Procédé pour l'identification d'inhibiteurs de petites molécules de l'interaction protéine-protéine entre HCN1 et TRIP8b

Résumé

L'interaction entre les canaux HCN et leur sous-unité auxiliaire a été identifié comme une cible thérapeutique dans le trouble dépressif majeur. Ici, une méthode basée sur la polarisation de fluorescence pour identifier les petites molécules inhibitrices de cette interaction protéine-protéine, est présentée.

Résumé

(HCN) canaux de nucleotide cyclique activé par hyperpolarisation sont exprimés de façon ubiquitaire dans le cerveau, où ils fonctionnent pour réguler l'excitabilité des neurones. La distribution subcellulaire de ces canaux dans les neurones pyramidaux de la zone hippocampique CA1 est régulée par tétratricopeptide Rab8b contenant des protéines de répétition interagissant (TRIP8b), une sous-unité auxiliaire. KO génétique de HCN formation de pores sous-unités ou TRIP8b, à la fois conduire à une augmentation des comportements antidépresseur, ce qui suggère que la limitation de la fonction des canaux HCN peut être utile en tant que traitement du trouble dépressif majeur (TDM). Malgré l'intérêt thérapeutique significatif, les canaux HCN sont également exprimés dans le cœur, où ils régulent la rythmicité. Pour contourner les problèmes hors-cible associés aux bloquant les canaux HCN cardiaques, notre laboratoire a récemment proposé le ciblage de l'interaction protéine-protéine entre HCN et TRIP8b afin de perturber spécifiquement la fonction du canal HCN dans le cerveau.TRIP8b se lie à HCN pore formant des sous-unités à deux sites d'interaction distincts, bien qu'ici l'accent est mis sur l'interaction entre la répétition de tétratricopeptide (TPR) domaines de TRIP8b et la C queue terminale de HCN1. Dans ce protocole, une description plus détaillée d'un procédé de purification TRIP8b et l'exécution d'un écran à haut débit pour identifier les petites molécules inhibitrices de l'interaction entre HCN et TRIP8b, est décrit. Le procédé de criblage à haut débit utilise une polarisation de fluorescence (FP) à base de test pour surveiller la liaison d'un grand fragment de TRIP8b à un onze fluorophores marqués aminés peptide acide correspondant à la queue terminale HCN1 C. Cette méthode permet de composés «hit» d'être identifiés sur la base de la variation de la polarisation de la lumière émise. tests de validation sont ensuite effectués pour veiller à ce que «hit» composés ne sont pas artifactual.

Introduction

(HCN) canaux de nucleotide cyclique hyperpolarisation activé sont exprimés dans le cœur et le système nerveux central où ils jouent un rôle important dans la régulation de l' excitabilité membrane ^1. Canaux HCN ont été impliqués dans la pathogenèse du trouble dépressif majeur (MDD) ^2, ce qui a conduit plusieurs groupes de proposer que la limitation de HCN fonction du canal pharmacologiquement peut être efficace comme un nouveau traitement pour CDEM ^3. Cependant, ciblant directement les canaux HCN est pas viable en raison de leur rôle important dans le potentiel d'action cardiaque ^4. Ivabradine, le seul approuvé par ....

Protocole

1. La purification du TRIP8b (241-602) Protéines

1. Transformer le plasmide contenant TRIP8b (241-602) dans la bactérienne expression de la protéine vecteur pGS21 ³ dans E. compétente coli pour l' expression de la protéine selon les instructions du fabricant. Plaque 300 ul de la culture sur bouillon de Luria (LB) -agar avec 5 ug / ml de chloramphenicol et à l'ampicilline. Incuber la plaque à 37 ° C pendant 16 heures.
2. Le lendemain, choisir une seule colonie à inoculer 50 ml LB avec 50 pg / ml de chloramphénicol et ampicilline. Incuber la culture à 37 ° C pendant 16 heures (avec agitation).
3. Ajouter 50 ml ....

Résultats

Pour éviter les problèmes de droits d'auteur avec notre précédente publication, une sonde TAMRA-étiqueté HCN1 _TAMRA a été utilisé pour générer des figures 2 et 3. Notez que cette substitution n'a pas fait une différence appréciable dans les résultats, et les protocoles sont identiques à celles décrites ci - dessus avec HCN1 _FITC. Pour évaluer l'interaction avec HCN1 _TAMRA, TRIP8b (241-602) a été titré en une c.......

Discussion

En raison de son potentiel en tant que cible thérapeutique dans ²⁴ CDEM, il y a eu un intérêt considérable dans les approches pharmacologiques qui contrarient la fonction du canal HCN dans le système nerveux central ^4. Cependant, ces efforts ont été bloquées par le rôle important des canaux HCN dans pacemaker cardiaque et le risque d'arythmie ^25. Nous avons pensé que perturber l'interaction entre HCN et sa sous - unité auxiliaire spécifique du cerveau, TRIP8b ^8, pourra.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Agarose Ni-NTA  ;	Qiagen	30210
Cassette de dialyse  ;	ThermoFisher	66456
Isopropyle b-D-1-thiogalactopyranoside  ;	Sigma-Aldrich	I5502 - 1 gr
384-Well Plaque noire  ;	Corning	3820
Proxiplate  ;	Perkin-Elmer  ;
Perles d’accepteur anti-GST  ;	Perkin-Elmer  ;	6760603C
NiChelate	Perkin-Elmer  ;	AS101D
pGS21-a	Genscript	SD0121
PMSF	Sigma-Aldrich	10837091001
Coomassie Kit	ThermoFisher	23200
Concentrateur de protéines	ThermoFisher	88527
Perkin Elmer Enspire Lecteur de plaques	multimode Perkin-Elmer  ;	#2300-001M
BL21 (DE3) Cellules Compétentes	Agilent	200131

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