Les analyses microscopiques de Criblage à haut débit des facteurs de l&#39;hôte impliqués dans<em&gt; Brucella</em&gt; L&#39;infection des cellules HeLa

Résumé

Deux tests de dépistage à haut débit par microscopie des facteurs de l’hôte impliqués dans l’infection à Brucella sont décrits. Le test d’entrée détecte les facteurs de l’hôte nécessaires à l’entrée de Brucella et le test final ceux nécessaires à la réplication intracellulaire. Bien qu’il soit applicable à d’autres approches, le criblage de siRNA dans les cellules HeLa est utilisé pour illustrer les protocoles.

Résumé

Espèces de Brucella sont des agents pathogènes intracellulaires facultatifs qui infectent les animaux comme leurs hôtes naturels. La transmission aux humains est le plus souvent causée par un contact direct avec des animaux infectés ou par ingestion d'aliments contaminés et peut conduire à des infections chroniques graves.

Brucella peut envahir les cellules phagocytaires professionnels et non-professionnels et réplique au sein du réticulum endoplasmique (RE) de vacuoles -derived. Les facteurs de l' hôte requis pour l' entrée Brucella dans des cellules hôtes, éviter la dégradation lysosomale, et la réplication dans le compartiment ER-like demeurent largement inconnus. Nous décrivons ici deux essais pour identifier les facteurs de l' hôte impliqués dans Brucella l' entrée et la réplication dans les cellules HeLa. Les protocoles décrivent l'utilisation de l'interférence ARN, alors que les méthodes de criblage alternatives pourraient être appliquées. Les essais sont basés sur la détection de bactéries marquées par fluorescence dans les cellules hôtes marquées par fluorescence en utilisant automatiséla microscopie à champ large. Les images fluorescentes sont analysées à l'aide d'un pipeline d'analyse d'image normalisée dans CellProfiler qui permet l'infection par simple pointage à base de cellules.

Dans l'essai de point final, la réplication intracellulaire est mesurée deux jours après l'infection. Cela permet aux bactéries de trafic vers leur niche réplicative où la prolifération est lancé autour de 12 heures après l' entrée bactérienne. Brucella qui ont établi avec succès une niche intracellulaire aura ainsi fortement proliféré à l' intérieur des cellules hôtes. Comme les bactéries intracellulaires grandement plus nombreux que les bactéries non réplicatifs extracellulaires ou intracellulaires individuels, une souche exprimant constitutivement GFP peut être utilisé. Le signal de la GFP solide est ensuite utilisé pour identifier les cellules infectées.

En revanche, pour le dosage d'entrée, il est essentiel de faire la distinction entre les bactéries intracellulaires et extracellulaires. Ici, un codage de déformation pour une GFP inductible par la tétracycline est utilisée. Inductionde la GFP avec l'inactivation simultanée des bactéries extracellulaires par la gentamicine permet la différenciation entre intracellulaire et extracellulaire des bactéries en fonction du signal de la GFP, seules les bactéries intracellulaires étant capable d'exprimer la GFP. Ceci permet la détection des bactéries intracellulaires robuste unique avant la prolifération intracellulaire est initiée.

Introduction

Espèces de Brucella sont, les agents pathogènes intracellulaires facultatifs Gram négatif appartenant à la classe des α-protéobactéries. Ils provoquent des avortements et l'infertilité chez leurs hôtes naturels tels que les bovins, les chèvres, les moutons ou entraînant des pertes économiques sévères dans les zones endémiques. La brucellose est l' une des maladies zoonotiques les plus importants dans le monde entier causant plus d' un demi - million de nouvelles infections humaines par an ^1. La transmission à l'homme est le plus souvent causée par un contact direct avec des animaux infectés ou par ingestion d'aliments contaminé....

Protocole

Note: Tous les travaux avec en direct des souches de Brucella abortus doit être effectuée à l' intérieur d' un niveau de biosécurité 3 (BSL3) laboratoire compte tenu de tous les règlements nécessaires et les précautions de sécurité.

1. Préparation du dépistage Plaques et culture des bactéries et des cellules

1. Préparation de Brucella abortus Cultures de démarrage
   1. Streak Brucella abortus 2308 (B. abortus) de -80 ° C le lait disponible sur une plaque CASO Agar (TSA) contenant 50 pg / ml de kanamycine (TSA / Km). Incuber la plaque pendant 3-4 jours à 37 ° C. Utilisez la souche

Résultats

La figure 1A représente un exemple d'analyse d'image utilisé pour identifier automatiquement les cellules infectées dans l'essai de point final. Les noyaux des cellules HeLa colorées avec du DAPI ont été identifiées, une péri-noyau d'une largeur de 8 pixels entourant le noyau et un corps de cellule de Voronoi par extension du noyau par 25 pixels ont été calculés. Etant donné que les bactéries prolifèrent principalement dans l'espace péri-nucléaire, l&.......

Discussion

Les pathogènes bactériens ont développé de nombreuses stratégies pour manipuler les cellules hôtes eucaryotes à leur avantage. Les agents pathogènes à l’origine d’infections aiguës présentent souvent une prolifération rapide qui s’accompagne d’une alarme importante du système immunitaire et d’une perte de viabilité des cellules infectées. En revanche, Brucella et d’autres agents pathogènes qui causent des infections chroniques parviennent à établir des interactions durables au sein des cellules hôtes. Par conséq.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Gélose de soja tryptique (TSA)	BD	236950
Bouillon de soja tryptique (TSB)	Fluka	22092
Sulfate de kanamycine	Sigma-Aldrich	60615
Lait
250 ml Flacon à bouchon à vis	Corning	8396
DMEM	Sigma-Aldrich	D5796
Fœtal Sérum de veau (FCS)	Gibco	10270
Trypsine-EDTA inactivée par la chaleur (0,5 %)	Gibco	15400-054	Solution mère 10x, diluée 1:10 dans PBS
Scepte 2.0 Compteur de cellules	Merck Milipore	PHCC20060	Des dispositifs de comptage de cellules alternatifs peuvent être utilisés
Greiner CELLSTAR Plaque à 384 puits	Sigma-Aldrich	M2062
Feuille d’aluminium pelable	Costar	6570
Distributeur de réactifs : « Multidrop 384 Reactive Dispenser"Thermo	Scientific	5840150	Distributeur de réactifs alternatif peut être utilisé.
Réactif de transfection : « Lipofectamine RNAiMAX	Invitrogen	13778-150
Laveur de plaques automatisé : « Laveur de plaques ELx50-16"BioTek		ELX5016	Ce laveur de plaques contient un collecteur à 16 canaux adapté aux plaques à 384 puits. Il s’insère dans une armoire de biosécurité et dispose d’un couvercle recouvrant la plaque pendant le lavage, ce qui réduit le risque de production d’aérosols. D’autres rondelles de plaques avec des caractéristiques similaires pourraient être utilisées.
gentamicine	Sigma-Aldrich	G1397
Chlorhydrate d’anhydrotétracycline	Sigma-Aldrich	37919	100 μ ; g/ml de solution dans de l’éthanol à 100 % est maintenue à -20 & ° C protégé de la lumière dans une feuille d’aluminium
PBS	Gibco	20012
Paraformaldéhyde	Sigma-Aldrich	P6148	Dissoudre dans 0,2 M Tampon HEPES, pH 7,4. Conserver à -20 ° ; C et décongeler fraîchement la veille de l’utilisation. Attention, le PFA est toxique par inhalation, en contact avec la peau et en cas d’ingestion.
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T9284
DAPI	Roche	10236276001
SiRNA brouillé	Dharmacon	D-001810-10
Kif11 siRNA	Dharmacon	L-003317-00
ARPC3 siRNA	Dharmacon	L-005284-00
Brucella abortus 2308
pJC43 (apHT ::GFP)			Celli et al.12
pAC042.08 (apht ::d sRed, tetO ::tetR-GFP)			Construction : pJC44 4 a été digéré avec EcoRI suivi de la génération d’extrémités émoussées avec l’enzyme Klenov et d’une digestion ultérieure avec SalI. TetR-GFP a été amplifié à partir de pNF106 à l’aide des amorces prAC090 et prAC092. Après digestion avec SalI, le produit TetR-GFP a été ligaturé au vecteur pJC44 digéré.
Primer prAC090	Sigma-Aldrich		TTT TTG AAT TCT GGC AAT TCC GAC GTC TAA GAA ACC
Primer prAC092	Sigma-Aldrich		TTT TTG TCG ACT TTG TCC TAC TCA GGA GAG CGT
TC HeLa CCL-2	ATCC	CCL-2
ImageXpress Micro	Molecular Devices  ;	IXM IMAGING MSCOPE	Microscope d’imagerie cellulaire automatisé équipé d’une platine Z motorisée de précision. D’autres systèmes pour la microscopie automatisée et d’autres composants pour le matériel et les logiciels spécifiés ci-dessous peuvent être utilisés.
laser à mise au point automatique à grande vitesse	;	1-2300-1037
Objectif CFI Super Fluor 10X	Nikon·	MRF00100	N.A 0.50, L.D 1.20 mm, Prisme DIC : 10X,
Photométrie à ressort CoolSNAP HQ Caméra CCD monochrome	Dispositifs moléculaires	1-2300-1060	1 392 x 1 040 pixels d’imagerie, 6,45 x 6,45 et micro ; m pixels, 12 bits numérisation
Logiciel MetaXpress	Molecular Devices  ;	9500-0100
LUI-Spectra-X-7	Lumencor	SPECTRA X V-XXX-YZ	Moteur d’éclairage. Les sources lumineuses suivantes sont utilisées : violet (DAPI), cyan (GFP), vert/jaune (RFP)
Excitateur monobande pour DAPI	Semrock	FF01-377/50-25
Émetteur monobande pour DAPI	Semrock	FF02-447/60-25
Dichroïque monobande pour DAPI	Semrock	FF409-Di03-25x36
Excitateur monobande pour GFP	Semrock	FF02-472/30-25
Émetteur monobande pour GFP	Semrock	FF01-520/35-25
Dichroïque monobande pour GFP	Semrock	FF495-Di03-25x36
Excitateur monobande pour RFP	Semrock	FF01-562/40-25
Émetteur monobande pour RFP	Semrock	FF01-624/40-25
Dichroïque monobande pour RFP	Semrock	FF593-Di03-25x36

écréméDispositifs moléculaires