Method Article

Préparation d'échantillons pour l'analyse de masse Cytométrie

DOI:

10.3791/54394

⸱

April 29th, 2017

 ,  , 
1Epigenetics and Molecular Carcinogenesis, The University of Texas MD Anderson Cancer Center

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cet article décrit la collecte et le traitement d’échantillons pour l’analyse par cytométrie de masse.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Masse utilise cytométrie anticorps conjugués avec des étiquettes de métaux lourds, une approche qui a considérablement augmenté le nombre de paramètres et les possibilités d'une analyse approfondie bien au-delà de ce qui est possible avec la cytométrie de flux par fluorescence conventionnelle. Comme pour toute nouvelle technologie, il y a des étapes essentielles qui contribuent à assurer la production fiable de données de haute qualité. Présenté ici est un protocole optimisé qui intègre plusieurs techniques pour le traitement des échantillons de cellules pour l'analyse de cytométrie de masse. Les méthodes décrites ici aideront l'utilisateur à éviter les pièges courants et obtenir des résultats cohérents en réduisant au minimum la variabilité, qui peut conduire à des données inexactes. Pour éclairer la conception expérimentale, la raison d'être des étapes facultatives ou alternatives dans le protocole et leur efficacité dans la découverte de nouvelles découvertes dans la biologie du système étudié est couvert. Enfin, des données représentatives sont présentées pour illustrer les résultats attendus des techniques presented ici.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cytometry permet la mesure simultanée de plusieurs cibles d'anticorps au niveau de la cellule unique sur de grandes populations de cellules. En cytométrie de flux à base de fluorescence classique, le nombre de paramètres qui peuvent être quantifiés est limitée par le chevauchement spectral entre le spectre d'émission de multiples fluorophores, ce qui nécessite des calculs de compensation de plus en plus complexes comme le nombre d'augmentations de paramètres. Ces limitations sont traitées par cytométrie de masse, où les anticorps conjugués à métaux lourds sont détectés et quantifiés par le temps de la spectrométrie de masse de vol (TOF) d'élargir considérablement le nombre de paramètres collectés en même temps et donner un profil de protéines d'abondance dimensionnelle élevée pour chaque cellule individuelle.

Une compréhension de base du fonctionnement de l'instrument de cytométrie de masse est bénéfique pour l'utilisateur et peut être essentielle pour le dépannage. Pour une description plus complète de mise au point et l'exécution d'une machine à cytométrie de masse,voir le manuscrit lié 1. En bref, un échantillon de cellules est marqué avec un panel d'anticorps conjugués métalliques ciblant des marqueurs de surface cellulaire, des protéines cytoplasmiques, des protéines nucléaires, des protéines de la chromatine lié ou d' autres epitopes d'intérêt (figure 1i). Les cellules marquées sont chargés sur la machine, soit un à la fois par injection manuelle ou en utilisant un passeur d'échantillons que les échantillons à partir d'une plaque à 96 puits. Les cellules chargées sont injectés par l' intermédiaire d' un nébuliseur, qui génère une pulvérisation de gouttelettes de liquide d' encapsulation des cellules (Figure 1ii). Cette pulvérisation est positionnée de telle sorte que les cellules sont ionisés par une torche à plasma d'argon. Cette ionisation génère un nuage de particules comprenant tous les atomes constitutifs de chaque cellule (Figure 1iii). Comme ce nuage de particules se déplace vers le détecteur, les atomes de faible masse atomique sont séparés des ions de masse élevée par un filtre de masse quadripolaire. Les hauts ions de masse restants continuent au détecteur, où le abundance de chaque isotope est quantifiée (Figure 1IV). Les données brutes recueillies par le détecteur, sont analysés par le logiciel d'instruments de cytométrie de masse pour identifier les événements cellulaires. Pour chaque événement de cellule identifiée, le signal détecté dans chaque canal est quantifié et enregistré dans le fichier de sortie. Les canaux de masse utilisés pour détecter les anticorps conjugués métal lourd présentent un recouvrement spectral minimal, qui varie de 0,4% avec la plupart des contributions inférieures à 1%. En raison de ce faible diaphonie entre les canaux, il est généralement nécessaire de transformer les données avec une matrice de compensation avant l' analyse 2. Cependant, il faut prendre soin lors de la conception du panneau expérimental d'anticorps pour assurer qu'un anticorps avec un épitope de haute abondance n'est pas affecté à un canal de masse qui contribue signal à un canal attribué à un anticorps à faible abondance, car cela pourrait créer une population artificiellement élevé dans le canal de réception de la contribution du signal.

La préparation d'échantillons pour l'analyse de cytométrie de masse exacte dépend fortement des types d'échantillons recueillis et mis à l'essai l'hypothèse expérimentale. Nous fournissons des exemples de deux protocoles de récolte différents types de cellules (cellules souches embryonnaires humaines) et les cellules primaires (isolat de cellules épithéliales de la tumeur du sein de la souris). Lorsque vous commencez une étude de cytométrie de masse, il est conseillé de procéder d'abord à une petite expérience pilote pour faire en sorte que tous les protocoles et les anticorps à être utilisés fonctionnent bien entre les mains de l'enquêteur. Ceci est particulièrement essentiel lorsque les anticorps conjugués sont personnalisés pour être utilisés, comme la réaction de réduction partielle au cours de la conjugaison d'anticorps a le potentiel de perturber l'affinité des anticorps; Par conséquent, chaque anticorps personnalisé doit être validée de manière empirique pour assurer l'exactitude des données. D'autres considérations comprennent la détermination si des anticorps de surface cellulaire à utiliser dans l'essai reconnaîtra leurs épitopes après fixation ou si elles nited à appliquer à des cellules vivantes. Certains fixation peut empêcher la coloration appropriée avec des anticorps de surface cellulaire comme cela est connu pour se produire avec coloration peptide-CMH 3, 4. Exécution d'une coloration d'anticorps de surface cellulaire sur des cellules vivantes peut être nécessaire pour certains anticorps, mais cela exclut la possibilité de barcoding avant le marquage de l' anticorps comme la plupart des méthodes de codes - barres sont effectuées après fixation 5 , bien que le code à barres à base d' anticorps 6, 7 est une exception.

Lors de la détermination du nombre de cellules devant être préparé pour l'analyse, il est important de savoir que seule une fraction des cellules chargées sur la machine sera détecté et produire des données. Cette perte est principalement due à l'inefficacité lorsque le nébulisateur pulvérise l'échantillon à la torche. La perte exacte pour cent dépend de la masse configuration de la machine cytométrie et le type cellulaire, mais peut varier 50-85% et devrait êtreconsidéré lors de la conception de l'expérience. Ce protocole a été optimisé pour 2x10 6 cellules par échantillon , mais peut être adapté pour le traitement des petites ou plus grandes tailles d'échantillon. Ce protocole peut être utilisé avec des modifications minimes pour la taille des échantillons de 1 x 10 6 4 x 10 6, mais il est essentiel que la taille de l' échantillon soit maintenu au sein d' une expérience cohérente. Les modifications du nombre de cellules peuvent affecter l'intensité de la coloration des anticorps et Code à barres et doivent être conservés à peu près cohérente à travers à être directement comparés échantillons.

Certaines procédures, telles que l'étiquetage des cellules mortes et l'étiquetage de l'ADN, doivent être effectuées dans la grande majorité, sinon tous les modèles expérimentaux. Le marquage des cellules mortes dans des expériences analysant uniquement les marqueurs de surface peut être réalisée à l'aide Rh103, mais Rh103 doit être évitée pour des expériences où perméabilisation est nécessaire, car il entraîne une perte de coloration. Pour les expériences impliquant perméabilisation, il est conseillé d'utiliser le cisplatine 8 et, lorsque cela est possible, un anticorps reconnaissant la PARP clivée ou clivé Caspase pour détecter des cellules apoptotiques et mortes.

Code - barres échantillons peuvent réduire la consommation d'anticorps, diminuer le temps d'acquisition et d' éliminer la variabilité échantillon à échantillon 9. Le procédé de codage à barres consiste à appliquer un code unique spécifique à l'échantillon à toutes les cellules, ce qui permet d'affecter chaque cellule à son échantillon d'origine. Après barcoding les échantillons peuvent être mis en commun avant la coloration d'anticorps, un processus qui assure que tous les échantillons sont colorés de manière égale. Pour minimiser l'erreur expérimentale, il est prudent de code à barres et des échantillons piscine qui doivent être directement comparés les uns aux autres. À l' heure actuelle , il existe plusieurs méthodes pour les échantillons barcoding pour l' analyse de cytométrie de masse 5, 6, 7, dont deux sont présentées ici (voir ci - dessous).

Avec Reagen actuellement disponiblets , il est possible de quantifier l'abondance de 38 cibles d'anticorps, identifier des cellules en phase S 10, distinguer les cellules vivantes et mortes 8 et de mesurer les niveaux cellulaires de 11 l' hypoxie dans une expérience multiplexé d'échantillons multiples. Cette capacité à recueillir des données sur une seule cellule de haute paramètres pour les grandes populations de cellules permet une amélioration du profil des populations de cellules très hétérogènes et a déjà produit un certain nombre de nouvelles connaissances biologiques 12, 13, 14, 15, 16. Les données complexes distillant résultant des informations interprétable a nécessité l'utilisation d'algorithmes de calcul , y compris Spanning Tree Progression de la densité des événements Normalisé (SPADE) 17 et 18 Visne.

Cet article présente un accèsaperçu de la façon de concevoir et de réaliser une masse cytométrie expérience et présente une analyse de base de données de cytométrie de masse.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Récolte de cellules

  1. Récolte des cellules provenant d'un tissu primaire
    NOTE: Le procédé décrit pour la récolte de cellules à partir du tissu primaire est spécifiquement applicable aux tissus de tumeur du sein de la souris et peut ne pas être applicable est de tissus primaires provenant d'autres sources.
    1. Préparer le tampon de digestion en dissolvant 5 mg de hyaluronidase et 30 mg de collagénase dans 10 ml de milieu DMEM / F12 par gramme de tissu à traiter. Filtre à stériliser le tampon de digestion.
    2. Isoler tumeur mammaire primaire à partir de la glande poids tumeur de souris et d'enregistrement.
    3. Hacher le tissu avec un scalpel n ° 10 pendant au moins 5 min.
    4. Ajouter tissu haché à un volume approprié de tampon de digestion (10 mL de tampon par gramme de tissu).
    5. Agiter tissu haché dans un tampon de digestion à 100 tpm pendant 1-3 h à 37 ° C.
    6. Obtenir une suspension de cellules isolées par des cellules passant à travers le filtre de 0,4 pm dans un tube de 50 ml.
    7. Centrifuger les cellules à 300 xg pendant 10 min à 4 ° C; C. Décanter ou aspirer soigneusement le surnageant sans perturber le culot.
    8. Resuspendre le culot dans 4 ml de DMEM / F12 et le transfert de 5 mL de tube à fond rond.
  2. Récolte des cellules de culture de tissus
    1. Laver la plaque ou le flacon de cellules adhérentes avec une solution saline tamponnée au phosphate de magnésium et de calcium libre (PBS) à température ambiante.
      NOTE: La technique décrite pour les cellules de récolte est spécifiquement applicable aux adhérentes les cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) cellules de culture. Cependant, le reste du protocole décrit est largement applicable à d'autres lignées cellulaires cultivées, les lignes non-adhérentes et des cellules primaires.
    2. Ajouter réchauffé (37 ° C) de la trypsine ou d'un autre réactif de digestion enzymatique optimisée pour obtenir une suspension de cellules isolées à partir des cellules adhérentes. Suivez le protocole du fabricant.
      REMARQUE: trypsine et d'autres réactifs de dissociation enzymatiques ont le potentiel d'affecter des marqueurs cellulaires.
    3. Incuber la plaque à 37° C pendant 2-5 min pour détacher les cellules. Pour les hautes cultures de confluence, tapotez doucement la plaque pour aider à détacher les cellules.
    4. Transfert des cellules entièrement détachées de la plaque dans un tube à fond rond de 5 mL et pipeter doucement à l'aide d'une pipette de 1 ml pour dissocier les cellules.
      REMARQUE: Pour traiter un grand nombre d'échantillons toutes les étapes peuvent également être effectuées dans une plaque à 96 puits à fond rond. Pour les échantillons de traitement dans un format à 96 puits tous les lavages peuvent être effectués à un volume de 250 pi. Les volumes décrits dans d'autres étapes peuvent être réglées de sorte que le volume total ne dépasse pas 300 pi.
    5. Stopper le réactif de digestion enzymatique avec un tampon de lavage à volume égal (0,5% de BSA et 0,02% d'azoture de sodium dans du PBS).
      NOTE: L'azoture de sodium est un produit chimique dangereux. doivent respecter les précautions de sécurité pour sa préparation et la manipulation.
    6. Centrifuger les cellules à 300 xg pendant 5 min à 37 ° C. Décanter ou aspirer soigneusement le surnageant sans perturber le culot.
    7. Resuspendreles cellules dans 1 ml de milieu sans sérum.
    8. Compter les cellules en transférant 10 ul de la suspension cellulaire dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL. Diluer aliquote à un rapport connu dans le bleu trypan et un hémocytomètre de transfert ou d'un système de comptage de cellules automatisé.
  3. L' étiquetage de la population en phase S
    REMARQUE: Si l'étiquetage de la phase S ne doit pas être effectué de procéder à la tige 1.4.
    1. Préparer 1 ml de 10 pM de 5-iodo-2'-désoxyuridine (IDU) en F12 de DMEM exempt de sérum ou d'un autre support approprié pour chaque 2 x 10 6 cellules à analyser.
    2. Ajouter 500 ul de 10 uM IdU dans un milieu exempt de sérum pour chaque 2 x 10 6 cellules.
      REMARQUE: Bien que l'étiquetage IdU peut être réalisée dans des milieux contenant du sérum, protéine libre réagira avec le cisplatine, ce qui empêche l'étiquetage approprié des cellules mortes. Si un milieu contenant du sérum est utilisé lors de l'étiquettage IdU une étape de lavage supplémentaire est un média sans sérum est nécessaire pour éliminer les protéines sériques avant le cisplatine vivants / morts staining.
    3. Resuspendre doucement granulés avec 1 ml Pipet.
    4. Incuber pendant 10 min à 37 ° C avec agitation légère.
  4. Étiquetage direct / Dead
    1. Pour chaque échantillon, préparer 500 pi de 50 pM de cisplatine dans du DMEM-F12 sans sérum ou du type cellulaire support approprié.
      REMARQUE: si l' étiquetage de la population en phase S par IdU ne doit pas être effectué, des échantillons de remettre en suspension à une concentration de 4 x 10 6 cellules / ml. Les cellules remise en suspension avant d'ajouter cisplatine permet un mélange plus rapide des solutions pour l'étiquetage uniforme vivants / morts.
    2. Ajouter 500 ul de 50 uM de cisplatine par 2 x 10 6 cellules pour des échantillons.
    3. Incuber à température ambiante (TA) pendant 1 min sur un agitateur orbital avec mélange constant.
    4. Stopper la cisplatine avec un volume égal de tampon de lavage.
    5. Centrifuger les cellules à 300 xg pendant 5 min à température ambiante. Décanter ou aspirer soigneusement le surnageant sans perturber le culot.
    6. Laver deux fois les échantillonsavec 500 ul de tampon de lavage pour éliminer l'excès de cisplatine.
    7. échantillons laver deux fois avec 500 ul de PBS pour éliminer les protéines en excès.
  5. fixation échantillon
    1. Extrait Remettre en suspension dans 500 ul de PBS.
    2. Ajouter un volume égal de 4% de PFA dans du PBS pour une concentration finale de 2%; pipette pour mélanger.
      NOTE: Préparer 4% PFA frais à partir de poudre, ajuster le pH à 6,9 et passer à travers un filtre de 0,44 um. 4% de PFA dans du PBS peut être stocké à 4 ° C pendant jusqu'à deux semaines. Évitez formaline premade fourni dans des ampoules, à moins testé spécifiquement, car il contient souvent des contaminants métalliques qui peuvent interférer avec les canaux de masse mesurés. Une concentration plus faible de PFA peut être suffisante et aider à minimiser l'effet de la fixation sur la liaison d'anticorps, mais doit être testé de façon empirique.
    3. Incuber pendant 15 min à température ambiante sur un agitateur orbital avec mélange constant.
    4. Centrifuger les cellules à 300 xg pendant 5 min à 4 ° C. Décanter ou aspirer soigneusement le surnageant wiThout perturber le culot.
    5. les échantillons de lavage avec du PBS pour éliminer la solution de PFA.
      NOTE: A ce échantillons étape peut être brièvement à 4 stockée ° C. un stockage prolongé à 4 ° C peut entraîner une dégradation de l'échantillon et une diminution de la coloration.

2. Barcoding

NOTE: Bien que la méthodologie pour l'utilisation monoisotopique cisplatine Code à barres et le palladium est présenté le codage à barres en même temps, que ce soit peut être utilisé indépendamment ou complètement évité si non requis par l'expérience.

  1. Monoisotopique Cisplatine Barcoding
    NOTE: Depuis le cisplatine et le cisplatine coloration codage à barres en direct / Dead comptent sur les soins des canaux qui se chevauchent doivent être prises pour faire en sorte que le cisplatine fond coloration en direct / Dead dans les cellules vivantes est réduit au minimum, car cela pourrait interférer avec la précision du code à barres de cisplatine.
    1. Diluer 1 mM de solutions mères monoisotopique de cisplatine de 200 uM dans du PBS.
    2. pour each code à barres unique de cisplatine préparer un tube de 1,5 ml avec 500 ul de PBS pour chaque 2 x 10 6 cellules recevant ce code à barres.
    3. Pour préparer chaque code à barres unique ajouter chaque cisplatine monoisotopique applicable à une concentration finale de 200 nM.
    4. Resuspendre les cellules dans 500 ul de PBS par 2 x 10 6 cellules.
    5. Ajouter un volume égal de la solution de code-barres correspondant à chaque échantillon.
    6. Incuber les échantillons à température ambiante pendant 5 min sur un agitateur orbital avec mélange constant.
    7. Stopper cisplatine avec un volume égal de tampon de lavage.
    8. Centrifuger les cellules à 300 xg pendant 5 min à 4 ° C. Décanter ou aspirer soigneusement le surnageant sans perturber le culot.
    9. échantillons laver deux fois avec 500 ul de tampon de lavage pour éliminer l'excès de cisplatine.
  2. palladium Barcoding
    NOTE: Palladium réactifs peuvent être soit barcoding préparé 5 ou achetés dans le commerce.
    1. Transient partielleperméabilisation 19
      REMARQUE: Palladium chélation nécessite perméabilisation partielle codage à barres pour les réactifs de passer à travers la membrane cellulaire et la cellule étiquette avec vigueur.
      1. Laver les échantillons avec 500 ul de PBS.
      2. Laver les échantillons avec 500 ul de PBS plus 0,02% de saponine.
      3. granulés de volume résiduel en Resuspendre.
    2. Appliquer le codage à barres de palladium.
      1. Diluer actions 100x de réactif de codes à barres de palladium dans du PBS 1 ml glacé plus 0,02% de saponine.
      2. ajouter rapidement réactif à l'échantillon dilué le codage à barres remis en suspension.
      3. Incuber pendant 15 min à température ambiante sur un agitateur orbital à sous agitation constante.
      4. les échantillons de lavage deux fois avec 500 ul de tampon de lavage.

3. Cellule coloration de surface

REMARQUE: coloration de la surface cellulaire peut être effectuée sur des cellules vivantes avant la fixation. Cela peut être nécessaire pour les anticorps qui perdent affinité pour Theiépitope r après fixation. Des échantillons de cellules peuvent bénéficier de blocage supplémentaire, tel que le blocage de Fc pour les leucocytes, avant le marquage d'anticorps pour réduire le fond. blocage optimale doit être déterminée de manière empirique pour le type d'échantillon spécifique.

  1. Préparer panneau de coloration d'anticorps de surface de cellule.
    1. Combiner 0,5 uL, ou une quantité déterminée de manière empirique, de chaque anticorps de surface de cellule de 0,5 mg / mL par échantillon dans un tube de 1,5 ml. Ajouter tampon de lavage si nécessaire pour amener le volume jusqu'à 10 pi par échantillon. Mélanger par pipetage.
      REMARQUE: Déterminer la dilution de travail pour chaque anticorps avant d'expérimenter de façon empirique par l'expérience de titrage.
    2. pool d'anticorps de surface cellulaire divisé en parts égales dans un tube de 1,5 ml pour chaque échantillon à colorer.
    3. Préparer 500 ul de tampon de lavage dans un tube de 1,5 ml pour chaque échantillon.
  2. Appliquer une coloration de surface cellulaire à des échantillons de volume normalisé pour tous les échantillons.
    REMARQUE: Pour ensure marquage d'anticorps constante sur plusieurs échantillons, il est essentiel de contrôler soigneusement le volume de l'échantillon et la concentration d'anticorps. Les étapes suivantes visent à parvenir à cette cohérence en veillant à ce que les volumes de l'échantillon final après l'anticorps a été ajouté sont uniformes.
    1. Centrifuger les cellules à 300 xg pendant 5 min à 4 ° C. Décanter ou aspirer soigneusement le surnageant sans perturber le culot.
    2. Avec une solution ensemble de pipette de 200 pi à 50 pi, retirer restant de pastille de l'échantillon et transférer dans un tube du pool d'anticorps de surface cellulaire aliquoté.
    3. Pipeter jusqu'à la totalité du liquide dans le tube d'air aliquote sans dessin dans l'embout de pipette.
    4. Tout en maintenant le piston de la pipette pour éviter d'attirer l'air déplace l'embout dans un tube disposé de 500 ul tampon de lavage et de libérer le piston.
    5. Rajouter le contenu de la pointe de la pipette à l'échantillon et l'échantillon dans la remise en suspension liquide avec pipetage doux.
    6. Incuber les échantillons à 1h à la température ambiante sur un agitateur orbital avec mélange constant.
    7. échantillons laver deux fois avec 500 ul de tampon de lavage afin d'assurer que tous les anticorps libre est éliminé par lavage.
    8. Laver les échantillons avec 500 ul de PBS.
    9. Remettre en suspension le culot cellulaire dans 500 pi de PBS.
    10. Ajouter un volume égal de 4% de PFA dans du PBS; pipette pour mélanger.
    11. Incuber pendant 10 min sur un agitateur orbital.

4. Cellule perméabilisation et Intracellulaire Staining

  1. cellule perméabilisation
    1. Centrifuger les cellules à 300 xg pendant 5 min à 4 ° C. Décanter ou aspirer soigneusement le surnageant sans perturber le culot.
    2. Remettre en suspension les cellules dans le volume résiduel par vortex doucement jusqu'à ce que le culot est dissocié.
      NOTE: Le fait de dissocier les cellules avant d'ajouter du MeOH se traduira par des cellules qui adhèrent ensemble et la production d'un film mince qui se traduira par une perte partielle de l'échantillon.
    3. Immédiatement ajouter 1 mL de MeOH à 100% par 2 x 10 6 </ Sup> cellules et pipette doucement pour mélanger.
      NOTE: D'autres méthodes de perméabilisation peut être remplacé par MeOH et peut être nécessaire pour atteindre perméabilisation optimale pour certains types de cellules. Pour certaines sources cellulaires a 0,1% de Triton X-100, 0,2% de Tween-20 ou 0,1% de saponine dans une solution PBS pendant perméabilisation peut maintenir l'intégrité des cellules tout en offrant une meilleure perméabilisation cohérente.
    4. Incuber les échantillons pendant au moins 1 h ou jusqu'à un maximum de 24 h à 4 ° C pendant perméabilisation.
      NOTE: A ce échantillons étape dans MeOH peuvent être stockées pendant 1 mois à -80 ° C.
    5. Centrifuger les cellules à 300 xg pendant 5 min à 4 ° C. Décanter ou aspirer soigneusement le surnageant sans perturber le culot.
    6. Ajouter 1 mL de tampon de lavage pour chaque ml de MeOH utilisé pour perméabiliser l'échantillon. Doucement remettre en suspension culot cellulaire.
    7. Laver l'échantillon deux fois avec 500 ul de tampon de lavage.
  2. Préparer panneau de coloration d'anticorps intracellulaire.
    1. Combiner 0,5 uL, ou une quantité déterminée de manière empirique, de chaque anticorps intracellulaire 0,5 mg / mL par échantillon dans un tube de 1,5 ml. Ajouter tampon de lavage si nécessaire pour amener le volume jusqu'à 10 pi par échantillon. Mélanger par pipetage.
    2. Diviser pool d'anticorps intracellulaire également dans un tube de 1,5 ml pour chaque échantillon.
    3. Préparer 500 uL de tampon de lavage dans un tube de 1,5 ml pour chaque échantillon.
  3. Appliquer coloration intracellulaire des échantillons dans le volume normalisé pour tous les échantillons.
    REMARQUE: Pour assurer l'étiquetage des anticorps cohérent sur plusieurs échantillons, il est essentiel de bien contrôler le volume de l'échantillon et la concentration d'anticorps.
    1. Centrifuger les cellules à 300 xg pendant 5 min à 4 ° C. Décanter ou aspirer soigneusement le surnageant sans perturber le culot.
    2. Avec une pipette de 200 ul à 50 ul fixé enlever restante solution de culot de l'échantillon et transférer dans un tube du pool d'anticorps de surface cellulaire aliquoté.
    3. Pipettejusqu'à la totalité du liquide dans le tube d'air aliquote sans dessin dans l'embout de pipette.
    4. Tout en maintenant le piston de la pipette pour éviter d'attirer l'air déplace l'embout dans un tube disposé de 500 ul tampon de lavage et de libérer le piston, l'élaboration d'un tampon de lavage pour un volume total d'échantillon de 50 ul.
    5. Rajouter le contenu de la pointe de la pipette à l'échantillon et l'échantillon dans la remise en suspension liquide avec pipetage doux.
    6. Incuber les échantillons pendant 1 heure à température ambiante sur un agitateur orbital avec mélange constant.
    7. les échantillons de lavage deux fois avec 500 ul de tampon de lavage.
    8. Laver les échantillons avec 500 ul de PBS.

5. L'étiquetage Iridium

  1. Fix échantillons
    1. Des échantillons de remettre en suspension dans 500 ul de PBS.
    2. Ajouter 500 pi de 4% PFA dans du PBS.
    3. Incuber pendant un minimum de 15 min à température ambiante sur un agitateur orbital avec mélange constant.
  2. Appliquer l' étiquetage Iridium de l' ADN
    1. 125 uM Diluer le réactif 500x intercalant d'iridium dans 4% de PFA dans du PBS à une concentration de 62,5 nM.
    2. Ajouter une solution 500 ul 62,5 nM iridium PFA aux échantillons.
      NOTE: Pour les expériences utilisant des cellules perméabilisées, diluer le 500x Ir191 / 193 stock pour une dilution finale de 1: 2000 pour éviter overstaining.
    3. Incuber pendant 15 min à température ambiante sur un agitateur orbital avec mélange constant.
      REMARQUE: Si vous effectuez monoisotopique cisplatine ne pas incuber le codage à barres des échantillons avec iridium pendant plus de 15 minutes puisque les signaux Ir193 forts peuvent contribuer à la chaîne de masse Pt194 et un impact négatif sur la qualité de codage de barre.
    4. Centrifuger les cellules à 300 xg pendant 5 min à 4 ° C. Décanter ou aspirer soigneusement le surnageant sans perturber le culot.
    5. échantillons laver deux fois avec 500 ul de 0,1% de BSA dans de l'eau déminéralisée filtrée.
      REMARQUE: Une fois préparés, nous vous recommandons d'exécuter des échantillons dans les 24 h si possible. Les échantillons préparés peuvent être stockés à court terme à 4 ° C,mais il faut prendre soin d'éviter la dégradation. Si possible, les lavages finaux doivent être effectués dans de l'eau déminéralisée filtrée sans BSA, car cela diminue le dépôt sur les cônes de la chambre de pulvérisation et échantillonneur de la machine qui diminuera le nettoyage des instruments. Pour CSEh il est nécessaire d'effectuer ces lavages tout en incluant BSA pour éviter la perte d'échantillon de coller à la surface du tube.

6. Préparer des échantillons pour l'acquisition

  1. Nombre de cellules
    1. Resuspendre les cellules dans 500 ul de 0,1% de BSA dans de l'eau désionisée filtrée et le filtre dans un nouveau tube à travers un bouchon de tamis cellulaire de 35 um.
      REMARQUE: L'abaissement du niveau de BSA pour les lavages finaux diminue le résidu laissé sur le nébulisateur cytométrie de masse. Les cellules non adhérentes peuvent être lavées et remises en suspension dans de l'eau déminéralisée filtrée.
    2. Compter les cellules en transférant 10 ul de la suspension cellulaire dans un tube de microcentrifugation. Diluer aliquote à un rapport connu dansbleu trypan (pour faciliter la visualisation de la cellule) et transférer dans un hémocytomètre ou d'un système de comptage de cellules automatisé.
    3. Centrifuger les cellules à 300 xg pendant 5 min à 4 ° C. Décanter ou aspirer soigneusement le surnageant sans perturber le culot.
  2. Préparer et des échantillons de charge
    1. Pour préparer des perles d'étalonnage retirer du réfrigérateur et agiter vigoureusement pour remettre en suspension.
    2. Si des échantillons en cours d'exécution à l'aide d'une masse cytométrie échantillonneur automatique, ajouter 50 ul de billes d'étalonnage pour chaque puits de la plaque d'échantillon, puis ajouter le nombre souhaité de cellules à analyser. Si des échantillons en cours d'exécution par injection manuelle ajouter 50 ul de billes d'étalonnage à l'échantillon, l'échantillon dilué dans de l'eau déminéralisée filtrée, mélanger l'échantillon bien et la charge dans le port d'injection d'échantillon de cytométrie de masse. La dilution appropriée de l' échantillon peut varier en fonction du type de cellules en cours d' analyse, mais une dilution de 10 6 1 est généralement approprié.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le protocole présenté ici peut être largement appliquée à une grande variété d'échantillons de cellules en culture et primaire avec seulement quelques modifications mineures. En fonction des besoins de l'expérience, elle peut être réalisée de manière modulaire lorsque certains éléments, tels que la coloration surface cellulaire ou le codage à barres, ne sont pas nécessaires. Utilisé dans son intégralité ce protocole permet la préparation de la masse multiplexé cytométrie échantillons mar...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le protocole présenté ici a été utilisé avec succès pour le traitement de diverses lignées cellulaires en culture (H1 et H9 CSEh, mESCs, MCF7, HEK 293, KBM5, HMEC, MCF10A) et des échantillons de tissus primaires (moelle osseuse de la souris, la souris foie embryonnaire, adultes de souris foie, une tumeur de la souris). Quelle que soit la source, tout tissu qui peut être dissociées en cellules individuelles tout en préservant l'état cellulaire devrait être prête à l'analyse par cytométrie de masse, mais peut néce...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le travail dans le laboratoire Barton a été soutenu par une subvention de l’Institut de prévention et de recherche sur le cancer du Texas (CPRIT RP110471). Cette recherche a été financée en partie par une bourse de formation pour Ryan L. McCarthy du National Institutes of Health Training Program in Molecular Genetics 5 T32 CA009299. La plateforme qui entretient et exploite l’appareil de cytométrie de masse est financée par une subvention du CPRIT (RP121010) et une subvention de base du NIH (CA016672).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
mTeSR1 medium kitStem Cell technologies05850Chaud à température ambiante avant utilisation
DMEM F-12ThermoFisher11330-032Tiède à 37  ; ° ; C avant utilisation
AccutaseStem Cell technologies07920Chaud à 37  ; ° ; C avant utilisation
Albumine sérique bovineEquitechBAH62
solution saline tamponnée au phosphateHycloneSH30256.01
SaponineSigma-Aldrich47036
Cell ID Pt194FluidigmFourni à 1  ; mM
cell ID pt195fluidigmfourni à 1  ; mM
cell ID pt196Fluidigmfourni à 1  ; mM
CisplatineEnzo Life SciencesALX-400-040-M250Soluble à 25  ; mg/mL dans DMSO
Cell-ID 20-plex Barcoding KitFluidigm201060
5-Iodo-2'-deoxyuridineSigma-AldrichI7125Soluble à 74  ; mg/mL dans 0,2 po N NaOH
Rhodium 103 agent intercédantFluidigm201103A
MéthanolFisherBP1105-4Refroidissement à -20  ; ° ; C avant utilisation
Azoture de sodiumSigma-AldrichS2002
5 mL tubes à fond rondFalcon352058
5 mL 35 μ ; Tubes de bouchon de filtre mFalcon352235
EQ quatre éléments billes d’étalonnageFluidigm201078
Hyaluronidase Type I-SSigma-AldrichH3506
Collagénase de Clostridium histolyticumSigma-AldrichC9891
Scalpel jetable #10Sigma-AldrichZ69239

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Leipold, M. D., Maecker, H. T. Mass cytometry: protocol for daily tuning and running cell samples on a CyTOF mass cytometer. J Vis Exp. , e4398(2012).
  2. Leipold, M. D. Another step on the path to mass cytometry standardization. Cytometry A. 87, 380-382 (2015).
  3. Newell, E. W., et al. Combinatorial tetramer staining and mass cytometry analysis facilitate T-cell epitope mapping and characterization. Nat Biotechnol. 31, 623-629 (2013).
  4. Leong, M. L., Newell, E. W. Multiplexed Peptide-MHC Tetramer Staining with Mass Cytometry. Methods Mol Biol. 1346, 115-131 (2015).
  5. Zunder, E. R., et al. Palladium-based mass tag cell barcoding with a doublet-filtering scheme and single-cell deconvolution algorithm. Nat Protoc. 10, 316-333 (2015).
  6. Lai, L., Ong, R., Li, J., Albani, S. A CD45-based barcoding approach to multiplex mass-cytometry (CyTOF). Cytometry A. 87, 369-374 (2015).
  7. Mei, H. E., Leipold, M. D., Schulz, A. R., Chester, C., Maecker, H. T. Barcoding of live human peripheral blood mononuclear cells for multiplexed mass cytometry. J Immunol. 194, 2022-2031 (2015).
  8. Fienberg, H. G., Simonds, E. F., Fantl, W. J., Nolan, G. P., Bodenmiller, B. A platinum-based covalent viability reagent for single-cell mass cytometry. Cytometry A. 81, 467-475 (2012).
  9. Krutzik, P. O., Nolan, G. P. Fluorescent cell barcoding in flow cytometry allows high-throughput drug screening and signaling profiling. Nat Methods. 3, 361-368 (2006).
  10. Behbehani, G. K., Bendall, S. C., Clutter, M. R., Fantl, W. J., Nolan, G. P. Single-cell mass cytometry adapted to measurements of the cell cycle. Cytometry A. 81, 552-566 (2012).
  11. Edgar, L. J., et al. Identification of hypoxic cells using an organotellurium tag compatible with mass cytometry. Angew Chem Int Ed Engl. 53, 11473-11477 (2014).
  12. Bendall, S. C., et al. Single-cell mass cytometry of differential immune and drug responses across a human hematopoietic continuum. Science. 332, 687-696 (2011).
  13. Horowitz, A., et al. Genetic and environmental determinants of human NK cell diversity revealed by mass cytometry. Sci Transl Med. 5, 208ra145(2013).
  14. Zunder, E. R., Lujan, E., Goltsev, Y., Wernig, M., Nolan, G. P. A continuous molecular roadmap to iPSC reprogramming through progression analysis of single-cell mass cytometry. Cell Stem Cell. 16, 323-337 (2015).
  15. Han, L., et al. Single-cell mass cytometry reveals intracellular survival/proliferative signaling in FLT3-ITD-mutated AML stem/progenitor cells. Cytometry A. 87, 346-356 (2015).
  16. Bendall, S. C., et al. Single-cell trajectory detection uncovers progression and regulatory coordination in human B cell development. Cell. 157, 714-725 (2014).
  17. Qiu, P., et al. Extracting a cellular hierarchy from high-dimensional cytometry data with SPADE. Nat Biotechnol. 29, 886-891 (2011).
  18. Amir el, A. D., et al. viSNE enables visualization of high dimensional single-cell data and reveals phenotypic heterogeneity of leukemia. Nat Biotechnol. 31, 545-552 (2013).
  19. Behbehani, G. K., et al. Transient partial permeabilization with saponin enables cellular barcoding prior to surface marker staining. Cytometry A. 85, 1011-1019 (2014).
  20. Finck, R., et al. Normalization of mass cytometry data with bead standards. Cytometry A. 83, 483-494 (2013).
  21. Chester, C., Maecker, H. T. Algorithmic Tools for Mining High-Dimensional Cytometry Data. J Immunol. 195, 773-779 (2015).
  22. Diggins, K. E., Ferrell, P. B., Irish, J. M. Methods for discovery and characterization of cell subsets in high dimensional mass cytometry data. Methods. 82, 55-63 (2015).
  23. Leelatian, N., Diggins, K. E., Irish, J. M. Characterizing Phenotypes and Signaling Networks of Single Human Cells by Mass Cytometry. Methods Mol Biol. 1346, 99-113 (2015).
  24. van der Maaten, L. J. P., Hinton, G. E. Visualizaing Data using t-SNE. J. Mach. Learn. Res. 9, 2431-2456 (2008).
  25. Kling, J. Cytometry: Measure for measure. Nature. 518, 439-443 (2015).
  26. Gregori, G., et al. Hyperspectral cytometry. Curr Top Microbiol Immunol. 377, 191-210 (2014).
  27. Chattopadhyay, P. K., et al. Brilliant violet fluorophores: a new class of ultrabright fluorescent compounds for immunofluorescence experiments. Cytometry A. 81, 456-466 (2012).
  28. Rieger, A. M., Havixbeck, J. J., Barreda, D. R. X-FISH: Analysis of cellular RNA expression patterns using flow cytometry. J Immunol Methods. 423, 111-119 (2015).
  29. Frei, A. P., et al. Highly multiplexed simultaneous detection of RNAs and proteins in single cells. Nat Methods. 13, 269-275 (2016).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Mass CytometrySample PreparationCell StainingCisplatin LabelingAntibody CocktailIridium LabelingSPADE AlgorithmFlow CytometrySingle Cell AnalysisCell Permeabilization

Related Articles