Reprogrammation fibroblastes embryonnaires de souris avec les facteurs de transcription pour induire un programme Hemogenic

Michael G. Daniel; Carlos-Filipe Pereira; Jeffrey M. Bernitz; Ihor R. Lemischka; Kateri Moore

doi:10.3791/54372

Un abonnement JoVE est requis pour visualiser ce contenu. Connectez-vous ou commencez votre période d'essai gratuite.

Article de méthode

Reprogrammation fibroblastes embryonnaires de souris avec les facteurs de transcription pour induire un programme Hemogenic

6.9K vues

⸱

DOI :

10.3791/54372

⸱

16 décembre 2016

Michael G. Daniel¹^,²^,³ , Carlos-Filipe Pereira⁴ , Jeffrey M. Bernitz¹^,²^,³ , Ihor R. Lemischka¹^,³^,⁵ , Kateri Moore¹^,³

¹Department of Developmental and Regenerative Biology, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, ²The Graduate School of Biomedical Science, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, ³Black Family Stem Cell Institute, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, ⁴Center for Neuroscience and Cell Biology, University of Coimbra, ⁵Department of Pharmacology and Systems Therapeutics, Icahn School of Medicine at Mount Sinai

Dans cet article

Résumé

Le protocole décrit ici détaille l’induction d’un programme hémogénique dans des fibroblastes embryonnaires de souris via la surexpression d’un ensemble minimal de facteurs de transcription. Cette technologie pourrait être transposée au système humain afin de fournir des plateformes pour l’étude future de l’hématopoïèse, des maladies hématologiques et de la greffe de cellules souches hématopoïétiques.

Résumé

Ce protocole détaille l’induction d’un programme hémogénique dans les fibroblastes embryonnaires de souris (MEF) via la surexpression de facteurs de transcription (TFs). Nous avons d’abord conçu un crible rapporteur à l’aide de MEF de souris doubles transgéniques humaines CD34-tTA/TetO-H2BGFP (34/H2BGFP). Les cellules CD34⁺ de ces souris marquent les histones H2B avec la GFP et cessent le marquage lors de l’ajout de doxycycline (DOX). Les MEFS ont été transduits avec des TF candidats, puis observés pour l’émergence de cellules GFP⁺ qui indiqueraient l’acquisition d’un destin de cellules hématopoïétiques ou endothéliales. En partant de 18 TF candidats, et grâce à un processus d’élimination combinatoire, nous avons obtenu un ensemble minimal de facteurs qui induiraient le pourcentage le plus élevé de cellules GFP⁺. Nous avons constaté que Gata2, Gfi1b et cFos étaient nécessaires et que l’ajout d’Etv6 fournissait l’induction optimale. Une série d’analyses de l’expression génique effectuées à différents moments du processus de reprogrammation a révélé que ces cellules semblaient passer par une cellule précurseur qui subissait une transition endothéliale à hématopoïétique (EHT). En tant que tel, ce processus de reprogrammation imite l’hématopoïèse développementale « dans une boîte », ce qui permet d’étudier l’hématopoïèse in vitro et de disposer d’une plate-forme pour identifier les mécanismes qui sous-tendent cette spécification. Cette méthodologie fournit également un cadre pour l’application de ce travail au système humain dans l’espoir de générer une source alternative de cellules souches hématopoïétiques (CSH) spécifiques au patient pour un certain nombre d’applications dans le traitement et l’étude des maladies hématologiques.

Introduction

Hématopoïèse est un processus de développement complexe où les cellules souches hématopoïétiques (CSH) bourgeonnent off endothélium hemogenic présents dans une variété de sites hématopoïétiques embryonnaires tels que l'Aorte-gonades-Mésonéphros et le placenta ^1,2. L'incapacité de la culture CSH in vitro empêche l'analyse en profondeur de ce processus ainsi que l'application clinique de ces études. Pour contourner cette limitation, des études antérieures ont tenté de tirer CSH de novo soit par la différenciation des cellules souches pluripotentes (PSC) ^3, ou la plasticité induite dans les cellules somatiques et l....