Article de méthode

Stencil micromodelage des pluripotentes humaines Cellules souches pour Probing Organisation spatiale des Différenciation Fates

DOI :

10.3791/54097

⸱

17 juin 2016

 ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, National University of Singapore, 2Singapore Institute of Neurotechnology (SINAPSE), National University of Singapore

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les cellules souches pluripotentes humaines (hPSCs) ont la capacité intrinsèque de différencier et d'auto-organisation dans des modèles de tissus distincts; bien que cela nécessite la présentation des gradients environnementaux spatiales. Nous présentons stencil micromodelage comme une méthode simple et robuste pour générer des gradients biochimiques et mécaniques pour le contrôle des motifs de différenciation HPSC.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les cellules souches pluripotentes humaines (hPSC), y compris les cellules souches embryonnaires et les cellules souches pluripotentes induites, ont la capacité intrinsèque de se différencier en trois couches germinales. Cela en fait une source cellulaire attrayante pour la médecine régénérative et la modélisation expérimentale de l’organogenèse normale et malade. Cependant, la différenciation des hPSC in vitro est hétérogène et spatialement désordonnée. Les technologies de microstructuration cellulaire offrent potentiellement les moyens de contrôler spatialement les microenvironnements de cellules souches et d’organiser les destins de différenciation qui en résultent. Le micropatterning des hPSC doit prendre en compte les exigences strictes de survie et de maintenance des hPSC. Ici, nous décrivons le micropatterning au pochoir comme une méthode hautement compatible avec les hPSC. Les micromotifs hPSC sont spécifiés par les géométries des trous traversants du pochoir cellulaire, qui limitent physiquement les endroits où les hPSC peuvent accéder et se fixer au substrat sous-jacent recouvert d’une matrice extracellulaire. En raison de ce mode de fonctionnement, il est plus flexible d’utiliser des substrats capables de soutenir adéquatement les hPSC par rapport à d’autres méthodes de micropatterning cellulaire. Nous soulignons également les étapes critiques pour la génération réussie de micromodèles hPSC. À titre d’exemple, nous démontrons que la microstructuration au pochoir des hPSC peut être utilisée pour moduler la polarisation spatiale des adhésions cellule-cellule et cellule-matrice, ce qui détermine à son tour les modèles de différenciation du mésoendoderme. Cette méthode simple et robuste de micropatterning des hPSC élargit les perspectives d’établissement de modèles expérimentaux pour étudier l’organisation et la structuration des tissus au cours du développement embryonnaire précoce.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les cellules humaines pluripotentes de troncs (hPSCs), y compris les cellules souches embryonnaires (CSEh) et induites des cellules souches pluripotentes (de hiPSCs), sont largement exploités dans la médecine régénérative ainsi que la modélisation expérimentale de l'organogenèse normaux et malades en raison de leur potentiel de différenciation en lignées cellulaires de tous trois couches de germe 1,2. Les destins de différenciation des hPSCs sont très sensibles à des facteurs environnementaux locaux qui peuvent moduler les processus de mécanotransduction autocrine ou de signalisation 1 paracrines ainsi que médiées par des indices physiques 3-5. Cellule micromodelage englobe un ensemble de techniques qui ont été développées pour organiser spatialement la géométrie et l' emplacement d'une population de cellules comme un moyen de contrôler le microenvironnement cellulaire local, tels que les interactions cellule-cellule 6 et interactions cellule-matrice 3. Dans le contexte de hPSCs, micromodelage cellulaire a été utilisé pour acquérir des connaissances importantes sur la façon dont niche dépendentsignalisation autocrine ent modulant CSEh décisions pluripotence-différenciation 7 et de l' organisation dans des schémas de différenciation embryonnaires 6. 2D et 3D hPSCs microélectrodes ont été utilisées pour contrôler la taille des colonies multicellulaires de motifs, ce qui a influencé les décisions de différenciation dans les trois couches de germe 8,9. Nous avons employé micropatterns HPSC multicellulaires pour moduler l'ampleur de la cellule-cellule et les interactions cellule-matrice au sein d' une colonie HPSC pour sonder la façon intégrine E-cadhérine diaphotie peut donner lieu à devenir cellulaire hétérogène 10. Les démonstrations des rapports ci - dessus ouvrent de nouvelles avenues vers l'application de micropatterns multicellulaires de hPSCs comme modèles expérimentaux pour le dépistage de la toxicité des médicaments pour les maladies de développement 11, pour étudier l'effet des facteurs de croissance et des hormones pendant les tissus ou le développement des organes, et à démêler la formation de des motifs de tissus.

Une myriade de micropatter cellulairetechniques ning ont été développés comme examinés par Falconnet et. al. , 12 mais seulement une poignée, comme les micro-impression par contact 7,8,13, la culture de micropuits 14,15, photopatterning 6 et microstencils 16 ont été mises en œuvre avec succès avec hPSCs. Le défi avec hPSCs de micromodelage réside dans leur vulnérabilité et une exigence stricte des matrices spécifiques extracellulaires (ECM) et des conditions de croissance pour la fixation et la survie cellulaire. Pour les modèles 2D HPSC, l' impression micro-contact est l' une des méthodes les plus courantes pour générer micropatterns HPSC sur culture de tissus et de verre substrats 13. La méthode peut être utilisée pour modèle ECM commun utilisé dans la culture HPSC, y compris la laminine et la membrane basale matrices, comme Matrigel. Cependant, elle nécessite généralement un procédé de revêtement en deux étapes aidé par Poly-D-Lysine, et a besoin de conditions atmosphériques et d' humidité inertes spécifiques pour rendre micropatterns ECM stables pour hPSCs pour fixer sur 6,13. La première considération de chaque méthode de micromodelage est de savoir si le régime de modification de surface peut générer des motifs d'ECM HPSC-adhésives à la résolution géométrique souhaitée, tout en minimisant l'attachement des cellules non spécifiques aux zones environnantes.

Nous rapportons ici l'utilisation du pochoir micromodelage comme une méthode simple pour générer micropatterns HPSC sans étapes de modification de surface supplémentaires avant la génération de modèles ECM adhésifs pour hPSCs pour fixer sur. Le pochoir de cellules se compose d'une membrane mince, par exemple, les huiles polydiméthylsiloxanes (PDMS) en feuilles, avec micron au millimètre taille des trous traversants fermés sur un substrat de culture de cellules pour contenir physiquement les revêtements de l' ECM et hPSCs ensuite ensemencés. Pochoir comme motif fonctionne en empêchant physiquement l'endroit où HPSC peut accéder et fixer directement sur le substrat enduit sous-jacent ECM, cette méthode est compatible avec différents substrats qui peuvent supporter des cultures HPSC. Les seuls requirement est que le choix du matériau de pochoir peut former un joint réversible avec le substrat. Ces substrats comprennent le polystyrène classique de culture tissulaire (EPTC) 17, des substrats conjugués ligand 18, ainsi que des substrats élastomères avec une rigidité réglable (par ex., Le PDMS) 19. Cette méthode permet également le revêtement d'ECM différents, tels que la vitronectine (ou protéine VTN), la laminine et les matrices de la membrane basale (par exemple Matrigel et Geltrax) pour permettre la fixation et la différenciation des hPSCs appropriée. configurations ECM-substrat Par conséquent, nous pouvons transférer optimisés pour une ligne HPSC spécifique au pochoir micromodelage pour optimiser la cellule-matrice adhérence, la survie et la différenciation. Récemment, une méthode similaire a également été signalé pour diriger la différenciation hépatique par CSEh micromodelage utilisant le poly (méthacrylate de méthyle) (PMMA) des réseaux de micro-pochoirs 16.

pochoirs cellulaires peuvent être fabriqués à partir de matériaux différents, y compris rempliesals 20,21, le poly (p-xylylène) les polymères 22,23, PMMA 16 et le plus souvent, le PDMS 24-28. Le silicium et le poly (p-xylylène) polymères pochoirs nécessitent la gravure directe des trous traversants avec des équipements spécialisés 20-23, ce qui limite leur accessibilité aux utilisateurs biologiques. PDMS pochoirs peuvent être fabriqués par différentes méthodes en fonction de la taille de la fonction requise, ce qui est généralement compris entre 3 um à 2000 um 11,26-29. Si de petites caractéristiques sont souhaitées, de minces feuilles de pochoir peuvent être produites par moulage à la presse PDMS de pré-polymère sur un gabarit de silicium micro - usiné comportant des reliefs de micromotifs 28. Pour connaître les caractéristiques> 1000 um, un cutter laser CO 2 offre une méthode simple et peu coûteux de réduire directement les motifs sur une feuille PDMS pré-coulé lors de pochoir fabrication. La recyclabilité des pochoirs PDMS rend également rentable de mener une série d'expériences avec une consistance suffisante.

Ici, nous présentons la méthodologie détaillée pour la fabrication d'un pochoir de PDMS avec 1000 um caractéristiques par découpe laser et la génération de micropatterns CSEh. Ces micropatterns hESC ont été utilisés pour moduler l'ampleur de l' intégrine et la E-cadhérine au sein médiées adhérences une colonie de hESC cohérente afin d'étudier la façon dont la polarisation spatiale de l' adhésion cellulaire a entraîné le destin des cellules 10 hétérogénéité.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Protocole

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NOTE: Ce protocole décrit la fabrication de PDMS pochoir avec 1000 um modèles par découpe au laser et micromodelage de la ligne de CSEh, H9 utilisant le pochoir PDMS.

1. Conception et fabrication de PDMS Stencil pour micromodelage

  1. Concevoir la feuille de pochoir avec trous traversants de la géométrie désirée et la taille (par exemple, 1000 pm cercles) et le joint de pochoir à l' aide du logiciel conception assistée par ordinateur 10.
  2. Laser-coupé la feuille de pochoir et joint sur ​​120-150 um et 2 mm d' épaisseur polydiméthylsiloxane (PDMS) feuilles en utilisant respectivement un laser CO 2-coupe 10.
  3. Bond du joint PDMS avec la feuille stencil PDMS utilisant PDMS liquides non durcies et cuire au four à 60 ° C pendant 3-4 heures pour obtenir le pochoir de PDMS pour micromodelage.
  4. Stériliser le pochoir PDMS par autoclavage à 120 ° C pendant 30 min et séchage dans un four avant l'utilisation.

2. CSEh principaltenance

  1. Culture des lignées de CSEh dans un milieu d'entretien sans alimentation-sur 1 × matrice revêtu membrane basale des plaques de culture cellulaire de CSEh qualifié à 37 ° C et 5% de CO 2.
  2. Passage des hESC quand ils sont d'environ 70% de confluence par 3 minutes d'incubation à 37 ° C avec le traitement et la dispase dissociant mécaniquement les colonies de hESC en touffes 100-200 um. Plate les touffes CSEh à une densité de 30-50 touffes par 9,6 cm 2 de surface de croissance sur la membrane basale matrice revêtue de culture tissulaire en polystyrène au rapport 1: 6 de fendage.

3. Stencil micromodelage des embryons humains Cellules souches

  1. Préparation avant la cellule de motif
    1. Sceller un pochoir de PDMS sur un plat de 60 mm de Pétri en distribuant 700 pi 70% d'éthanol de qualité analytique dans l'eau ultrapure dans la boîte de Pétri et placer le pochoir sur le dessus.
    2. Placez la boîte de Pétri à l'intérieur de la biosécurité armoire pendant la nuit pour laisser til éthanol sec.
    3. Vérifier aucune bulle existe sous le pochoir pour faire en sorte que le pochoir forme une bonne étanchéité avec la boîte de Pétri. Ceci permet d'éviter les fuites de solution de revêtement ECM. Sceller la boîte de Pétri et de stocker dans des conditions stériles jusqu'à ce qu'il soit prêt pour l'ensemencement des cellules.
    4. Préparer des aliquotes de la matrice de la membrane basale CSEh qualifié selon le certificat d'analyse. Veiller à ce que chaque aliquote rendements 1 x solution de CSEh qualifié membrane basale matrice lorsqu'il est dilué dans 25 ml de milieu de Eagle modifié Dulbecco: mélange nutritif F-12 (DMEM / F12) selon la fiche produit du fabricant.
    5. Préparer la solution de revêtement de l'ECM en ajoutant une aliquote de la matrice de la membrane basale CSEh qualifié dans 16,7 ml de DMEM / F12 pour faire 1,5 x solution de matrice membrane basale CSEh-qualifié. Gardez toute la solution de revêtement ECM sur la glace pour empêcher la gélification.
    6. Supplément milieu d'entretien de CSEh avec un inhibiteur de ROCK uM 10 (Y27632).
  2. ECM revêtement sur ​​le substrat stenciled
    1. Traiter la boîte de Pétri avec 100 WO 2 plasma pendant 90 secondes. Pour assurer la stérilité, seulement ouvrir le couvercle de la boîte de Pétri à l'intérieur de la chambre à plasma avant le traitement au plasma, et rapidement la couverture arrière de la boîte de Petri après la fin du traitement. Ceci facilite le mouillage de surface et empêche la formation de bulles d'air dans le micro motif de trous traversants au cours de l'addition d'une solution de revêtement ECM.
    2. Ajouter 450 ul de 1,5 x solution de matrice de la membrane basale CSEh-qualifié pour couvrir l'ensemble du pochoir. Sceller la boîte de Petri avec un film auto-soudable, par exemple du Parafilm, afin d'empêcher la solution de sécher, et incuber pendant 5 heures à 37 ° C avant utilisation.
  3. CSEh Semis sur le substrat stenciled
    1. Examiner les colonies de CSEh en plaque de 6 puits pour identifier les zones de cellules différenciées montrant la perte de la morphologie des CSEh typique (par exemple, la perte d'arrondi, bien Packed morphologie épithéliale, haut noyau rapport / cytoplasme avec des nucléoles proéminents). Retirer les régions différenciées en utilisant un aspirateur à vide.
    2. Laver deux fois avec 2 ml de DMEM / F12 par puits.
    3. Ajouter 1 ml d'enzymes digestives, telles que Accutase par puits d'une plaque à 6 puits et incuber à 37 ° C pendant 8 min. Appuyez doucement la plaque pour détacher toutes les colonies du substrat.
    4. Rincer chaque puits avec au moins 4 ml de DMEM / F12 par 1 ml d'enzymes digestives et récupérer la suspension cellulaire dans 15 ml de tube conique.
    5. Centrifuger la suspension cellulaire à 200 x g pendant 3 min à température ambiante.
    6. Aspirer pour éliminer le surnageant et ajouter 400 ul de milieu d'entretien de CSEh complété avec un inhibiteur de ROCK (Rocki) pour remettre en suspension les cellules. Introduire à la pipette la suspension de cellules vers le haut et vers le bas 3 fois doucement pour casser des touffes dans des cellules individuelles.
    7. Mélanger le seul puits de suspension de cellules et on dilue 10 pi d'échantillons de cellules dans 190 ul de DMEM / F12 (dilution 1:20). Utilisez un hemocytometer pour déterminer la densité des cellules dans la suspension cellulaire stock.
    8. Calculer la densité d'ensemencement des cellules requises pour un pochoir donné.
      REMARQUE: par exemple, on a déterminé expérimentalement la densité d'ensemencement des cellules pour obtenir une monocouche confluente de cellules individuelles est d' environ 4.444 cellules / mm 2. Ainsi, un gabarit d'une surface de 450 mm 2 et du volume d'ensemencement de 400 ul nécessitera une suspension cellulaire à une densité de 2 millions de cellules / 400 ul.
    9. Diluer la suspension cellulaire stock à la densité ensemencement nécessaire (voir étape 3.3.8 NOTE) avec un milieu de culture de CSEh complété par Rocki.
    10. Ajouter un volume désigné d'une suspension cellulaire contenant le nombre de cellules dans chaque pochoir et laisser la boîte de Petri non perturbé dans la hotte pendant 5 min à température ambiante pour permettre aux cellules de se déposer.
    11. Transférer la boîte de Petri dans l'incubateur et incuber pendant 1 heure pour permettre la fixation des cellules. Prenez soin de garder le niveau de boîte de Pétri pendant laProcédé transfert de telle sorte que les cellules restent en monocouche dans le pochoir.
  4. Retrait Stencil et de passivation du substrat sans motif
    1. Examinez la boîte de Pétri sous un microscope pour vérifier si les cellules sont correctement fixés sur le substrat sous-jacent.
    2. Aspirer à une distance de la suspension de cellules à partir du gabarit.
    3. Ajouter 2 ml / boîte de culture cellulaire de 0,5% de tensioactif non ionique compatible DMEM / F12 à la zone entourant le pochoir.
    4. Utilisez une paire de pinces autoclavées à peler délicatement le pochoir. Tourbillonner la solution d'agent tensio-actif non ionique dans le pochoir est enlevée pour empêcher les cellules de se dessécher. Visuellement observer les cellules microélectrodes dans la boîte de Pétri.
    5. Incuber les cellules microélectrodes en non-ionique solution tensio-DMEM / F12 0,5% pendant 10 min à 37 ° C.
    6. Aspirer loin la solution non-ionique / F12 surfactant-DMEM. Laver 3 fois avec 2 ml / plat de DMEM / F12.
    7. Ajouter 2 ml / plat de CSEhun milieu d'entretien complété par Rocki et incuber à 37 ° C pendant une nuit.
    8. Après incubation pendant une nuit, le milieu d'entretien aspirât hESC additionné de Rocki, laver une fois avec du DMEM / F12 et d'induire la différenciation des mesoendoderm par addition de 2 ml / boîte de milieu de différenciation supplémenté avec 100 ng / ml d'activine, 25 ng / ml de BMP4 et 10 ng / FGF2 ml .
    9. Évaluer micromotifs en utilisant l' imagerie par contraste de phase et calculer les profils d'intensité moyenne Brachyury (T) pour chaque motif 8 , comme décrit précédemment.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Résultats

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dans cet article, nous décrivons la fabrication d'un pochoir de cellule en utilisant un cutter laser pour générer 1000 um caractéristiques. Le pochoir est composé de 2 parties: une feuille de pochoir mince (environ 100-200 um d'épaisseur) contenant le Microdétail trous traversants, et un joint de PDMS pour contenir la solution de revêtement ECM ou d'une suspension cellulaire. Ici, 127 um et 2 mm d'épaisseur des feuilles PDMS disponibles dans le commerce ont été utilisés comme la feuille ...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fabrication de pochoirs micromodelage

micromodelage Stencil fournit une méthode idéale pour générer micropatterns HPSC pour enquêter sur niche médiée différenciation patterning. L'avantage principal du pochoir formation de motifs par rapport aux autres techniques de micromodelage, telles que l'impression par microcontact et photopatterning, est qu'il ne nécessite pas de modification de la surface et peut être mis en oeuvre sur des substrats EPTC classiqu...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs ont aucun intérêt financier concurrents.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce travail est soutenu par NUS Démarrez subvention (R-397-000-192-133) et le Fonds Gap LPTE (R-397-000-198-592). GS est un érudit NUS Research. Les auteurs tiennent à remercier le Dr Jiangwa Xing pour son soutien technique sur micromodelage cellulaire.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
  ; Feuille PDMS de 2 mm d’épaisseurSpecialty Silicone Products Inc., USASSPM823-.005Utilisé pour former un réservoir pour pochoir
120-150 &mu ; m feuille PDMS épaisseSpecialty Silicone Products Inc., USASSPM823-.040Utilisé pour former le pochoir  ;
Boîte de Pétri de 60 mmNunc Nunclon Delta150326Substrat pour la microstructuration
AccutaseAccutase, Merck Millipore, SingapourSCR005Enzyme pour décomposer les cellules H9 en cellules uniques
Activin  ;   ;R& D Systems, Singapour338-AC-010Facteur de croissance pour la différenciation H9
BMP4  ;R& D Systems, Singapour338-BP-010Facteur de croissance pour la différenciation H9
Système plasma  ;Femto Science, CoréeCUTE-MPPour l’oxydation plasmatique du pochoir
DispaseStemCell&trade ; Technologies, Singapour7923Enzyme utilisée pour affaiblir l’adhésion cellule-ECM lors du passage
DMEM/F12GIBCO, USA11330032Milieu basal pour cellules H9
FGF2R& D Systems, Singapour233&ndash ; FB&ndash ; 025Facteur de croissance pour la différenciation H9
Lignée cellulaire H9WiCell Research Institute, Inc., États-UnisWA09Cellules souches embryonnaires humaines
Matrice de membrane basale qualifiée hESCMatrigel, BD Biosciences, Singapour354277Revêtement de matrice extracellulaire pour soutenir la croissance des cellules H9
Microscope inverséLeica Microsystems, SingapourDMi1Pour la capture en fond clair images
Découpeuse laserEpilog Helix 24 SystèmeUtilisé pour générer des trous traversants dans la feuille PDMS
mTeSR&trade ; 1 Medium  ;StemCell&commerce ; Technologies, Singapour5850Milieu de maintenance pour cellules H9
PDMS  ;SYLGARD® ; 184, Dow Corning Co., États-Unis3097358-1004Utilisé pour coller le pochoir PDMS et le réservateur
ROCKi Y27632Calbiochem, Merck Millipore, Singapour688000Maintient les cellules H9 en tant que cellules uniques  ;
STEMdiff&trade ; APEL&�� ; moyen  ;StemCell&commerce ; Technologies, Singapour5210Milieu de différenciation pour cellules H9
Film de polyéthylène téréphtalateSureMark SingaporeSQ-6633Utilisé pour former un pochoir  ;
Tensioactif non ionique compatible avec la culture cellulaireAcide pluronique F-127, Sigma, SingapourP2443Réactif passivant pour repousser l’adhésion cellulaire dans les substrats non micropatternés
laser

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Graf, T., Stadtfeld, M. Heterogeneity of embryonic and adult stem cells. Cell Stem Cell. 3 (5), 480-483 (2008).
  2. Nishikawa, S., Goldstein, R. A., Nierras, C. R. The promise of human induced pluripotent stem cells for research and therapy. Nat Rev Mol Cell Biol. 9 (9), 725-729 (2008).
  3. Guilak, F., Cohen, D. M., Estes, B. T., Gimble, J. M., Liedtke, W., Chen, C. S. Control of stem cell fate by physical interactions with the extracellular matrix. Cell Stem Cell. 5 (1), 17-26 (2009).
  4. Dalby, M. J., Gadegaard, N., Oreffo, R. O. Harnessing nanotopography and integrin-matrix interactions to influence stem cell fate. Nat Mater. 13 (6), 558-569 (2014).
  5. Joddar, B., Ito, Y. Artificial niche substrates for embryonic and induced pluripotent stem cell cultures. J Biotechnol. 168 (2), 218-228 (2013).
  6. Warmflash, A., Sorre, B., Etoc, F., Siggia, E. D., Brivanlou, A. H. A method to recapitulate early embryonic spatial patterning in human embryonic stem cells. Nat Methods. 11 (8), 847-854 (2014).
  7. Peerani, R., et al. Niche-mediated control of human embryonic stem cell self-renewal and differentiation. EMBO J. 26 (22), 4744-4755 (2007).
  8. Lee, L. H., Peerani, R., Ungrin, M., Joshi, C., Kumacheva, E., Zandstra, P. Micropatterning of human embryonic stem cells dissects the mesoderm and endoderm lineages. Stem Cell Res. 2 (2), 155-162 (2009).
  9. Hwang, Y. S., Chung, B. G., Ortmann, D., Hattori, N., Moeller, H. C., Khademhosseini, A. Microwell-mediated control of embryoid body size regulates embryonic stem cell fate via differential expression of WNT5a and WNT11. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (40), 16978-16983 (2009).
  10. Toh, Y. C., Xing, J., Yu, H. Modulation of integrin and E-cadherin-mediated adhesions to spatially control heterogeneity in human pluripotent stem cell differentiation. Biomaterials. 50 (0), 87-97 (2015).
  11. Xing, J., Toh, Y. C., Xu, S., Yu, H. A method for human teratogen detection by geometrically confined cell differentiation and migration. Sci Rep. 5, 10038(2015).
  12. Falconnet, D., Csucs, G., Grandin, H. M., Textor, M. Surface engineering approaches to micropattern surfaces for cell-based assays. Biomaterials. 27 (16), 3044-3063 (2006).
  13. Bauwens, C. L., et al. Control of human embryonic stem cell colony and aggregate size heterogeneity influences differentiation trajectories. Stem Cells. 26 (9), 2300-2310 (2008).
  14. Khademhosseini, A., et al. Co-culture of human embryonic stem cells with murine embryonic fibroblasts on microwell-patterned substrates. Biomaterials. 27 (36), 5968-5977 (2006).
  15. Mohr, J. C., de Pablo, J. J., Palecek, S. P. 3-D microwell culture of human embryonic stem cells. Biomaterials. 27 (36), 6032-6042 (2006).
  16. Yao, R., et al. Hepatic differentiation of human embryonic stem cells as microscaled multilayered colonies leading to enhanced homogeneity and maturation. Small. 10 (21), 4311-4323 (2014).
  17. Mei, Y., et al. Combinatorial development of biomaterials for clonal growth of human pluripotent stem cells. Nat Mater. 9 (9), 768-778 (2010).
  18. Melkoumian, Z., et al. Synthetic peptide-acrylate surfaces for long-term self-renewal and cardiomyocyte differentiation of human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 28 (6), 606-610 (2010).
  19. Evans, N. D., et al. Substrate stiffness affects early differentiation events in embryonic stem cells. Eur Cell Mater. 18, 1-13 (2009).
  20. Carter, S. B. Haptotactic islands: a method of confining single cells to study individual cell reactions and clone formation. Exp Cell Res. 48 (1), 189-193 (1967).
  21. Jimbo, Y., Robinson, H. P., Kawana, A. Simultaneous measurement of intracellular calcium and electrical activity from patterned neural networks in culture. IEEE Trans Biomed Eng. 40 (8), 804-810 (1993).
  22. Wright, D., et al. Reusable, reversibly sealable parylene membranes for cell and protein patterning. J Biomed Mater Res. A. 85 (2), 530-538 (2008).
  23. Jinno, S., et al. Microfabricated multilayer parylene-C stencils for the generation of patterned dynamic co-cultures. J Biomed Mater Res A. 86 (1), 278-288 (2008).
  24. Jackman, R. J., Duffy, D. C., Cherniavskaya, O., Whitesides, G. M. Using elastomeric membranes as dry resists and for dry lift-off. Langmuir. 15 (8), 2973-2984 (1999).
  25. Folch, A., Jo, B. H., Hurtado, O., Beebe, D. J., Toner, M. Microfabricated elastomeric stencils for micropatterning cell cultures. J Biomed Mater Res. 52 (2), 346-353 (2000).
  26. Park, J., et al. Microfabrication-based modulation of embryonic stem cell differentiation. Lab Chip. 7 (8), 1018-1028 (2007).
  27. Choi, J. H., Lee, H., Jin, H. K., Bae, J. S., Kim, G. M. Micropatterning of neural stem cells and Purkinje neurons using a polydimethylsiloxane (PDMS) stencil. Lab Chip. 12 (23), 5045-5050 (2012).
  28. Li, W., et al. NeuroArray: a universal interface for patterning and interrogating neural circuitry with single cell resolution. Sci Rep. 4, 4784(2014).
  29. Guvanasen, G. S., Mancini, M. L., Calhoun, W. A., Rajaraman, S., DeWeerth, S. P. Polydimethylsiloxane Microstencils Molded on 3-D-Printed Templates. J Microelectromech S. 23 (5), 1045-1053 (2014).
  30. Palchesko, R. N., Zhang, L., Sun, Y., Feinberg, A. W. Development of polydimethylsiloxane substrates with tunable elastic modulus to study cell mechanobiology in muscle and nerve. PLoS One. 7 (12), 51499(2012).
  31. Chowdhury, F., et al. Material properties of the cell dictate stress-induced spreading and differentiation in embryonic stem cells. Nat Mater. 9 (1), 82-88 (2010).
  32. Gjorevski, N., Boghaert, E., Nelson, C. M. Regulation of Epithelial-Mesenchymal Transition by Transmission of Mechanical Stress through Epithelial Tissues. Cancer Microenviron. 5 (1), 29-38 (2012).
  33. Thery, M. Micropatterning as a tool to decipher cell morphogenesis and functions. J Cell Sci. 123, (Pt 24) 4201-4213 (2010).
  34. Eroshenko, N., Ramachandran, R., Yadavalli, V. K., Rao, R. R. Effect of substrate stiffness on early human embryonic stem cell differentiation. J Biol Eng. 7 (1), 7(2013).

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Réimpressions et autorisations

Demander l’autorisation de réutiliser le texte ou les figures de cet article JoVE

Demander une autorisation

Mots-clés

Adh sion cellulaireDiff renciation du m soendodermePochoir PDMSMatrice de membrane basaleEnsemencement cellulaireAnalyse par microscopie

Articles connexes