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Article de méthode

Reprogrammation fibroblastes embryonnaires de souris avec les facteurs de transcription pour induire un programme Hemogenic

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DOI :

10.3791/54372

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16 décembre 2016

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1Department of Developmental and Regenerative Biology, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 2The Graduate School of Biomedical Science, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 3Black Family Stem Cell Institute, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 4Center for Neuroscience and Cell Biology, University of Coimbra, 5Department of Pharmacology and Systems Therapeutics, Icahn School of Medicine at Mount Sinai

Dans cet article

Résumé

Le protocole décrit ici détaille l’induction d’un programme hémogénique dans des fibroblastes embryonnaires de souris via la surexpression d’un ensemble minimal de facteurs de transcription. Cette technologie pourrait être transposée au système humain afin de fournir des plateformes pour l’étude future de l’hématopoïèse, des maladies hématologiques et de la greffe de cellules souches hématopoïétiques.

Résumé

Ce protocole détaille l’induction d’un programme hémogénique dans les fibroblastes embryonnaires de souris (MEF) via la surexpression de facteurs de transcription (TFs). Nous avons d’abord conçu un crible rapporteur à l’aide de MEF de souris doubles transgéniques humaines CD34-tTA/TetO-H2BGFP (34/H2BGFP). Les cellules CD34+ de ces souris marquent les histones H2B avec la GFP et cessent le marquage lors de l’ajout de doxycycline (DOX). Les MEFS ont été transduits avec des TF candidats, puis observés pour l’émergence de cellules GFP+ qui indiqueraient l’acquisition d’un destin de cellules hématopoïétiques ou endothéliales. En partant de 18 TF candidats, et grâce à un processus d’élimination combinatoire, nous avons obtenu un ensemble minimal de facteurs qui induiraient le pourcentage le plus élevé de cellules GFP+. Nous avons constaté que Gata2, Gfi1b et cFos étaient nécessaires et que l’ajout d’Etv6 fournissait l’induction optimale. Une série d’analyses de l’expression génique effectuées à différents moments du processus de reprogrammation a révélé que ces cellules semblaient passer par une cellule précurseur qui subissait une transition endothéliale à hématopoïétique (EHT). En tant que tel, ce processus de reprogrammation imite l’hématopoïèse développementale « dans une boîte », ce qui permet d’étudier l’hématopoïèse in vitro et de disposer d’une plate-forme pour identifier les mécanismes qui sous-tendent cette spécification. Cette méthodologie fournit également un cadre pour l’application de ce travail au système humain dans l’espoir de générer une source alternative de cellules souches hématopoïétiques (CSH) spécifiques au patient pour un certain nombre d’applications dans le traitement et l’étude des maladies hématologiques.

Introduction

Hématopoïèse est un processus de développement complexe où les cellules souches hématopoïétiques (CSH) bourgeonnent off endothélium hemogenic présents dans une variété de sites hématopoïétiques embryonnaires tels que l'Aorte-gonades-Mésonéphros et le placenta 1,2. L'incapacité de la culture CSH in vitro empêche l'analyse en profondeur de ce processus ainsi que l'application clinique de ces études. Pour contourner cette limitation, des études antérieures ont tenté de tirer CSH de novo soit par la différenciation des cellules souches pluripotentes (PSC) 3, ou la plasticité induite dans les cellules somatiques et la différenciation dirigée en utilisant les médias de reprogrammation 4,5. Ces études, cependant, ne génèrent pas de cellules engraftable cliniquement sûres ou permettent l'étude de l'hématopoïèse de développement définitif "dans un plat."

Le travail de roman créé par Yamanaka et ses collègues pour générer induit des cellules souches pluripotentes (CISP) de fibroblastes somatique provides un cadre pour le facteur de transcription (TF) des stratégies de surexpression sur la base de reprogrammation cellulaire destin 6,7. Ce travail a incité les enquêteurs dans plusieurs domaines pour générer les types de choix de cellules via TF reprogrammation de cellules somatiques faciles à obtenir. L'objectif de la stratégie de reprogrammation décrite ici est d'induire un processus hemogenic à partir de cellules somatiques de souris en utilisant une approche de reprogrammation de TF basée dans le but de traduire ces résultats pour le système humain de reprogrammer des fibroblastes spécifiques au patient afin d'étudier l' hématopoïèse humaine in vitro et générer spécifiques aux patients des produits sanguins pour la modélisation de la maladie, le dépistage des drogues, et greffe de cellules souches.

La première étape pour assurer la reprogrammation appropriée dans ce système de la souris était de développer une ligne de journaliste qui a servi une lecture pour l'expression de CD34, un marqueur connu dans les cellules progénitrices endothéliales et CSH. Pour ce faire, les lignées de souris transgéniques huCD34-tTA et TetO-H2BGFP ont été utilisés pour generate des fibroblastes de souris transgéniques doubles embryonnaires (MEF), maintenant notée 34 / H2BGFP, qui fluoresce vert lors de l' activation du promoteur de CD34 8. Cela a permis le dépistage d'une variété de TFs connus pour être nécessaires à différents moments de la spécification et le développement hématopoïétique. A partir de 18 TFs dans PMX vecteurs rétroviraux (déterminés par l'exploitation de la littérature et le profilage de l'étiquette de la GFP conservant CSH de la décrit précédemment 34 souris / H2BGFP), 34 / H2BGFP MEFs ont été transduites avec tous les facteurs et de culture sur AFT024 HSC-cellules de soutien stromales. Après la détection de 34 activation / H2BGFP, TFs ont ensuite été retirés du cocktail de reprogrammation jusqu'à ce que l'ensemble optimal de TFS pour l'activation du journaliste a été identifié. Après cet écran initial, les facteurs ont été transférés à un système de vecteur PFUW inductible DOX pour permettre l'expression contrôlable des TFs. Étant donné que ces deux systèmes contrôlables DOX sont incompatibles (les 34 cellules / H2BGFP et les vecteurs inductibles PFUW), MEFs deC57BL / 6 souris de type sauvage ont été nécessaires. Il était également nécessaire de prévoir un microenvironnement approprié pour permettre hemogenesis de procéder et de créer progéniteurs clonogéniques multilignée.

Les études actuelles qui tentent de reprogrammer des cellules somatiques en cellules souches et progénitrices hématopoïétiques (HSPCs) ont rencontré des niveaux variés de succès 9-11. À ce jour, la génération de la souris et HSPCs transplantables humains avec long terme et la capacité de repopulation auto-renouvellement n'a pas été réalisé en utilisant le même ensemble de TFs. Dans ce protocole, nous fournissons une description détaillée de la stratégie précédemment établie pour induire reproductible hemogenesis en MEF. Nous démontrons que l' introduction d'un ensemble minimal de TFS (Gata2, Gfi1b, cFos et ETV6) est capable d' être l' instigateur d' un programme de développement complexe in vitro qui fournit une plate - forme par laquelle l' hématopoïèse développement et l' application clinique de la reprogrammation hématopoïétiques peuvent encore être étudiés 12.

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Protocole

déclaration éthique: les lignées cellulaires de souris sont dérivées suivant les directives de protection des animaux de l'École Icahn de médecine de Mount Sinai, et doivent se faire dans le respect de toute institution d'accueil.

1. Souris Embryonic Fibroblast (MEF) Isolement de C57BL / 6 Souris

  1. Mettre en place l' accouplement chronométré 13. Une fois qu'un bouchon vaginal est visualisé, considérer ce jour 0,5.
  2. Séparer les femelles branchés à la date de prise et vérifier sur eux le jour de 10-11 pour confirmer la grossesse.
  3. Le jour euthanasier les souris femelles de 13,5 à 14,5 enceintes via inhalation de CO 2 suivie par dislocation cervicale.
  4. Tremper abdomen de la femelle enceinte avec 70% d' éthanol, disséquer la cavité abdominale avec des ciseaux stériles et des pinces vers le bas de la ligne médiane, et enlever chirurgicalement les cornes utérines contenant les embryons 14. Sortez les embryons doucement tout en coupant le tissu abdominal restant.
    REMARQUE: récupérer environ 8 embryons avec 4 de chaque côté.
  5. Placer l'utérus hOrns contenant les embryons dans une boîte de 10 cm avec 5-10 ml de phosphate refroidi une solution saline stérile tamponnée (PBS).
  6. Avec des ciseaux et des pinces stériles, faire une incision le long des cornes utérines afin d'isoler les sacs portant les embryons. Transférer les sacs à une nouvelle boîte de 10 cm avec 5-10 ml de solution stérile refroidi PBS et placer sur de la glace.
  7. Placez quelques-unes des sacs dans une nouvelle boîte de 10 cm avec 5-10 ml de PBS stérile refroidi. Avec des ciseaux et des pinces stériles couper délicatement ouvert les sacs (sans couper trop profond) afin d'éviter de percer les embryons.
  8. Séparer les embryons du placenta en coupant le cordon ombilical.
  9. Transférer les embryons à un nouveau plat de 10 cm contenant 5-10 ml de PBS refroidi et laisser sur la glace tout en complétant les dissections restantes.
  10. Décapitez les embryons en utilisant des pinces stériles. Découpez soigneusement vers le bas de la ligne médiane de l'embryon avec des ciseaux et des pinces stériles, à partir de la zone décapité d'ouvrir l'abdomen. Position pince sous til les organes viscéraux (y compris le cœur, le foie et les poumons) et grattez - les 15.
  11. Coupez le tissu restant en petits morceaux avec des ciseaux et des pinces et transférer dans un tube conique de 50 ml contenant 10 ml de trypsine.
  12. Pipet haut en bas avec 10 ml pipette 20-30 fois pour mélanger et dissocier le tissu.
  13. Laisser incuber le tissu et la trypsine mélange dans un bain d'eau à 37 ° C pendant 45 minutes, en agitant occasionnellement.
  14. Pipet de haut en bas avec une pipette de 10 ml pendant environ 5 minutes pour mélanger le contenu.
  15. Ajouter les cellules trypsinisées à 3x volume de milieu de Eagle modifié norme Dulbecco (DMEM) avec 10% de sérum de veau fœtal (FBS), 10 pg / ml de pénicilline / streptomycine (P / S), et 1 mM de L-glutamine (L-GLUT) dans boîtes de 10 cm (~ 10 ml) et la culture à 37 ° C jusqu'à confluence (environ 2-4 jours). Culture à propos de 1-2 embryons par boîte de 10 cm.
    REMARQUE: les cellules Figer une fois les plaques sont confluentes. Les cellules congelées peuvent être décongelées et repiquées 2 fois plus. Les cellules peuvent être alternativementdivisé 2 fois avant la congélation, puis une fois de plus après avoir été décongelé.

2. Production virale

  1. Multiplier des cellules 293T en plaques de 10 cm avec 10 ml de DMEM avec 10% de FBS, 1% de P / S, 1% de L-glut pour la transfection.
    1. Trypsiniser cellules 293T avec 2 ml de trypsine, incuber à 37 ° C pendant 5 min, recueillir les cellules dans 15 ml tubes, spin à 300 g, et la plaque de manière appropriée (10 ml par boîte de 10 cm).
  2. 24 heures avant la transfection, on divise confluentes 10 cm de plaque de cellules 293T 1: 6 et 10 cm de semence en gélatine enduite (0,1% de gélatine dans du PBS) des plaques.
    NOTE: 4 plaques par le virus seront nécessaires.
    1. Des plaques d'enveloppe en gélatine, ajouter au moins 2 ml de la solution de gélatine à 0,1% pour recouvrir le fond de plaques de 10 cm. Incuber à 37 ° C pendant au moins 20 min. Aspirer la gélatine avant d'ajouter les cellules sur les plaques.
  3. Dans un tube de 15 ml, ajouter 84 pg de plasmide (par exemple Gata2, Gfi1b, cFos ou ETV6 (sous-clone dans le vect PFUW-TetOou 16) ou FUW-M2rtTA 17), 84 pg psPAX2, et 42 pg pMD2.G. Ajouter de l' eau (H 2 O) pour compenser le volume à 2 ml. Préparer un tube pour chaque facteur (par exemple. Gata2, Gfi1b, cFos, ETV6 et FUW-M2rtTA).
  4. Ajouter 250 ul de CaCl2 2M dans chaque tube contenant le mélange de 2 ml composée de 84 ug du gène choisi (Gata2, Gfi1b, cFos, ou ETV6-FUW M2rtTA) + 84 pg + 42 pg psPAX2 pMD2.G + H 2 O .
  5. À l' aide d' une pipette Pasteur insérée dans la pipette d'aide, la libération des bulles dans 2,25 ml d' ADN + H 2 O + 2 M de CaCl2 mélange. Comme les bulles sont produites, placez la pointe d'un P1000 contre la pipette en verre et éjecter lentement 2 ml de 100 mM N, N-bis (2-hydroxyethyl) -2-aminoéthane acide sulfonique (BES) saline jusqu'à la pipette Pasteur 1 ml à la fois.
  6. Incuber tous les tubes dans la hotte de culture à température ambiante pendant au moins 15 min.
    NOTE: Le 4,25 ml d'un mélange (maintenant l' ADN + H 2 O + 2M CaCl2 + BES saline) sera légèrement nuageux.
  7. Comme le mélange incube, les médias Aspirer plaques 293T et ajouter 10 ml de DMEM + 10% de FBS + 1 mM de L-glutamine + 25 nM chloroquine.
    NOTE: Ce média ne contient pas P / S.
  8. Après au moins 15 minutes d'incubation (ou jusqu'à ce que le changement multimédia sur 293T), ajouter 4,25 ml d' ADN + H 2 O + 2 M CaCl 2 + BES mélange salin goutte à goutte aux cellules 293T, distribuant uniformément sur 4 plaques de cellules par tube (soit un peu plus de 1 ml du mélange par plaque).
  9. Incuber les plaques pendant une nuit (O / N) à 37 ° C.
  10. 24 heures après incubation, remplacer les médias sur toutes les plaques avec 4 ml DMEM standard (voir l'étape 1.15).
  11. Gardez les cellules dans un incubateur à 32 ° à partir de maintenant.
  12. 24 h après l'étape 2.10, recueillir des médias dans 50 ml tubes séparés. Remplacer les médias collectés à partir de chaque plaque avec 4 ml de la norme DMEM.
    NOTE: 4 plaques par les premiers résultats de mélange de tube dans 16 ml de milieu recueillies.
    1. UNE12 h de près avoir incubation, recueillir les médias à nouveau dans les mêmes tubes de 50 ml et le remplacer par un autre 4 ml de la norme DMEM.
    2. Après 12 heures d'incubation, de recueillir les médias et ajouter les mêmes tubes de 50 ml.
      REMARQUE: chaque tube doit maintenant contenir environ 48 ml de milieu contenant le virus.
  13. Pour concentrer le virus recueilli, premier filtre les médias recueillies par 0,45 uM filtres de liaison faible teneur en protéines.
  14. Verser les médias filtrés contenant le virus dans des tubes viraux concentration de centrifugation (environ 16 ml à la fois).
  15. Spin à 4000 xg à 4 ° C pendant 25 min et retirez accréditives.
    REMARQUE: Un petit volume de milieu concentré et le virus sera visible dans le filtre.
  16. Ajouter encore 16 ml de milieu contenant le virus par filtration au volume du support + virus concentré restant dans le filtre et mélanger en inversant le tube.
  17. tube de Spin à nouveau à 4000 g à 4 ° C pendant 25 min et défausse accréditives.
  18. Ajouter le reste filtréela collecte du volume média concentré + a laissé le virus dans le filtre et mélanger en inversant le tube.
  19. Faire tourner une nouvelle fois à 4000 g à 4 ° C pendant 10 à 20 min (en fonction du volume du filtre) et faire en sorte que le volume restant de milieux concentrés + virus de gauche dans le filtre est d'environ 1 ml. Si plus de 1 ml de milieu concentré + virus reste dans le filtre, tourner à nouveau à 4000 xg pendant 1 min et répéter jusqu'à 1 ml est laissé dans le filtre.
  20. Aliquoter 200 ul du virus concentré dans 1,5 ml tubes et congeler à -80 ° C ou utiliser immédiatement.

3. Reprogrammation MEF

  1. Pré-manteau 6 et plaques avec 0,5 ml de 0,1% de gélatine dans PBS par puits, en veillant à ce que la gélatine couvre toute la surface du puits. Placer dans un incubateur à 37 ° C et laisser incuber pendant au moins 20 min. Après incubation, enlever les plaques et aspirer la gélatine.
  2. MEFs Plate avec DMEM standard à une densité de 25.000 cellules par puits (150.000 cellulespar plaque de 6 puits) sur la plaque de 6 puits gelatinise (s) de l'étape 3.1 et permet de régler O / N dans un incubateur à 37 °.
  3. Préparer un virus cocktail 100 pi en mélangeant 50 ul M2rtTA et les 50 ul restants un mélange de Gata2, Gfi1b, cFos et ETV6 (12,5 pi chacun).
  4. Aspirer le milieu de MEFs et ajouter 2 ml DMEM standard avec 8 pg / ml de bromure de hexadimethrine.
  5. Transduction chaque puits des plaques MEF avec 15 pi du cocktail de virus et incuber O / N à 37 ° C.
    NOTE: Ceci est jour 0 du processus de reprogrammation.
  6. Le jour 1, après 16-20 heures d'incubation, remplacer le support avec 2 ml frais DMEM standard additionné de 1 pg / ml DOX par puits.
  7. Préparer un milieu de culture hématopoïétique supplémenté avec de l' hydrocortisone (10 -6 M), 100 ng / ml de facteur de cellules souches (SCF), 100 ng / ml en rapport avec Fms tyrosine kinase 3 ligand (Flt3L), 20 ng / ml d' interleukine-3 (IL - 3) 20 ng / ml d'interleukine-6 ​​(IL-6) et 1 pg / ml DOX.
  8. Le jour 4 aspirate médias de chaque puits et laver les cellules avec 1 ml de PBS par puits.
  9. Aspirer PBS, dissocier les cellules en utilisant 1 ml de trypsine à 0,05% par puits et de recueillir les cellules.
  10. Compter les cellules avec un hémocytomètre, rotation à 300 xg pendant 5 min, remettre en suspension dans 12 ml de milieu hématopoïétiques décrites à l'étape 3.7 et la plaque de 60.000 cellules par plaque de 6 puits sur 0,1% de gélatine plaques revêtues (2 ml par puits, 10.000 cellules par puits ).
  11. Remplacer les médias avec un milieu frais de culture hématopoïétique Complété tous les 6 jours pour la durée de la culture (35 à 36 jours).
  12. Analyser soit des cellules intermédiaires ou des cellules hématopoïétiques comme émergentes via immunocoloration 12, analyse FACS 8,12, qRT-PCR 12, et le séquençage de l' ARNm 12 pour confirmer l'acquisition de endothéliale hemogenic ou marqueurs HSC-comme et l' expression génique.

4. placentaire Agrégation et unité formant colonie (UFC) Essais en méthylcellulose

  1. Disséquer placentas de femmes enceintes C57Bl / 6 souris comme précédemment décrits 18 à E12.5 et de garder le tissu sur la glace.
  2. Pour démarrer le placenta dissociation 19, laver le tissu placentaire dans 2-5 ml de 0,2% collagénase de type I dans du PBS avec 20% de FBS et désolidarise mécaniquement avec une aiguille 18G monté dans une seringue de 5 ml par passage du placenta et du PBS à travers l'aiguille au moins 3 fois.
  3. Après dissociation mécanique, garder les cellules placentaires dans 2-5 ml de solution de collagénase à 37 ° C pendant 1,5 heure.
  4. cellules Passage par 20-25 G aiguilles montés sur seringues de 5 ml plusieurs fois pour plus dissocier mécaniquement les cellules placentaires.
  5. Filtre suspensions de cellules isolées à travers 70 um crépines cellulaires.
  6. Compter les cellules avec un hémocytomètre et irradier à 2000 cGy pour l' inactivation mitotique 20.
  7. Ajouter 10 ml de milieu de culture hématopoïétique supplémenté avec 100 ng ml SCF / 100 ng ml Flt3L / 20 ng / ml d'IL-3, 20 ng / ml d'IL-6 et 10 ng / thrombopoïétine ml (TPO) à 10 cm plat.
    NOTE: DOX est pas nécessaire à ce stade.
  8. Placer un filtre 0,65 um directement sur des milieux de culture hématopoïétique dans le plat, ce qui lui permet de flotter pour créer une interface liquide-gaz et mettre le plat de côté.
  9. Dissocier jour 25 MEFs transduites (dérivés de l'étape 3.11) comme décrit dans les étapes 3.8-3.10 et mélanger 33.000 des MEFs transduction avec 167.000 cellules des agrégats placentaires de l'étape 4.6 (1: 6 ratio).
  10. Pour générer un agrégat 18,21, le premier tour sur le MEF et la composition cellulaire placentaire de l' étape 4.9 pendant 5 min à 300 x g. Aspirer les médias et remettre en suspension les cellules sédimentées dans 30-50 ul de la norme DMEM en utilisant une pipette P200, le dessin de la suspension cellulaire unique dans le nonbevelled pointe de pipette 200 pi.
  11. Obturer la pointe de la pipette avec un film de paraffine. Placez la pointe bloquée dans un tube de centrifugeuse de 15 ml et centrifuger pendant 5 min à 300 xg donc une forme de granulés à l'extrémité couverte de la pointe.
  12. Retirez la pointe du tube soigneusement 15 ml et lieula pointe sur l'extrémité de la pipette P200. Jeter le film de paraffine et extruder le culot de cellules sur le filtre flottant à l'étape 4.8.
    NOTE: Plate au plus 3 agrégats par filtre.
  13. Culture des agrégats sur les 0,65 um filtres flottants pour 4-5 jours à 37 ° C avec 5% de CO 2.
  14. Recueillir les agrégats (au plus 3 par filtre) avec un racleur de cellules, de les combiner, et digérer avec 0,2% de collagénase, en suivant le même protocole que fait avec l'ensemble des placentas de dissocier les cellules (étapes 4,2-4,5).
  15. Après dissociation, laver les granulats avec 2-5 ml de PBS supplémenté avec 5% de FBS et centrifuger les cellules à 300 xg pendant 5 min.
  16. Remise en suspension des agrégats dans 500 ul de milieu DMEM sans SVF, P / S ou L-glut. Prenez ce 500 resuspension ul et l'ajouter à 3 ml de 1% de méthylcellulose médias additionné de 10 ng / ml de TPO, en évitant soigneusement la formation de bulles. Plaque des volumes égaux de ce mélange dans des boîtes de culture 3 35 x 10 mm non traité pourCFU Dosages 12.
  17. En tant que témoin, la culture irradiée agrégats placentaires sans mélange dans MEFs reprogrammées 4-5 jours et dans des dosages de CFU comme décrit ci-dessus dans les étapes 4.7-4.16.
    REMARQUE: seuls Ces agrégats ne forment pas de colonies.
  18. Nombre de colonies hématopoïétiques manuellement au microscope après 10-14 jours de culture à 37 ° C avec 5% de CO 2.
  19. Cytospin 22 colonies choisi pour montrer phénotype morphologique des cellules individuelles.

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Résultats

Hématopoïèse est un processus complexe du développement qui commence dans différents sites embryonnaires. Les cellules endothéliales Hemogenic résident dans ces sites et donnent lieu à des CSH par cellule en herbe 23. Ce processus ne peut actuellement pas être reproduit en plaçant CSH ou précurseurs hématopoïétiques dans la culture, ce qui nécessite une méthodologie pour obtenir en quelque sorte ces cellules in vitro, soit par l' expansion HSPC ex vivo ou...

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Discussion

Génération HSPCs de novo à partir de cellules somatiques facilement réalisables offre une méthode unique pour étudier l' hématopoïèse in vitro, et la possibilité de potentiellement appliquer cette technologie au système humain. Cette traduction générerait un nouvel outil pour étudier la maladie hématologique humaine dans un plat, ainsi que de fournir des plates-formes de dépistage des drogues et ciblage génétique des possibilités de traiter de nombreux troubles avec de nouveaux produits thérapeutiq...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par une subvention du NHLBI à K.M. et I.R.L. (1RO1HL119404). Carlos-Filipe Pereira a été récipiendaire d’une bourse biomédicale senior Revson. Nous remercions le Mount Sinai hESC/iPSC Shared Resource Facility et S. D’Souza pour leur aide avec le matériel et les protocoles. Nous remercions également les installations de cytométrie en flux, de génomique et de souris du Mont Sinaï.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
DMEMInvitrogen11965-092
0.45 &mu ; Filtres MCorning430625
Amicon Filtres ultracentrifugesMilliporeUFC900324
Pénicilline/StreptomycineInvitrogen15140-122
L-GlutamineInvitrogen25030-081
FBSGemini’s Benchmark100-106
PBSLife Technologies14190-144
Aiguilles 18 GBD305195
Aiguilles 20 GBD305175
Aiguilles 25 GBD305125
Collagénase Type ISigmaC0130-100MG
TrypLE ExpressInvitrogen12605-010
Média myélocultiqueStem Cell TechnologiesM5300
SCFR & D Systems455-MC
Flt3LR & D Systems427-FL
IL-3R & D Systems403-ML
IL-6R & D Systems406-ML
TPOR & D Systems488-TO
DoxycyclineSigmaD9891-1G
Polybrène (bromure d’hexadiméthrine)SigmaAL-118
Durapore 0.65 &mu ; Filtres à membraneM MilliporeDVPP14250
MéthylcelluloseStem Cell TechnologiesMethocult M3434
HydrocortisoneStem Cell Technologies07904
C57BL/6 sourisThe Jackson Laboratory000664
GelatinSigmaG-1890 100g
pFUW-tetOAddgenePlasmide #20321
Gata2OrigeneMR226728
Gfi1bOrigeneMR204861
cFos  ;Plasmide Addgene#19259
Etv6OrigeneMR207053
psPAX2Plasmide Addgene#12260
pMD2.GPlasmide Addgene#12259
CaCl2SigmaC5670-100g
FUW-M2rtTAAddgene#20342
Culture de 35 mm x 10 mm platsThermo Scientific171099
Plasmide

Références

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