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Article de méthode

Infusion IV continue est le traitement de choix pour la route Arginine-vasopressine Receptor Blocker Conivaptan chez des souris pour étudier des maladies évoqués Oedème cérébral

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⸱

DOI :

10.3791/54170

⸱

1 septembre 2016

 ,  , 
1Neurotrauma Research, Swedish Medical Center, 2Neurosurgery, Colorado Brain and Spine Institute

Dans cet article

Résumé

Nos études ont révélé que les effets bénéfiques du conivaptan dépendent de la méthode d’administration après un AVC expérimental chez la souris. Nous avons développé un protocole de recherche pour l’administration du bloqueur de récepteurs via un cathéter IV sur la formation d’un œdème cérébral évoqué par un AVC chez la souris.

Résumé

Accident vasculaire cérébral est l'une des principales causes de morbidité et de mortalité dans le monde. Stroke est compliquée par un œdème cérébral et d'autres événements physiopathologiques. Parmi les joueurs les plus importants dans le développement et l'évolution des accidents vasculaires cérébraux évoqués oedème cérébral est l'hormone arginine-vasopressine et ses récepteurs, V1a et V2. Récemment, le bloqueur des récepteurs conivaptan V1a et V2 a été d'attirer l'attention en tant que médicament potentiel pour réduire l'oedème cérébral après un AVC. Cependant, les modèles animaux qui impliquent des applications conivaptan dans la recherche de course doivent être modifiés en fonction des itinéraires possibles de l'administration. Voici les résultats de 48 h intraveineuse continue (IV) sont comparés avec les traitements intrapéritonéale (IP) de conivaptan après un AVC expérimental chez la souris. Nous avons développé un protocole dans lequel l'occlusion de l'artère cérébrale moyenne a été combinée avec l'installation du cathéter dans la veine jugulaire pour le traitement IV de conivaptan (0,2 mg) ou d'un véhicule. Différentes générations d'animaux ont été traités avec 0,2bol mg de conivaptan ou un véhicule IP par jour. Experimental œdème cérébral AVC évoquée a été évaluée chez des souris après IV continue et traitements IP. La comparaison des résultats a révélé que l'administration IV continue de conivaptan pallie post-ischémique œdème cérébral chez les souris, à la différence de l'administration IP de conivaptan. Nous concluons que notre modèle peut être utilisé pour des études futures applications conivaptan dans le contexte de l'AVC et l'oedème cérébral.

Introduction

L’AVC continue d’être un énorme fardeau pour les patients et les cliniciens. Les modèles d’AVC chez l’animal sont utilisés en laboratoire depuis près de deux décennies. 1 Néanmoins, les traitements expérimentaux qui fonctionnent chez les animaux échouent souvent chez l’homme. 2 Cet écart dans les résultats du traitement peut être dû à divers facteurs, tels que les voies d’administration des médicaments utilisés dans la recherche animale, le métabolisme et le taux d’élimination des médicaments, et bien d’autres aspects. L’une des principales complications de l’AVC, l’œdème cérébral, est au cœur de la recherche actuelle en neurosciences. Les mécanismes de formation de l’œdème cérébral impliquent des perturbations de l’équilibre hydrique et électrolytique déclenchées par la réponse de l’arginine-vasopressine (AVP) à une lésion cérébrale ischémique. 3 Par conséquent, l’AVP et ses récepteurs (V1a et V2) sont un objectif majeur des études de recherche sur la formation d’un œdème cérébral post-ischémique. 3

Nous avons développé une méthodologie pour étudier les effets du conivaptan, un bloqueur mixte des récepteurs arginine-vasopressine (V1a et V2), sur l’œdème cérébral post-ischémique chez la souris. 4 Les cibles moléculaires du conivaptan5 font du médicament un candidat approprié pour l’exploration de ses propriétés dans le soulagement de l’œdème cérébral. De plus, le conivaptan doit être étudié dans le contexte des événements physiopathologiques de l’AVC. 6 Lors de la conception de cette étude, nous avons envisagé de comparer les résultats du traitement en utilisant deux voies d’administration différentes pour le conivaptan : intraveineuse (IV)4 et intrapéritonéale (IP). 7 Les effets des traitements sur l’œdème cérébral induit par un AVC ont été évalués. Ici, des protocoles détaillés sont décrits pour l’induction chirurgicale de l’AVC expérimental par occlusion de l’artère cérébrale moyenne (MCAO), et suivie d’un traitement continu par conivaptan utilisant l’installation d’un cathéter IV jugulaire. Après l’induction de l’AVC, les animaux ont été répartis au hasard dans les groupes suivants : véhicule ou conivaptan (0,2 mg/jour) traités IV ou IP.

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Protocole

Les expériences ont été effectuées en conformité avec les lignes directrices des Instituts nationaux de la santé pour les soins et l'utilisation des animaux dans la recherche et ont été approuvés par le Comité des soins et l'utilisation des animaux suédois Medical Center. Toutes les procédures ont été réalisées avec des techniques aseptiques appropriées. Les animaux expérimentaux utilisés pour l'étude étaient de sexe masculin, âgé de 3 mois, les souris C57 de type sauvage avec le poids corporel 25-27 g.

1. Dans l' induction de l' AVC Vivo

  1. Pré-enduire le Filament avec la résine dentaire Avant la chirurgie.
    1. Coupez un long morceau de 12 mm de filament à partir d'un fil de suture 7-0 en nylon. Mélanger 2 parties de la résine avec une partie du durcisseur, puis plonger immédiatement l'extrémité du filament dans le mélange pour couvrir environ un tiers de la longueur totale. Retirer rapidement et vérifiez qu'elle est recouverte d'une couche à surface lisse de résine dentaire.
    2. Air sécher le filament pendant 2 heures avant de l'utiliser.
  2. Placez la souris dans unn chambre d'anesthésie à induction (2 L de volume), et régler le débit de 1,5% d'isoflurane dans 25% air ambiant enrichi en oxygène à 2 L / min d'entrer dans la chambre.
  3. Laissez la souris pour rester dans la chambre d'induction jusqu'à entièrement anesthésié, 8 tel que déterminé par l' absence de réponse à la queue pincée.
  4. Placez la souris sur la table d'opération avec un coussin chauffant, et régler la concentration d'isoflurane sur 1% pour l'entretien de l'anesthésie livré spontanément à travers le cône de nez.
  5. Couper les poils à l'avant et l'arrière du cou, et pulvériser le cou avec de l'alcool à friction. Appliquer une pommade ophtalmique vétérinaire sur les deux yeux.
  6. Pour surveiller en permanence la température du corps, utiliser une sonde de température rectale reliée à affichage numérique pendant la chirurgie.
  7. Placez la souris en position couchée, appliquer une solution à 10% gommage povidone-iode pour la désinfection, couvrir d'un drap stérile, et ensuite faire une incision médiane le long du cou avec une lame chirurgicale taille 10 scalpel.
  8. ligaturer temporairement l'artère gauche commune carotide (CCA) avec une suture 6.0 de soie.
  9. Placez un autre lien sur l'artère carotide externe gauche (ECA).
  10. Placez un clip microvasculaire sur l'artère carotide interne (ICA).
  11. Coupez un petit trou sur l'artère carotide externe avec des ciseaux microvasculaires. Insérez un filament en 7-0 suture en nylon enduit de résine dentaire dans l'ouverture de la CEA, et avancer cephalically, tout en retirant le clip, jusqu'à sentir une résistance (environ 5-7 mm à partir du point de la CCA de bifurcation).
  12. Placer une attache temporaire sur l'artère carotide interne pour fixer le filament en position. Reportez - vous à la figure, la figure 1A. Fermer la peau avec une suture de soie, et d'infiltrer la plaie à l'avant du cou avec 0,2 ml de bupivacaïne à 0,5%, comme dans l'étape 2.6.
  13. Laissez la souris pour réveiller de l'anesthésie et de reprendre conscience dans une chambre de récupération pendant 60 min. Ne pas laisser l'animal sans surveillance jusqu'à ce qu'il ait retrouvéconscience suffisante pour maintenir décubitus sternale.
  14. Test de la souris pour le déficit neurologique notation (NDS) comme suit: 0 = fonction normale du moteur, 1 = flexion du torse et des forelimb controlatéral sur hayon élévateur, 2 = encerclant le côté controlatéral, mais la posture normale au repos, 3 = penchant à controlatéral côté au repos, 4 = pas d' activité motrice spontanée. 4,9
    1. Pour les tests NDS, soulevez la souris par la queue et les placer sur une surface plane pour l'observation (2-3 min). Vous pouvez également observer les souris dans la chambre de récupération. Exclure les souris qui présentent NDS inférieur à 2 à partir de l'expérience due à l'occlusion insuffisante de la MCA.
      Remarque: la technique de Laser Doppler peut être utilisé pour confirmer MCA occlusion 9-11.
  15. Re-anesthésier l'animal après 60 minutes de récupération dans la chambre d'aspiration tel que décrit ci-dessus, restériliser l'incision cutanée précédente avec une solution à 10% de gommage povidone-iode, et de rouvrir la plaie chirurgicale de ladevant le cou en coupant et en enlevant la suture de soie.
  16. Pour retirer le filament de la CEA effectuer les étapes suivantes:
    1. Placez un clip microvasculaire sur la CIA. Détachez la suture sur la CIA et tirer le filament hors tout en maintenant pince ouverte.
    2. Fermez le clip et placer un lien sur la CEA proximalement à la coupe.
    3. Retirez le clip et retirer la ligature de la CCA pour rétablir le flux sanguin vers le cerveau. Consultez le diagramme, la figure 1B.

2. Installation de la IV Catheter dans la veine jugulaire pour Rafale traitement de 48 heures

Remarque: Procéder à l'installation du cathéter immédiatement après l'étape 1.16.3 sans éveil de la souris.

  1. Utiliser deux tailles différentes de tubes flexibles insérer le tube interne (0,94 mm de diamètre extérieur, pour contenir le médicament perfusé) dans le tube extérieur (3,18 mm de diamètre extérieur, pour la protection du tube interne).
  2. Placer la souris en position couchée, appliquer une solution à 10% de gommage povidone-iode pour la désinfection, et de faire une incision de 1 cm à l'arrière du cou avec une lame chirurgicale taille 10 scalpel. Tournez la souris dans la position couchée, restériliser l'avant du cou avec une solution à 10% de gommage povidone-iode, et de rouvrir la plaie chirurgicale sur le devant du cou. Tunnel du tube sous la peau de l'incision faite sur le dos à l'avant du cou, et extérioriser de la plaie ouverte de 1 cm.
  3. Enlever le tissu adipeux sous-cutané à partir du côté gauche de l'avant du cou d'environ 1 cm latéralement de la ligne médiane. Repérez la veine jugulaire gauche, placez deux attaches le long de la veine 5 mm, et légèrement étirer la veine. Faire un petit trou sur la veine jugulaire entre les deux liens avec des ciseaux microvasculaires; insérez la pointe du tube 5 mm caudale intérieure profonde (vers le cœur).
  4. Fixer le tube avec les deux attaches dans la veine jugulaire. Fermez la peau sur le devant du cou avecune suture 3-0 en soie. Reportez - vous à la figure, la figure 1C.
  5. Fixer le tuyau à la peau sur le dos du cou avec un fil de suture, et raccorder le tuyau à une pompe microperfusion IV grâce à un pivot. Le pivot permet la libre circulation des souris à l'intérieur de la cage avec plein accès à la nourriture et de l'eau.
  6. Infiltrer les incisions de la peau sur l'avant et l'arrière du cou avec 0,2 ml de bupivacaïne à 0,5% pour prévenir la douleur post-opératoire.
    Remarque: Selon les protocoles d'animaux spécifiques institutionnels, les animaux peuvent être traités avec des opioïdes, les AINS, ou des antibiotiques avant et après l'opération. Cependant, les traitements mentionnés peuvent modifier les résultats de ischémiques résultats de l'AVC (voir la section Discussion). 11-14
  7. Laisser l'animal de se réveiller dans la chambre de récupération, puis loger l'animal dans une cage séparée jusqu'à ce que le point de l'expérience de fin. Ne pas laisser l'animal sans surveillance jusqu'à ce qu'il ait repris connaissance suffisante pour maintenir sternaldécubitus.
  8. Régler le débit de perfusion pour en continu 48 h traitement IV de conivaptan (0,14 mg / ml dans 5% de dextrose) ou d'un véhicule à 1,5 ml / kg / h, 4 et commencer la perfusion.
    Remarque: Le montant total de la IV conivaptan infusé devrait être d'environ 0,2 mg / souris / jour dans un volume total de 1,44 ml.
    Remarque: Effectuez intrapéritonéale (IP) injection de conivaptan deux fois par jour avec une quantité totale de 0,2 mg dans 1,44 ml de dextrose à 5%. Mettre en œuvre l' injection IP a été décrit comme précédemment. 15 Retiens souris en saisissant la peau de la face postérieure du corps et de la queue. Injecter conivaptan ou d'un véhicule dans le quadrant inférieur gauche de l'abdomen en utilisant un / 02.01 aiguille G 26 pouces. 15
  9. Observer les animaux deux fois par jour pendant toute la durée de l'expérience (48 heures). Laisser les animaux ont accès à la nourriture et de l'eau. Si l'animal présente des signes de détresse ou de dyspnée consulter un vétérinaire. Si l'euthanasie est nécessaire pour l'animal dans dist sévèreress reportez-vous à l'étape 3.1 ci-dessous, et exclut l'animal de l'étude.

3. Évaluation de l'AVC évoqués Oedème cérébral au Point final

  1. Sacrifiez la souris par-dessus-anesthésier avec 5% d'isoflurane.
  2. Utilisez un scalpel pour faire une incision de la peau sur l'os du crâne le long de la ligne médiane, et se rétracter la peau pour exposer l'ensemble du crâne sur le cerveau. Partant du foramen magnum, couper l'os du crâne latéralement le long du périmètre du cerveau de chaque côté, et soulevez-le avec précaution sans toucher le cerveau en dessous. Sectionner le cerveau de la colonne vertébrale et les nerfs attachés à la base du crâne.
  3. Enlever le cerveau, le séparer du bulbe olfactif et le cervelet et le cerveau disséquer le long de la fissure interhémispherique dans les hémisphères cérébraux ischémiques et non ischémiques, comme décrit précédemment. 9
  4. Évaluer l' œdème cérébral en comparant humide à sec ratios (WDR) comme décrit précédemment 4,9. Peser les tissusavant et après séchage pendant 3 jours à 100 ° C dans un four. Calculer la teneur en eau du cerveau (BWC) en% H 2 O = (poids de 1 sec. / Poids humide.) X 100%.

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Résultats

La température corporelle des animaux était dans les limites physiologiques et stable tout au long de la procédure chirurgicale d'AVC induction. Deux souris qui présentaient NDS inférieur à 2 immédiatement après MCAO ont été exclus de l'étude.

MCAO chez la souris produit un volume de l'infarctus dans l'hémisphère ipsilatéral à 48 h. Évaluation des tranches de TTC teinté montre que 50% environ de l'hémisphèr...

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Discussion

Cette étude a une valeur importante pour la recherche de la course préclinique. Cette étude révèle que continue perfusion IV de conivaptan (0,2 mg / jour) après un AVC expérimental chez la souris réduit efficacement l'œdème cérébral après 48 heures de traitement. L'effet de l'injection IP de la même dose de conivaptan sur l'oedème cérébral a également été étudiée. traitement Conivaptan par les deux voies IV et IP produit aquaresis chez la souris comme indiqué par: 1) augmentation de l'osmolalité plas...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n'ont rien à dévoiler.

Remerciements

Nous remercions Swedish Medical Center pour fournir le financement et les installations. Nous remercions également Craig Hospital pour l'utilisation généreuse de l'espace de laboratoire.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Coussin chauffantK& H Manufacturing Inc1060
Moniteur de température avec sonde rectalePhysitemp7029
Bobine de suture en soie, 6-0Surgical Specialties CorporationSP114
Suture en soie sur une aiguille, 3-0Ethicon1684G
Suture en nylon, 7-0Ethicon1696G
Résine dentaire Polysiloxane avec durcisseurHeraeus Kulzer65817930
Pompe IV à microperfusionKent ScietificGT0897
Swivel 22GAInstech375/22PS
Tube de laboratoire, 0,94 mm x 0,51 mm DowCorning508-002
Tube de laboratoire, 3,18 mm x 1,98 mmDow Corning508-009

Références

  1. Gueniau, C., Oberlander, C. The kappa opioid agonist niravoline decreases brain edema in the mouse middle cerebral artery occlusion model of stroke. J Pharmacol Exp Ther. 282, 1-6 (1997).
  2. Krafft, P. R., et al. Etiology of stroke and choice of models. Int J Stroke. 7, 398-406 (2012).
  3. Vakili, A., Kataoka, H., Plesnila, N. Role of arginine vasopressin V1 and V2 receptors for brain damage after transient focal cerebral ischemia. J Cereb Blood Flow Metab. 25, 1012-1019 (2005).
  4. Zeynalov, E., Jones, S. M., Seo, J. W., Snell, L. D., Elliott, J. P. Arginine-Vasopressin Receptor Blocker Conivaptan Reduces Brain Edema and Blood-Brain Barrier Disruption after Experimental Stroke in Mice. PloS one. 10, e0136121(2015).
  5. Med Lett Drugs Ther.. Conivaptan (Vaprisol) for hyponatremia. The Medical letter on drugs and therapeutics. 48, 51-52 (2006).
  6. Zhao, X. Y., et al. Effect of arginine vasopressin on the cortex edema in the ischemic stroke of Mongolian gerbils. Neuropeptides. 51, 55-62 (2015).
  7. Manaenko, A., Chen, H., Kammer, J., Zhang, J. H., Tang, J. Comparison Evans Blue injection routes: Intravenous versus intraperitoneal, for measurement of blood-brain barrier in a mice hemorrhage model. J Neurosci Methods. 195, 206-210 (2011).
  8. Adams, S., Pacharinsak, C. Mouse anesthesia and analgesia. Curr Protoc Mouse Biol. 5, 51-63 (2015).
  9. Zeynalov, E., et al. The perivascular pool of aquaporin-4 mediates the effect of osmotherapy in postischemic cerebral edema. Crit Care Med. 36, 2634-2640 (2008).
  10. Zeynalov, E., Dore, S. Low doses of carbon monoxide protect against experimental focal brain ischemia. Neurotox Res. 15, 133-137 (2009).
  11. Zeynalov, E., Nemoto, M., Hurn, P. D., Koehler, R. C., Bhardwaj, A. Neuroprotective effect of selective kappa opioid receptor agonist is gender specific and linked to reduced neuronal nitric oxide. J Cereb Blood Flow Metab. 26, 414-420 (2006).
  12. Ma, M. C., Qian, H., Ghassemi, F., Zhao, P., Xia, Y. Oxygen-sensitive {delta}-opioid receptor-regulated survival and death signals: novel insights into neuronal preconditioning and protection. J Biol Chem. 280, 16208-16218 (2005).
  13. Ahmad, M., Zhang, Y., Liu, H., Rose, M. E., Graham, S. H. Prolonged opportunity for neuroprotection in experimental stroke with selective blockade of cyclooxygenase-2 activity. Brain Res. 1279, 168-173 (2009).
  14. Meisel, C., et al. Preventive antibacterial treatment improves the general medical and neurological outcome in a mouse model of stroke. Stroke. 35, 2-6 (2004).
  15. Miner, N. A., Koehler, J., Greenaway, L. Intraperitoneal injection of mice. Appl Microbiol. 17, 250-251 (1969).
  16. Adis International Limited. Conivaptan: YM 087. Drugs in R&D. 5, 94-97 (2004).
  17. Murphy, T., Dhar, R., Diringer, M. Conivaptan bolus dosing for the correction of hyponatremia in the neurointensive care unit. Neurocrit Care. 11, 14-19 (2009).
  18. Liu, X., Nakayama, S., Amiry-Moghaddam, M., Ottersen, O. P., Bhardwaj, A. Arginine-vasopressin V1 but not V2 receptor antagonism modulates infarct volume, brain water content, and aquaporin-4 expression following experimental stroke. Neurocrit Care. 12, 124-131 (2010).
  19. Wallace, B. K., Jelks, K. A., O'Donnell, M. E. Ischemia-induced stimulation of cerebral microvascular endothelial cell Na-K-Cl cotransport involves p38 and JNK MAP kinases. Am J Physiol Cell Physiol. 302, C505-C517 (2012).
  20. O'Donnell, M. E., et al. Intravenous HOE-642 reduces brain edema and Na uptake in the rat permanent middle cerebral artery occlusion model of stroke: evidence for participation of the blood-brain barrier Na/H exchanger. J Cereb Blood Flow Metab. 33, 225-234 (2013).
  21. Walcott, B. P., Kahle, K. T., Simard, J. M. Novel treatment targets for cerebral edema. Neurotherapeutics. 9, 65-72 (2012).
  22. Shen, Z., et al. Inhibition of G protein-coupled receptor 81 (GPR81) protects against ischemic brain injury. CNS Neurosci Ther. 21, 271-279 (2015).

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