
  2. Mettre en marche le moteur de chauffage à 30 ° C pour préchauffer la scène. Cette étape est essentielle pour le maintien de la température physiologique de l'animal.
  3. Pour une utilisation sur un microscope inversé lieu l'insert de scène sur mesure sur la platine du microscope. L'insert personnalisé est une feuille de 1/8 "aluminium épais usiné pour tenir dans l'espace d'insertion de la scène et avec un diamètre de 1" trou traversant dans le centre d'imagerie.
    1. Essuyez la platine du microscope et l'insert de scène avec 70% d'éthanol et de l'air sec.
    2. Placez une grosse goutte d'eau sur le NA objectif 20X, 1,05 microscope pour maintenir le contact optique avec le verre de protection.
    3. verre Lieu de couverture (# 1.5 d'épaisseur) sur le port d'imagerie sur l'insert de platine du microscope. Fixez en place avec du ruban adhésif de laboratoire.
    4. Utilisez un poinçon pour percer un trou x 2 cm 2 cmdans un tampon de caoutchouc flexible et placez le coussin en caoutchouc sur la platine du microscope avec le trou dans le tampon aligné avec le trou dans l'insert de scène personnalisée.

3. Préparation de la veine de la queue Catheter et réactifs pour injection lors de l'imagerie

  1. Couper une longueur de 30 cm de polyéthylène (PE) tubes.
  2. En utilisant des pinces, déplacer l'aiguille métallique d'un G aiguille 31 avant et en arrière jusqu'à ce qu'il se détache du raccord en plastique.
  3. En utilisant des pinces, insérer l'extrémité émoussée de l'aiguille détaché dans le tube PE.
  4. Insérer une aiguille de calibre 31 dans l'autre extrémité du tuyau en PE.
  5. Remplir une seringue de 1 cc avec du phosphate stérile saline tamponnée (PBS) et l'insérer dans le G aiguille 31 et rincer tout l'air du tube et de l'aiguille avec du PBS. PBS est utilisé pour maintenir l' hydratation et l' osmolarité du sang 9,18, une solution saline isotonique , mais peut également être utilisé.
  6. Remplir une seringue de 1 ml avec 200 ul de 3 mg / kg 155 kDa dextrane tétraméthylrhodamine (TMR) Ou des points quantiques pour l'étiquetage vasculaire.
  7. Préparer toutes les autres protéines injectables tel qu'un isoforme de 165 acides aminés de facteur de croissance de l' endothélium vasculaire A (VEGFA 165) dans une seringue de 1 ml et placer sur de la glace. Injecter 0,2 mg / kg VEGFA 19 165 à une concentration de 0,05 mg / ml.

4. Insertion de la queue Indwelling Vein Catheter

  1. Placer l'animal sous anesthésie à l' aide d' une chambre d'induction avec 5% d' isoflurane avec O 2 en tant que gaz porteur.
  2. Transférer la souris pour la plate-forme chirurgicale une fois qu'il est complètement anesthésié et ne répond pas à une pincée d'orteil.
  3. Ligne ouverte de l'isoflurane à la plate-forme chirurgicale, fermer la ligne d'anesthésie à la chambre d'induction et placez le cône de nez sur le museau de l'animal. Réduire l'isoflurane de 5% à 2,5%.
  4. Appliquer une pommade ophtalmique pour les yeux de la souris pour prévenir la sécheresse pendant l'anesthésie.
  5. Chauffer l'animal sous la lampe chauffantependant 2 min pour augmenter la circulation dans la queue que la circulation ralentit avec l'anesthésie profonde.
  6. Stériliser la souris veine de la queue avec 70% d'éthanol.
  7. Insérer la pointe du G aiguille du cathéter construit dans la section 3 dans la veine caudale latérale de l'animal 31 et pousser l'aiguille dans 2-3 mm.
  8. Tirez sur la seringue pour voir le sang, assurant le cathéter est placé dans la veine de la queue.
  9. Utilisez une longueur de 1 cm de ruban de laboratoire placé sur l'aiguille pour maintenir l'aiguille en place parallèlement à la veine le long de la longueur de la queue.

5. Flap de la peau Procédure chirurgicale pour exposer la tumeur mammaire

  1. Avec l'animal sur la plate-forme chirurgicale tamponner la tumeur et la surface ventrale avec 70% d'éthanol. Remarque: Comme indiqué, ce procédé n'a pas été complètement exécutée de manière aseptique. Pour les sessions d'imagerie longues où l'infection peut devenir un facteur de confusion, il est recommandé d'utiliser une technique aseptique appropriée.
  2. Utilisation de steriLe forceps, soulever la peau ventrale et avec des ciseaux stériles faire une incision sous-cutanée le long de la ligne médiane ventrale d'environ 1 cm de longueur. Évitez de perforer le péritoine lors de l'incision.
  3. couper en douceur le tissu conjonctif fixation de la glande mammaire et la tumeur loin du péritoine pour exposer la tumeur mammaire.
  4. Avec des ciseaux et des pinces, retirez délicatement et couper le fascia et la graisse de la surface exposée de la tumeur tout en préservant l'intégrité de la vascularisation de la tumeur et de minimiser les saignements. Cette étape est essentielle pour le maintien de l'architecture de la tumeur et le système vasculaire d'alimentation de la tumeur.

6. Préparation des animaux pour Microscopie

  1. Transférer l'animal au stade d'imagerie préchauffée avec la tumeur exposée placée sur la lamelle couvre-objet sur l'insert de phase au-dessus de l'objectif du microscope pour l'imagerie. Prenez soin de transférer le cathéter dans la veine caudale doucement avec l'animal afin de ne pas déloger l'aiguille.
  2. La place enez e anesthésie cône sur le museau de l'animal pour maintenir ensemble l'anesthésie à 3% d'isoflurane.
  3. Positionner l'animal de telle sorte que la tumeur repose dans le trou de la garniture en caoutchouc et en contact avec la lamelle couvre-objet en verre.
  4. Utilisez deux tampons en caoutchouc pour tenir doucement la tumeur en place et les fixer à la platine du microscope avec du ruban de laboratoire pour réduire le mouvement lors de l'acquisition d'image.
  5. Remplir la chambre du coussin en caoutchouc avec du PBS pour maintenir le tissu hydraté et maintenir le contact optique avec la lamelle.
  6. Commencez à surveiller les signes vitaux de l'animal avec une sonde d'oxymètre de pouls. Fixer un capteur à pince à la cuisse de l'animal. En variante, un collier qui est configuré pour s'adapter autour du cou peut être utilisé.
  7. Placer la boîte de chauffage au- dessus de l'animal pour maintenir 30 ° C 20.
  8. diminuer progressivement le niveau de l'isoflurane à 0,5-1% pour maintenir l'anesthésie et de maintenir le flux sanguin.

Acquisition et Injection de Fluoresc 7. imageent Colorants et protéines injectables

  1. Mise au point à l'aide du microscope oculaire sur les cellules tumorales fluorescentes sur la surface de la tumeur.
  2. Sélectionnez une zone d'intérêt en trouvant des zones où affluent les vaisseaux sanguins. La sélection d'une zone d'intérêt avec écoulement des vaisseaux sanguins est essentielle pour l'évaluation de la vascularisation tumorale.
  3. Une fois qu'une région d'intérêt a été sélectionné commuter le microscope en mode multiphotonique d'imagerie.
  4. Fixer les limites supérieure et inférieure d'une série Z. Régler la limite supérieure de la z-série en utilisant le réglage de mise au point pour déplacer l'objectif à l'emplacement de départ souhaité et en cliquant sur le bouton de position Z "Top". Déterminer la limite supérieure de la série Z en visualisant le réseau de fibres de collagène à la surface de la tumeur dans le canal de génération de second harmonique (SHG) et en observant en l'absence de cellules, mais seules les fibres de collagène sont visibles.
    1. Réglez la limite inférieure de la z-série en déplaçant l'objectif à la profondeur d'imagerie désirée (typically 50-150 um) et en cliquant sur la position Z bouton "Bas".
    2. Définissez la taille de l'étape en tapant la valeur souhaitée dans le champ de taille de pas. Déterminer la taille de l'étape fondée sur des considérations de résolution et le temps d'acquisition (généralement de 2 pm est utilisé pour la reconstruction 3D de haute résolution et 5 um autrement).
  5. Définissez l'intervalle time-lapse par le passage à l'écran Time-Lapse et en entrant le temps écoulé désiré dans le champ Time-Lapse. Pour une résolution temporelle optimale définir l'intervalle de temps de 0 sec pour l'imagerie en continu. Remarque: Pour une longue imagerie time-lapse il est recommandé de définir l'intervalle de temps de 10 secondes entre les acquisitions pour reconstituer le liquide d'immersion objectif.
  6. Une fois les paramètres pour l'imagerie ont été déterminés, injecter lentement 155 kDa dextran-TMR.
    1. Retirez la seringue avec du PBS dans le cathéter veine de la queue et le remplacer par la seringue contenant 155 kDa dextran-TMR en prenant soin de ne pas introduire de bulles dans le line.
    2. Lentement injecter 155 kDa dextran-TMR dans la souris, avec un volume maximum de 200 pi, et remplacer la seringue avec une seringue contenant du PBS. ÉTAPE CRITIQUE: Effectuer l'injection lentement et prendre des précautions pour éviter d'avoir une solution en dehors de la veine.
  7. Démarrer l'acquisition de la Z-stack imagerie time-lapse en cliquant sur les boutons Time-Lapse Z-Stack et de les appuyer et puis en cliquant sur le bouton d'enregistrement.
  8. Si d' autres dextranes fluorescents, à savoir, isothiocyanate 10 kDa dextran-fluorescéine (FITC), ou des protéines, à savoir, VEGFA 165, ont été préparés à l' avance, les injecter après le début de l' acquisition d'images pour au = 0 min début.
    1. Retirez la seringue avec du PBS dans la veine cathéter de queue et le remplacer par la seringue contenant 10 kDa dextran-FITC ou VEGFA 165 en prenant soin de ne pas introduire de bulles dans la ligne.
    2. Injecter lentement injectables dans la souris à travers le cathéter dans la veine caudaleet remplacer la seringue avec une seringue contenant du PBS.
  9. Chaque 30 à 45 minutes, injecter lentement 50 ul de PBS ou de solution saline pour maintenir l'hydratation de l'animal.

8. euthanasie

  1. A la fin de l'acquisition d'images, euthanasier l'animal.
    1. Augmenter le isoflurane à 5%.
    2. Gardez l'animal de moins de 5% d'isoflurane jusqu'au 30 sec après qu'il cesse de respirer et enlever l'animal de la scène.
    3. Effectuer la dislocation cervicale pour assurer l'euthanasie complète.

Traitement 9. Image

  1. Acquérir des images à des fichiers TIFF 16 bits pour chaque canal individuel à chaque point de temps et économiser de manière séquentielle.
  2. Effectuer la séparation de chevauchement spectral (c. -à- GFP et PCP), l' élimination de la dérive xy et la génération de films à partir de séquences de time-lapse en utilisant des méthodes établies dans ImageJ 9. Effectuer 3D reconstructions de surface des images à haute résolution 13.

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Résultats

La microscopie Extended time-lapse intravitale permet seule résolution cellulaire imagerie des processus multicellulaires dans le microenvironnement de la tumeur. Par les cellules tumorales marquage par fluorescence, les macrophages, l'espace vasculaire et de visualiser le réseau de fibres de collagène en utilisant le deuxième signal de génération d'harmoniques, de multiples compartiments dans le microenvironnement tumoral sont simultanément suivis au cours de l'imagerie. Les...

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Discussion

les interactions cellulaires qui se produisent spontanément dans le microenvironnement tumoral peut conduire à des modifications de la motilité des cellules tumorales et intravasculaire. Haute résolution intravitale imagerie du tissu tumoral en temps réel permet de visualiser la dynamique multicellulaire qui peut être très 10,13,24 transitoire. Point final dans des essais in vivo ou images time-lapse acquises avec des points de temps discrets peuvent fournir des informations essentielles sur...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n'ont rien à dévoiler.

Remerciements

Cette recherche a été soutenue par le programme d'imagerie intégrée Programme de recherche sur le cancer du sein Département de la Défense sous le numéro d'attribution (ASH, W81XWH-13-1-0010), NIH CA100324, CA100324 PPG, et.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
155 kDa dextran-tétraméthylrhodamine isothiocyanateSigma AldrichT1287reconstituent à 20 mg/ml dans 1x PBS
70 kDa dextran-TexasRed Life TechnologiesD-1830reconstituent à 10 mg/ml dans 1x PBS
10 kDa dextran-fluorescéine isothyocyanateSigma AldrichFD10Sreconstituent à 20 mg/ml dans 1x PBS
Qdot 705 ITK Amino (PEG) Quantum DotsLife TechnologiesQ21561MPDiluer 25 μ ; l sur 175 μ ; l de 1x PBS pour injection
MMTV-PyMT sourisJackson Laboratory2374
Csf1r-ECFP souris (Csf1r-Gal4/VP16,UAS-ECFP)Jackson Laboratory26051
Csf1r-EGFPsouris Jackson Laboratory18549
1x PBSLife Technologies
Isoethesia (isoflurane)Henry Schein Animal Health50033Seringue de 250 ml
OxygenAirTech
de 1 ml, embout à tuberculineBD309659
30 G x 1 (0,3 mm x 25) mm) aiguilleBD305128
Polyéthylène micro tube médical  ;Scientific Commodities IncBB31695-PE/10,28 mm de diamètre intérieur x 0,64 mm de diamètre extérieur
Verre de protection pour microscopeCorning2980-225épaisseur 1,5, 22 x 50 °C ; mm
PhysioSuite MouseOxymètre de pouls STAT, logiciel et capteursKent Scientific
Fisher Scientific159015R
tampon en caoutchouc soupleMcMaster-Carr8514K62Film de polyuréthane ultra-doux, 3/16" Épais, 12 po x 12 po, duromètre 40 oo,
dos uni Tampon en caoutchouc durMcMaster-Carr8568K615Feuille de caoutchouc néoprène haute résistance 1/4 po d’épaisseur, 12 po x 12 po, 50 po ; Un microscope durométrique
OlympusLe microscope est un microscope multiphotonique à deux lasers construit sur mesure, basé sur un support Olympus IX-71 utilisant un objectif 20X 1.05NA.
de 7 poinçonsMcMaster-Carr3429A12Diamètre de trou de 1/4 » à 1 », pour perforatrice à percussion
Ruban de laboratoire Jeu

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Mots-clés

Microscopie multiphotoniquePerm abilit vasculaireImagerie time lapseMarquage cellulaireLambeau cutan mammaireExtravasation de dextranMarquage aux bo tes quantiques

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