Utilisant des tumeurs provenant de patients dans un modèle préclinique sous-cutanée est une excellente façon d'étudier l'efficacité de nouvelles thérapies, la découverte de biomarqueurs prédictifs et les voies résistantes aux médicaments. Ce modèle, dans le processus de développement de médicaments, est essentielle pour déterminer le sort de nombreuses thérapies anticancéreuses avant investigation clinique.
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Article de méthode
Développement et maintenance d'une tumeur du patient Préclinique dérivé modèle de xénogreffe de l'enquête de Novel Anti-Cancer Therapies
Dans cet article
Résumé
Résumé
Les modèles de xénogreffes tumorales dérivées de patients (PDTX) fournissent une plate-forme nécessaire pour faciliter le développement de médicaments anticancéreux avant les essais sur l’homme. Des morceaux de tumeur humaine sont injectés par voie sous-cutanée dans des souris nues athymiques (immunodéprimées, déficientes en lymphocytes T) pour créer une banque de tumeurs et sont ensuite passés dans différentes générations de souris afin de maintenir ces tumeurs des patients. Il est important de noter que l’hétérogénéité cellulaire de la tumeur d’origine est étroitement imitée dans ce modèle, qui fournit un modèle plus pertinent sur le plan clinique pour l’évaluation des études d’efficacité des médicaments (monothérapie et combinaison), l’analyse des biomarqueurs, les voies résistantes et la biologie des cellules souches cancéreuses. Parmi les limites du modèle PDTX, citons le remplacement du stroma humain par du stroma de souris après la première génération chez la souris, l’incapacité d’étudier les effets du traitement sur les métastases en raison des injections sous-cutanées des tumeurs et le manque d’évaluation des immunothérapies en raison de l’utilisation de souris immunodéprimées. Cependant, même avec ces limitations, le modèle PDTX fournit une plate-forme préclinique puissante dans le processus de découverte de médicaments.
Introduction
Le cancer colorectal (CRC) est un facteur important de décès par cancer aux États-Unis. En 2015, il y avait environ 132,700 nouveaux cas de CRC avec 49.700 décès 1. Bien que le pronostic chez les patients présentant une maladie localisée est excellente, les patients ayant une maladie avancée ont des résultats médiocres, ce qui en fait une priorité majeure dans le développement de nouvelles thérapies. Malgré le niveau de régimes de soins de chimiothérapie et les produits biologiques plus récents qui sont déployés contre cette maladie, il y a eu seulement une augmentation progressive de la survie globale. Par conséquent, il existe un effort significatif dans la compréhension des voies pilotes impliqués dans la facilitation de la croissance tumorale dans cette maladie. L'Atlas Réseau Cancer Genome a récemment identifié de nombreuses voies principales qui sont impliqués dans CRC dysrégulation et comprennent: WNT, phosphoinositide 3-kinase (PI3K), RAS, facteur de croissance transformant β (TGF - β) et TP53 2. Ensemble, les enquêtes décrivant otses voies qui potentialisent la croissance des CRC ont enflammé le développement de nouvelles thérapies visant à améliorer de manière significative la survie dans cette population de patients 3-5. Utilisant des modèles précliniques en oncologie développement de médicaments ont joué un rôle essentiel dans ce processus pour prédire l'activité clinique de ces nouveaux composés.
Différents modèles pré-cliniques ont été utilisés dans le processus de développement de médicaments. Considérant que les modèles animaux transgéniques précliniques et des lignées cellulaires immortalisées ont échoué dans la détermination de l'activité clinique de nouvelles thérapies en oncologie, en grande partie en raison de leur incapacité à refléter la complexité des tumeurs humaines, xénogreffe de tumeur du patient dérivés (PDTX) modèles ont été établis. Le plus grand avantage de ce modèle est que l' hétérogénéité de la tumeur reste intacte et reflète étroitement les caractéristiques moléculaires et clonalité de l'origine de la tumeur du patient 6-9. Modèles PDTX fournissent un excellent in vivoplateforme préclinique pour l' étude de nouveaux agents, les voies de résistance aux médicaments, les stratégies combinatoires, et souches du cancer de la biologie cellulaire 10.
Un aperçu général du processus PDTX est illustrée à la figure 1. Il commence dans la clinique, des patients consentants pour permettre une partie de leur tissu tumoral en excès doit être utilisé pour cette recherche. Ensuite, à la chirurgie, un morceau de la tumeur est majoré par un pathologiste et mis en médias pour être transportés au personnel de recherche. Immédiatement après cela, une partie de la tumeur est découpée en petits morceaux et transplantés par voie sous- cutanée dans des souris immunodéficientes. Une fois que la tumeur se développe, elle est soumise à un passage dans les différentes générations de souris afin de maintenir la tumeur 10. En règle générale, après la génération F3 de la tumeur peut être étendue dans une étude de traitement, où de nouveaux composés et / ou des thérapies combinatoires sont évaluées. Utilisant des biomarqueurs prédictifs potentiels Next Gen Seq (Exome Seq, ARN Seq et SNP array) sont découvrired qui aident à la sélection des patients qui peuvent tirer profit d'un traitement particulier.
Les objectifs généraux de l'utilisation de modèles de PDTX sont: 1) évaluer l'efficacité de nouveaux traitements en monothérapie ou en association et 2) identifier des biomarqueurs prédictifs de la sensibilité ou de la résistance avant investigation clinique. Dans ce manuscrit, nous fournissons la méthodologie dans l'initiation et le maintien d'une banque CRC PDTX et de fournir les avantages et les limites de ce modèle dans la découverte de développement de médicaments.
Figure 1. Vue d' ensemble du modèle de protocole CRC PDTX. Un patient tumeur dérivé est reçu de la chirurgie et immédiatement injecté dans des souris nude athymiques sous - cutanée. Une fois que la tumeur se développe, il est élargi dans les générations suivantes et finalement élargi pour les études de traitement. Traitement respoNSE sont évalués et biomarqueurs prédictifs sont identifiés qui peuvent aider à la sélection des patients. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Protocole
Déclaration d'éthique: échantillons de tumeur adénocarcinome colorectal patients dérivés ont été obtenus auprès de patients consentants à l'Université de Colorado Hospital, conformément à un protocole approuvé par le Conseil d'examen institutionnel Multiple Colorado (08-0439). Tous les travaux des animaux a été réalisée dans des protocoles d'animaux approuvés par l'Université du Colorado Denver Institutional Animal Care et utilisation Commission (IACUC, Protocole # 51412 (06) 1E et 96813 (04) 1F).
1. Réception et préparation de sang du patient
- Collecter 1 - 2 ml de sang dans un tube de séparation du sang / cellulaire contenant du citrate de sodium (phases de tubes inclus sont le plasma, les lymphocytes et la bande de monocytes, le liquide à gradient de densité, une barrière de gel, et les erythrocytes et les neutrophiles). Attention, suivre les directives du sang Borne Pathogène avec le sang ou les tissus.
Nota: Les PBMC et de plasma peuvent être utilisées pour des études ultérieures qui peuvent inclure: la comparaison d'une variation génétique germinale des mutations tumorales, isolant circules cellules tumorales ting, l' évaluation de l' ADN de cellules libres (cfDNA), les protéines d' examen et microARN, etc. - Centrifuger la / cellule tube de séparation du sang à 2500 g pendant 15 min sans frein à température ambiante.
- Recueillir les cellules mononucléées du sang périphérique (CMSP en lymphocytes et monocytes bande de tubes) et de mettre dans un tube de 1,5 ml (clair, autoclavable, DNase, RNase, et apyrogène), et remplir la partie supérieure du tube avec stérile Phosphate-Buffered une solution saline (PBS).
- Centrifuger à 2300 g pendant 3 min à température ambiante pour former un culot de PBMCs au fond du tube. Ensuite, retirer le surnageant avec précaution. Ajouter 1 ml de PBS stérile pour laver le culot et centrifuger à 3000 xg pendant 30 secondes, puis retirer le surnageant.
- Utiliser une pipette pour recueillir le plasma du tube de séparation de sang / cellule (en phase plasma d'un tube) dans une fiole cryogénique de 1,5 ml stérile (DNase et RNase, aucun ADN humain, une endotoxine libre) et de mettre le plasma et le culot de PBMC ce en -80 ° C freezer pour le stockage.
2. Réception et préparation des patients tumeur échantillon
- Préparer une ou l'autre RPMI ou milieu DMEM avec 1: 100 (10%) de pénicilline-streptomycine et des acides aminés non essentiels, 1: 1000 (1%) Plasmocin et 10% inactivé de sérum bovin fœtal (en milieu complet) et ajouter 20 à 25 ml à un récipient de collecte stérile pour le spécimen de tumeur.
- Récupérer l'échantillon de la tumeur dans une tasse stérile contenant un milieu complet sur la glace ou de conserver à 4 ° C.
Note: L'échantillon de tumeur est un fragment de tissu tumoral du patient en excès qui est éliminée par un chirurgien, traitée par un pathologiste, et placé dans un récipient de collecte stérile avec un milieu complet. Attention, suivre les directives du sang Borne Pathogène avec le sang ou les tissus. De plus, idéalement d'injecter cinq souris, la tumeur doit être d'environ 1 cm³. - Amener l'échantillon de tumeur à l'animalerie pour l'injection dans des souris immunodéprimées.
Remarque: Il est préférable de traiter l'échantillon de tumeur le plus tôt possible.- Dans une hotte à flux laminaire, placer l'échantillon de la tumeur dans une boîte stérile de coupe en plastique de la coupe de tumeur. Utilisez autoclavé-petits ciseaux et des pinces pour couper dans 10-12 environ 3 x 3 x 3 mm morceaux et le placer dans un tube de 1,5 ml autoclavé rempli de 300 pi de gélatineuse solution de mélange de protéines. Gardez le tube sur la glace.
- Comme une priorité d'injecter une tumeur dans des souris, mais s'il y a une tumeur reste, rassembler le flash gelé flacons (FF), fixés au formol paraffine (FFPE) les coupes, et un flacon de tumeur viable.
- Pour FF, de recueillir de petits morceaux de tissus tumoraux à partir d'un flacon cryogénique stérile pour une analyse ultérieure telle qu'une protéine, un ARN, ou l'isolement de l'ADN. Placez FF immédiatement dans un dewar d'azote liquide et stocker à long terme dans un -80 ° C congélateur.
- Pour FFPE, s'il y a assez tumeur, lieu 3 petits morceaux dans une tasse de formaline 10 ml de 10% et le processus en paraffine blocs embarqués une fois la tumeur a été dans le formol pendant au moins 24 heures.
Remarque: 24 h est baséau large de nos suggestions histologie de base 11. - Enfin, placer la tumeur restante dans un tube cryogénique. Faire des médias viables en ajoutant 10% de diméthylsulfoxyde (DMSO) pour compléter les médias. Ensuite, ajoutez 1 ml à un tube cryogénique et de stocker sur la glace. Note: Ne pas garder sur la glace pendant de longues périodes de temps.
- Couper toute tumeur restant en petits morceaux qui seront idéalement être suffisant pour 10 tumeurs à injecter dans 5 souris à l'avenir. Ensuite, placez le tube de tumeur viable sur la glace jusqu'à ce qu'il puisse être placé dans un récipient de congélation d'alcool isopropylique (gèle lentement la tumeur 1 ° C à la fois) et mis en -80 ° C congélateur pour veiller à ce que les tumeurs ne meurent pas au cours de la processus de congélation.
Remarque: Pour le stockage à long terme, les tumeurs sont prélevées (après 2 - 3 jours) et on les place dans un grand vase Dewar d'azote liquide. S'il vous plaît noter que les tubes viables ne devraient pas être autorisés à dégeler à moins qu'il est sorti d'injecter à des souris.
- Couper toute tumeur restant en petits morceaux qui seront idéalement être suffisant pour 10 tumeurs à injecter dans 5 souris à l'avenir. Ensuite, placez le tube de tumeur viable sur la glace jusqu'à ce qu'il puisse être placé dans un récipient de congélation d'alcool isopropylique (gèle lentement la tumeur 1 ° C à la fois) et mis en -80 ° C congélateur pour veiller à ce que les tumeurs ne meurent pas au cours de la processus de congélation.
3.L'injection de patients dérivées de xénogreffes tumorales
- Utilisez cinq 6 - 8 semaine vieux mâle et / ou des souris nude athymiques femelles (T-cellule déficiente) pour chaque tumeur dérivé du patient séparé. Injecter un total de 10 tumeurs (2 injections par souris) sous-cutanée (SQ).
Note: La tumeur humaine d'origine est désigné comme F0, puis une fois injecté dans les souris de la prochaine génération est F1. En outre, l'utilisation de pinces autoclaves, des ciseaux, et trocarts pour chaque explant unique. - pièces de charge de la tumeur de la solution de mélange de protéines gélatineuse dans autoclavées 12 G trocarts et veiller à ce que la tumeur est complètement poussé dans le trocart.
- Dans une hotte à flux laminaire stérile, placer 5 souris dans une boîte d'anesthésie qui est connectée à une machine isoflurane anesthésique (a commencé au taux initial de 5% d'isoflurane, 3 - 4% d'oxygène, et 2 - 3% d'isoflurane pour le maintien de l'anesthésie) et le filtre à charbon (absorbe l'excès de gaz).
Note: Un technicien expérimenté devrait être en mesure d'effectuer toute la procédure surune cage de 5 souris à l'intérieur d'environ 5 min (environ 30 sec par souris). Par conséquent, le soutien thermique supplémentaire et la lubrification des yeux ne sont généralement pas utilisés. Pour les individus moins expérimentés ou pendant la formation, il est fortement recommandé que les individus soit effectuer la procédure sur moins d'animaux à un moment et / ou utiliser une lubrification pad / oculaire de réchauffement durant la procédure si les animaux seront anesthésiés plus de 5 min. La procédure est fondée sur des normes IACUC à notre université.
- Dans une hotte à flux laminaire stérile, placer 5 souris dans une boîte d'anesthésie qui est connectée à une machine isoflurane anesthésique (a commencé au taux initial de 5% d'isoflurane, 3 - 4% d'oxygène, et 2 - 3% d'isoflurane pour le maintien de l'anesthésie) et le filtre à charbon (absorbe l'excès de gaz).
- Pincez un orteil de la souris pour assurer la souris ne répond plus, puis prendre la souris hors de la boîte isoflurane. Placer la souris sur un champ propre à injecter des tumeurs de la région dorsale du cou milieu et glissant avec la voie sous-cutanée trocart vers le bas jusqu'à ce que la région du flanc est atteint avec autoclavé 12 g trocarts.
- Fournir une sous-cutanée de la tumeur de chaque côté du flanc de la souris. Pincer la tumeur lorsque le trocart est retiré, en veillant à ce que la tumeur reste dans la région de flanc souhaitée. Le gemélange de protéines latinous durcit avec la température du corps de la souris et encapsule la tumeur pendant environ 1 semaine pour aider la tumeur à croître et à le fixer sur le tissu conjonctif SQ. La lésion faite par le trocart est pas supérieure à 4 mm, et il n'y a pas besoin de fermer la peau avec des agrafes.
Note: Nos vétérinaires déterminées aucune fermeture est besoin en fonction de très petite taille de la lésion, le temps de guérison rapide (région dorsale du cou milieu réduit toute tension de la peau ou le toilettage de la lésion), aucune infection noté, et une surveillance étroite des animaux au cours de cette période de temps .
- Fournir une sous-cutanée de la tumeur de chaque côté du flanc de la souris. Pincer la tumeur lorsque le trocart est retiré, en veillant à ce que la tumeur reste dans la région de flanc souhaitée. Le gemélange de protéines latinous durcit avec la température du corps de la souris et encapsule la tumeur pendant environ 1 semaine pour aider la tumeur à croître et à le fixer sur le tissu conjonctif SQ. La lésion faite par le trocart est pas supérieure à 4 mm, et il n'y a pas besoin de fermer la peau avec des agrafes.
- Avant la souris est SQ (médicaments contre la douleur) complètement éveillé injection de méloxicam 2 mg / kg à distance du site d'injection de la tumeur. Ensuite, placez la souris dans la cage et surveiller jusqu'à ce que la souris est éveillé et en mouvement.
Remarque: Ne laissez pas la récupération des animaux sans surveillance jusqu'à ce que complètement éveillé. dosage Meloxicam est basé sur les normes IACUC à notre université.- Ensuite, répétez la même procédure avec le 4restante souris et contrôler leur respiration.
Remarque: S'il vous plaît noter que ceci est une procédure très rapide et les souris se réveillent très tôt après l'injection Meloxicam, mais ajuster isoflurane au besoin. Chaque fois que la souris est sortie, baissez le isoflurane. Le Meloxicam va durer 24 heures et les lésions des trocarts va guérir complètement en 1 semaine.
- Ensuite, répétez la même procédure avec le 4restante souris et contrôler leur respiration.
4. Maintenance du patient dérivées tumeur xénogreffe Bank
- Surveiller la croissance et la santé des souris au moins une fois par semaine. Utiliser une feuille (ou un autre système de suivi) pour suivre les tailles des tumeurs, la génération de la tumeur, la date de l'injection de la tumeur, et la santé de la souris.
Remarque: Si les souris ont perdu 15% de leur poids corporel initial, faible score de condition corporelle (≥ 2), ont ulcérations tumorales, des tumeurs atteignant 2.000 mm 3 ou tumeurs au total 3000 mm 3, ou sont maladifs (recroquevillée, froid, léthargie, etc .) de quelque manière, les souris sont euthanasiées par CO₂ ou anesthésiés suivie par dislocation cervicale queméthode SECONDAIRE. Euthanasier via l'anesthésie et la dislocation cervicale si la collecte tumeur, les souris autrement sont euthanasiés par CO₂ et dislocation cervicale. - Lorsqu'une tumeur est d' environ 1500-2000 mm 3 anesthésier la souris comme décrit ci - dessus, puis effectuer la dislocation cervicale pour euthanasier.
- Vérifiez que la souris n'a pas de pouls. Exciser la tumeur SQ avec des ciseaux et des pinces autoclavés.
NOTE: Laisser les tumeurs de croître jusqu'à 1 an et si aucune tumeur est vu alors euthanasier les souris via CO 2, suivie par dislocation cervicale comme méthode secondaire. - Passage le meilleur de la tumeur de plus en plus dans la prochaine génération (aka une nouvelle série de 5 souris). Utilisez les instructions ci-dessus pour recueillir 10 - 12 tumeurs pour le passage et ensuite recueillir les restes de la tumeur comme décrit également ci-dessus.
Note: La collecte de nombreux tubes viables est très important dans les premières générations (F1 - F8); donc recueillir plusieurs tubes viables, tubes FF et 1 FFPE par generation. - Gardez les souris restantes jusqu'à ce qu'une nouvelle génération de souris a la croissance tumorale d'environ 300 mm 3. Lorsque les souris restantes ont des tumeurs qui sont grandes, continuer à recueillir comme décrit ci-dessus.
- Vérifiez que la souris n'a pas de pouls. Exciser la tumeur SQ avec des ciseaux et des pinces autoclavés.
- Continuer à des tumeurs de passage et de recueillir à chaque étape jusqu'à F15. À ce stade, prendre un tube viable de la première génération possible hors de l'azote liquide et laisser décongeler sur la glace et suivre les procédures tumorales d'injection décrites ci-dessus.
Remarque: Les tumeurs qui se développent à partir de tubes viables prennent plus de temps à se développer chez la souris par rapport à la transmission de génération en génération, donc gardez cela à l'esprit lors de la planification. Si un modèle de PDTX particulier ne sont plus nécessaires à tout passage, euthanasier et de recueillir la tumeur, afin d'assurer de nombreux tubes viables sont collectés pour une utilisation future.
5. Developmental Therapeutics avec des patients dérivées xénogreffes tumorales
Note: La plupart des tumeurs à la génération F3 ont une bonne cinétique de croissance (une croissance plus rapide et plus consistent), par conséquent, procéder à PDTX études d'efficacité des médicaments.
- Lorsque la tumeur désirée est très grande (1.500 - 2.000 mm 3), suivre les procédures ci - dessus pour recueillir la tumeur de se développer dans la quantité désirée de souris.
- En fonction de l'hypothèse testée à déterminer le nombre requis de tumeurs par groupe de traitement.
Note: 1 ml de solution gélatineuse mélange de protéines d'environ 30 pièces en forme de petites tumeurs peuvent (en fonction de la morphologie de la tumeur) pour l'injection à des souris.
- En fonction de l'hypothèse testée à déterminer le nombre requis de tumeurs par groupe de traitement.
- Vérifiez les souris avec des tumeurs hebdomadaires et quand la plupart des tumeurs sont visiblement petite (environ entre 50 - 300 mm³) mesurer les tumeurs avec étriers pour déterminer le volume de la tumeur. Le volume des tumeurs = [width² (mesure la plus petite) x longueur (mesure la plus grande)] x 0,52.
Remarque: La solution du mélange de protéines gélatineux entoure les morceaux de tumeur injectées pendant une semaine, puis après la croissance tumorale d'une semaine sera exacte. - Utiliser les volumes de tumeur entre 50 - 300 mm³ et lan moyenne de la tumeur gauche et droite. Ensuite randomiser en groupes de traitement de 10 tumeurs par groupe et une moyenne du groupe, au sein de quelques chiffres de l'autre. Ensuite, trier les souris en groupes et de commencer l'étude de traitement souhaité.
- Dose souris avec la drogue (calendrier dépendant drogue), peser et mesurer (tumeur) deux fois par semaine. A la fin de l'étude, euthanasier les souris par l'anesthésie et la dislocation cervicale et de recueillir la tumeur pour l'analyse pharmacodynamique future dans le laboratoire.
Note: L'étude dure 30 jours en fonction de la taille et de la santé des souris tumeur du véhicule.
6. Organisation d'une banque PDTX
- Gardez une forme bien documentée pour éviter la répétition de la recherche et l'utilisation appropriée des animaux.
NOTE: Ceci est la clé d'une banque de PDTX réussie.- Utilisez des feuilles de calcul pour garder la trace d'une tumeur du patient humain dans la clinique, à des souris dans la banque PDTX, les traitements, les données, et ce qui est collecté. Note: ceci inclut congélateur, dewars d'azote liquide, Et le stockage de FFPE ainsi.
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Résultats
Similitudes de mutations communes dans les modèles CRC PDTX et l'TCGA
Nous avons examiné si le pourcentage de mutations communes (KRAS, NRAS, BRAF, PIK3CA, APC, CTNNB1 et TP53) dans la banque CRC PDTX étaient représentatives de la fréquence de mutation observée dans la population des patients CRC. Comme le montre la figure 2A (TCGA) et B (CRC PDTX banque), la fréq...
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Discussion
La PDTX plate-forme de découverte de médicaments offre un modèle amélioré aux insuffisances des autres modèles précliniques qui sont peu fiables pour prédire l'activité clinique des nouveaux composés. Fait important, les tumeurs de ce modèle sont biologiquement stable, conservent un potentiel métastatique, et présentent la même réactivité médicaments de génération en génération. Dans ce modèle, dérivées patient tumeurs sont injectées dans des souris nude athymiques, repiquées, et ensuite utilisées dans l'évaluat...
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Remerciements
Ce travail a été soutenu par la subvention 1R01CA152303-01.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| RPMI ou DMEM | Corning | 10-040-CV | |
| Pénicilline-Streptomycine | Corning | 30-002-CI | |
| Acides aminés non essentiels | Corning | 25-025-CI | |
| Sérum fœtal bovin | Corning | 35-010-CV | Décongélation en -4 ° ; C, puis activez pendant 30 min à 60 ° ; C bain d’eau |
| Tube sanguin CPT Cuvette | de | 362761 | |
| Microcentrifugeuse Surelock | A-7002 | ||
| Saline tamponnée au phosphate | Corning | 21-040-CV | |
| Flacons cyrogènes Cyroking | C0732901 | ||
| Plat de découpe de tumeurs en plastique | Trueline | TR4001 | |
| Ciseaux | Roboz | RS-5881 | |
| Pince | Roboz | RS-5135 | |
| Matrigel (mélange de protéines gélatineuses) | Corning | 354234 | Stocker à -20 ou -80 ° ; C, puis décongeler sur de la glace, ne pas laisser à RT |
| 10 % Gobelets de formol | Protocole | 032-059 | |
| Azote liquide Dewar Stockage | Thermolyne | CY50900 | |
| Azote liquide portable | dewar Nalgene | 4150-2000 | |
| Diméthyl Sulfoxyde | Fischer | 67-68-5 | |
| Récipient de congélation : Mr Frosty | Nalgene | 5100-0001 | |
| Alcool isopropylique | Decon | 64-17-5 | |
| Trocarts | Innovative Research of America | MP-182 | |
| Patterson Boîte | |||
| Patterson Isoflurane vétérinaire | |||
| Vet one | 1038005 | ||
| F-Air Canister | Bickford Omnicon | 80120 | |
| Meloxicam | Vet one | 5182-90C | |
| Etriers | Fowler | 54-100-167 | |
| Pèse-personne | Ohaus | Scout Pro SP601 |
Références
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