Article de méthode

La production de cellules souches pluripotentes de souris amniotique Cellules Fluid Utilisation d'un système de transposon

6.6K vues

⸱

DOI :

10.3791/54598

⸱

28 février 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Stem Cell and Regenerative Medicine Laboratory, Fondazione Istituto di Ricerca Pediatrica Citta della Speranza, 2Lunenfeld-Tanenbaum Research Institute, Mount Sinai Hospital, 3Stem Cells and Regenerative Medicine Section, Developmental Biology and Cancer Programme, UCL Institute of Child Health and Great Ormond Street Hospital

Dans cet article

Résumé

Dans cette étude, nous générons des cellules souches pluripotentes induites à partir de cellules de liquide amniotique de souris, en utilisant un système de transposon non viral.

Résumé

Les cellules souches pluripotentes induites (iPS) sont générées à partir de cellules somatiques de souris et d’humains par expression forcée de facteurs de transcription définis à l’aide de différentes méthodes. Ici, nous avons produit des cellules iPS à partir de cellules de liquide amniotique de souris, en utilisant un système de transposon non viral. Toutes les lignées cellulaires iPS obtenues présentaient des caractéristiques des cellules pluripotentes, y compris la capacité de se différencier vers des dérivés des trois couches germinales in vitro et in vivo. Cette stratégie ouvre la possibilité d’utiliser des cellules de fœtus malades pour développer de nouvelles thérapies contre les malformations congénitales.

Introduction

Le diagnostic prénatal est un outil clinique important d'évaluer les maladies génétiques (ie des aberrations chromosomiques, des maladies monogéniques ou polygéniques / multifactorielle) et des malformations congénitales (hernie diaphragmatique congénitale ie, lésions pulmonaires kystiques, omphalocèle, gastroschisis). Cellules de liquide amniotique (AF) sont simples à obtenir des procédures régulièrement programmées au cours du deuxième trimestre de la grossesse (c. -à- amniocentèse et amnioreduction) ou césariennes 1, 2. La disponibilité des cellules AF de patients prénatales ou néonatales offre la possibilité d'utiliser cette source pour la médecine régénérative, et plusieurs chercheurs ont étudié la possibilité de traiter les dommages ou les maladies des tissus différents en utilisant une population de cellules souches isolées à partir AF 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12. La possibilité d'obtenir facilement les cellules AF chez des patients malades, dans une fenêtre de temps dans lequel la maladie est souvent fixe, ouvre la voie à l'idée d'utiliser cette source de cellules à des fins de reprogrammation. En effet, souches pluripotentes induites (iPS) des cellules dérivées de cellules AF pourraient être différenciés dans les cellules d'intérêt pour les tests in vitro de médicaments ou pour les approches d'ingénierie tissulaire, afin de préparer une thérapie adéquate spécifique au patient avant l' accouchement. De nombreuses études ont déjà démontré la capacité des cellules AF à être reprogrammé et différenciées dans un large éventail de types de cellules 13, 14, 15, 16, 17 </ sup>, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27.

Depuis la découverte par Takahashi et Yamanaka 28 des cellules somatiques reprogrammées par l'expression forcée de quatre facteurs de transcription (Oct4, Sox2, cmyc et Klf4), des progrès ont été accomplis dans le domaine de la reprogrammation. Compte tenu des différentes méthodes, on peut distinguer entre les approches virales et non virales. Le premier attend l'utilisation de vecteurs viraux (rétrovirus et lentivirus), qui ont un rendement élevé, mais silencieux généralement incomplète du transgène rétroviral, à la fois la conséquence d'une lignée de cellules partiellement reprogrammée et le risque deinsertionnelle mutagenèse 29, 30, 31. La méthode non virale utilise des stratégies différentes: à savoir les plasmides, les vecteurs, les ARNm, les protéines, les transposons. La dérivation de cellules iPS libres de séquences transgéniques vise à contourner les effets potentiellement nocifs de l'expression du transgène qui fuit et la mutagenèse insertionnelle. Parmi toutes les stratégies non viraux mentionnés ci - dessus, le PiggyBac (PB) du système de transposon / transposase ne nécessite que les répétitions terminales inversées qui flanquent un transgène et de l' expression transitoire de l'enzyme transposase pour catalyser l' insertion ou l' excision d' événements de 32. L'avantage d'utiliser transposons sur les autres méthodes pour iPS génération de cellules est la possibilité d'obtenir des cellules sans vecteur-iPS avec une approche de vecteur non viral qui montre la même efficacité des vecteurs rétroviraux. Ceci est possible en trace-moins excision du codage de transposon intégré pour la reprogrammation facteurs suite à une nouvelle expression transitoire de la transposase dans les cellules iPS 33. Étant donné que le PB est efficace dans différents types de cellules 34, 35, 36, 37, est plus approprié pour une approche clinique en ce qui concerne les vecteurs viraux, et permet la production de cellules iPS libre xéno-contrairement aux protocoles de production viraux actuels qui utilisent des xénobiotiques conditions, ce système est utilisé pour obtenir des cellules iPS à partir AF murin.

Ici , nous proposons un protocole détaillé qui suit les travaux déjà publiés pour montrer la production de iPS pluripotentes clones à partir de cellules de souris AF (cellules iPS-AF) 38.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Protocole

Toutes les procédures étaient conformes à la loi italienne. échantillons murin AF ont été récoltées à partir de souris enceintes à 13,5 jours après le coït (dpc) à partir de C57BL / 6-Tg souris (UBC-GFP) 30Scha / J appelé GFP.

1. transposon production

REMARQUE: transposon des vecteurs d'expression ont été générés en utilisant des procédures de clonage standard. L'ADN plasmidique pour la transfection des cellules de souris AF a été préparé à l'aide de kits commerciaux.

  1. Mélanger 10 ng d'ADN plasmidique avec 50 ul de bactéries DH5a dans un tube de 1,5 ml. Laisser incuber le microtube sur la glace pendant 20 min.
  2. Le choc thermique à 42 ° C pendant 40 secondes.
  3. Placez microtube sur la glace pendant 2 min.
  4. Ajouter 250 pi de (37 ° C) de bouillon de lysogénie (LB) de bouillon préchauffé. Agiter (300 tours par minute) à 37 ° C pendant 30 min.
  5. Étaler 30 pi de chaque transformation sur des plaques LB avec 0,1 mg / ml d'ampicilline. Laisser les plaques sécher et incuber inversées à 37 ° C overnight.
  6. Le lendemain, dans l'après-midi, ramasser 3 colonies, en utilisant stériles 200 conseils ul, de chaque transformation et transfert sur 0,1 mg / ml LB amp.
  7. Agiter (300 rpm) bactéries pendant une nuit à 37 ° C.
  8. Pour la purification plasmidique utiliser des kits commerciaux. plasmides de stock à -20 ° C.

2. Souris Embryonic Fibroblast (MEF) Culture

  1. Revêtement des 6 puits Plaques avec 0,1% Gélatine
    1. Plaques de manteau sous le capot en ajoutant 1 ml de gélatine à 0,1% stérile à chacun des six puits. Laissez la gélatine polymériser sur l'incubateur (37 ° C) pendant 1 h.
    2. Jeter l'excès, et sécher les plaques pendant 1 h.
    3. Utilisez parafilm pour sceller et plaques de magasin à la température ambiante.
  2. Inactivation du MEF avec mitomycine C
    1. Décongelez un flacon de 4 x 10 6 cellules MEF utilisant un bain à 37 °.
    2. Graine MEF dans la hotte sur une boîte de Pétri (150 mm) avec un milieu MEF.
    3. Cultiver les cellules à 37 ° C et 5% de CO 2.
    4. (ATTENTION) Ajouter mitomycine C (5 mg / ml) lorsque les cellules sont confluentes.
    5. Placer les cellules dans un incubateur (37 ° C et 5% de CO2) pendant 3 h.
    6. Éliminer le milieu avec les cellules de la mitomycine C. Laver trois fois avec une solution saline de tampon phosphate 1X (PBS).
    7. Ajouter 2 ml de cellules de trypsine et de placer dans le commerce 37 ° C incubateur pendant 5 min. Après, ajouter 18 ml de blocage moyen pour arrêter la réaction de la trypsine.
    8. Compter les cellules à l'aide d'une chambre de Burker selon le protocole du fabricant.
    9. Centrifuger les cellules à 145 g pendant 5 min. Jeter le surnageant.
    10. Seed 60.000 cellules / cm 2 de inactivé MEF sur 0,1% gélatine plaques revêtues.
    11. Cultiver des cellules pendant 24 h à 37 ° C et 5% de CO 2, avant le semis AF et / ou cellules iPS-AF.

3. Souris AF cellule d'isolement

  1. Mettre en place des accouplements chronométrés et vérifier plu vaginalegs après 24 h de co-logement.
  2. Observer jusqu'à 13,5 dpc et sacrifier barrage enceinte par dislocation cervicale.
  3. Nettoyer la paroi abdominale de l'animal en utilisant 70% d'éthanol.
  4. En utilisant des ciseaux, réaliser une laparotomie médiane inciser la longueur de la paroi abdominale pour accéder à la cavité abdominale.
  5. Exposer l'utérus en utilisant une pince. Retirer l'utérus à l'aide de ciseaux et de transfert dans un plat de 100 mm de Pétri remplie de stérile 1x PBS placé sur la glace.
  6. Utilisez un stéréomicroscope pour recueillir l'AF au grossissement 10X.
  7. Tenir l'utérus avec une pince et enlever la paroi utérine avec des ciseaux. Faites attention à ne pas endommager les membranes fœtales et une fuite de liquide amniotique conséquente.
  8. Collecter les fœtus dans un plat de 100 mm de Pétri remplie de stériles 1x PBS et placer sur la glace.
  9. Saisir le placenta d'un foetus avec une pince fine de point et les placer dans un endroit propre 100 mm boîte de Pétri.
  10. Retirer le jaune sac en utilisant pince fine de point.
  11. Perturber l'amnios en utilisant pince fine de point et de recueillir 30 pl de AF pour chaque foetus en utilisant une seringue d'insuline dans 15 ml flacon conique.
  12. Après la collecte AF, laver chaque fœtus 1x stérile PBS supplémenté avec du sérum de 1% de veau fœtal (FBS) et de recueillir dans les 15 ml tube conique contenant l'AF.
  13. Centrifugeuse AF à 145 xg pendant 5 min. Retirer le surnageant sous le capot et épépiner les cellules AF granulées.

4. Souris AF Culture cellulaire

  1. Ensemencement des cellules AF souris
    1. Un jour avant le semis, préparer une gélatine à revêtement plaque de 6 puits 0,1% avec MEF mitomycine C-traitée.
    2. Après la collecte AF, ensemencer les cellules obtenues à partir d' une amniocentèse (environ 1 x 10 7 cellules obtenues à partir de 6 fœtus) sur le MEF mitotique inactivé en utilisant un milieu de culture AF.
    3. Cultiver les cellules à 37 ° C et 5% de CO 2, en changeant le milieu tous les deux jours.
    4. Après 7 jours de culture, transcellules fet AF suivant la procédure décrite ci-dessous.

5. Transfection, iPS-AF cellulaire Génération et culture

REMARQUE: Les cellules AF souris ont été transfectées avec le plasmide transposon PB-tetO2-IRES-OKMS, en liaison avec un plasmide d'expression de la transposase (mPBase) et avec le transactivateur de tetracycline inverse (PB-ACG-rtTA) transposon plasmide. Tous les plasmides ont été fournis par le professeur Andras Nagy 33.

  1. Mélanger 1 pg de PB-tetO2-IRES-OKMS avec 0,5 pg de mPBase et 0,5 pg de PB-CAG-rtTA (ADN total: 2 pg) dans un tube de 1,5 ml.
  2. Diluer l'ADN à 100 ul avec du milieu sans sérum (milieu de Eagle modifié par Dulbecco - DMEM).
  3. Ajouter 8 ul du réactif de transfection (par exemple, FUGENE) (au rapport de l' ADN plasmidique: agent de transfection de 2 ug (ADN) à 8 ul agent de transfection) dans l'ADN contenant 1,5 ml microtube.
  4. Laisser incuber le mélange réactif / ADN de transfection pendant 15 minutes à température ambiante.
  5. Ajouter goutte à goutte 100 ul du mélange réactif de transfection / ADN par puits dans une plaque à 6 puits avec des cellules de souris AF et à distribuer par tourbillonnement doux, avec un volume final de 2 ml / puits. Laisser pendant 24 h.
  6. Le lendemain, induisent l'expression des facteurs de la Yamanaka (Oct4, Klf4, cMyc, Sox2) en alimentant les cellules avec du milieu frais iPS-AF complété avec 1,5 pg / ml de doxycycline (2 ml de milieu pour chaque puits).
  7. Nourrir les cellules tous les jours, sans passage, avec un milieu contenant de dox-frais (maintenir les cellules dans des milieux supplémentés avec de la doxycycline jusqu'au point de 5.13).
  8. Observer les cellules dans les 24 h pour une expression mCherry et quotidiennement pendant la formation de colonies (colonies apparaissent typiquement entre 20 et 30 jours après la transfection).
  9. Un jour avant la cueillette colonie, préparer une plaque à 96 puits de culture tissulaire avec MEF mitomycine C-traitée.
  10. Choisissez des colonies isolées dans 50 pi de volume de usinga 200 ul pipette, et de les transférer séquentiellement dans une plaque de 96 puits dans des puits individuels.
  11. Le lendemain, toutes les colonies se dissocient en cellules individuelles en ajoutant 50 pi de la trypsine commerciale et incuber pendant 5 minutes à 37 ° C.
  12. Pipeter haut et bas pour désagréger la colonie.
  13. Transférer 50 ul de la trypsine contenant la colonie dissociée dans un nouveau puits avec inactivé MEF sur une gélatine de 0,1% revêtu 96 plaques à puits rempli de 100 pi de milieu frais iPS-AF complété avec de la doxycycline.
  14. Lorsque les cellules atteignent 60-70% de confluence, répartis dans un puits d'une plaque de 24 puits.
  15. Lorsque les cellules atteignent 60-70% de confluence, divisé 1: 2 à deux puits, l'une avec la doxycycline et l'autre sans doxycycline, afin de vérifier si les colonies apparaissent également dans la condition sans doxycycline.
  16. Continuer à maintenir des clones iPS-AF, doxycycline indépendant, sur inactivé MEF dans le milieu iPS-AF.
  17. Cultiver les cellules à 37 ° C et 5% de CO 2, CHAnging moyenne quotidienne.

6. phosphatase alcaline Staining

  1. Effectuer alcaline phosphatase coloration suivant le protocole du fabricant chaque fois qu'il ya l'apparition de cellules iPS-AF indépendantes doxycycline.

7. immunofluorescence

  1. Chaque fois qu'il ya l'apparition de doxycycline cellules indépendantes iPS-AF, semences 150.000 cellules / cm2 sur un puits d'une plaque de 24 puits avec inactivé MEF, et faire croître les cellules pendant 48 heures à 37 ° C et 5% de CO 2.
  2. (ATTENTION) Fixer les cellules en ajoutant 300 ul par puits de 4% de paraformaldehyde (PFA) pendant 15 min à température ambiante.
  3. Ajouter 300 ul de 0,1% NP-40 cellules pour perméabiliser.
  4. Rinçage des cellules avec 300 pi de 0,1% de PBS-Tween 20.
  5. Ajouter 300 pi de tampon de blocage (sérum de cheval à 10% dans 1 x PBS) pendant 1 heure à température ambiante.
  6. Utilisez les anticorps primaires suivants: Oct4 (1:80), Sox2 (1:80), Klf4 (1:80), Nanog (1:100) et SSEA1 (1:80). Diluer SSEA1 avec 1% d'albumine de sérum bovin (BSA), 10% de sérum de chèvre normal, 0,3 M de glycine à 0,1% de PBS-Tween-20. Diluer tous les autres anticorps avec 10% de sérum de cheval dans du PBS 1x.
  7. Incuber anticorps nuit à 4 ° C.
  8. Rincer avec 300 ul de 0,1% de PBS-Tween-20.
  9. Utiliser les anticorps secondaires dilués dans du sérum de cheval à 10% dans 1 x PBS: chèvre Alexa594 conjugué IgG anti-souris (1: 200), l'IgG de poulet anti-chèvre Alexa594 conjugué (1: 200), le poulet anti-lapin Alexa594 conjugué IgG (1: 200), de chèvre conjugué à Alexa568-IgM anti-souris (1: 200). Incuber pendant 2 heures à la température ambiante.
  10. Rincer avec PBS 1x.
  11. noyaux de taches avec une solution Hoechst (1: 10,000) dans PBS 1x.

8. In Vitro Différenciation Cellulaire

  1. Pour former suspendus goutte corps embryoïdes (EbS), cultiver simples gouttes (2.000 cellules / 20 ul) sur le couvercle de boîtes de Pétri, en utilisant le moyen de différenciation.
  2. Incuber les plats à 37 ° Cet 5% de CO 2 pendant 4 jours.
  3. Transférer EB 100 mm dans des plats de qualité bactérienne dans la culture en suspension pendant 3 jours dans un milieu de différenciation.
  4. EBs des plaques à 24 puits dans des plaques revêtues de la matrice de membrane basale (dilué à 1:10 dans du DMEM) pendant 14 jours.
  5. Pour les analyses immunofluorescence, utiliser des anticorps primaires: T (1: 100), αfp (1: 200) et Tubb3 (1: 500) 37.

Formation 9. In Vivo Teratoma

  1. Injecter 100 ul de 1 x PBS contenant 1 x 10 6 cellules iPS-AF dans le muscle de la patte arrière de RAG2 - / - - / - Yc souris.
  2. Sacrifiez les souris par dislocation cervicale 6 semaines après l'injection de cellules.
  3. Retirer les masses tumorales, qui se distinguent par leur taille, à partir de la patte arrière de la souris pour les analyses suivantes.
  4. Couper 7-10 um d'épaisseur des sections transversales de la tumeur en isopentane congelé à l'aide d'un cryostat.
  5. Pour Hématoxyline uned éosine (HE) Tache:
    1. Colorer avec HE pour évaluer la composition de tissu tumoral, en suivant le protocole du fabricant.
  6. Pour Stain immunoperoxydase:
    1. Fixer les sections de tératome avec 4% de PFA pendant 15 min à température ambiante.
    2. Perméabiliser avec 0,1% de Triton X-100.
  7. Laisser incuber avec les anticorps suivants: Tubb3 (1: 100), αfp (01:50) et αSMA (1: 100) dilué dans 1% de BSA dans PBS 1x. Incuber pendant 1 heure à 37 ° C (pour Tubb3) ou une nuit à 4 ° C (pour les autres anticorps).
  8. peroxydase de bloc à l'aide de méthanol à 100% pendant 20 minutes.
  9. Incuber pendant 45 min à 37 ° C avec un anticorps secondaire conjugué à la HRP (1: 150) anti-souris.
  10. Rincer avec PBS 1x.
  11. Incuber avec de la peroxydase (HRP) substrat (voir le tableau des matériaux) pendant 5 min.
  12. Rincer à l'eau du robinet pendant 5 min.
  13. Colorer avec Hématoxyline QS pendant 9 sec.
  14. Rincer à l'eau du robinet.

10. Extraction de l'ARN à partir de cellules

  1. Utiliser un kit d'extraction d'ARN du commerce, selon le protocole recommandé par le fabricant.

11. Extraction de l'ARN à partir de Teratoma

  1. Homogénéiser le tératome aide d'un pilon et d'azote mortier et liquide pour éviter la décongélation de l'échantillon.
  2. Peser 25 mg de tissu.
  3. Ajouter 1 mL de réactif commercial pour l'extraction de l'ARN et 200 pi de chloroforme.
  4. Incuber à température ambiante pendant 5 min.
  5. Centrifuger à 13 000 x g et 4 ° C pendant 15 min.
  6. Transférer le surnageant clarifié dans un nouveau tube.
  7. Pour purifier l'ARN utilise un kit d'extraction d'ARN du commerce, selon le protocole du fabricant.

12. Transcription inverse-polymérase Analyse Chain Reaction

  1. Synthétiser le premier brin d'ADNc en utilisant une transcriptase inverse pour la transcription inverse (RT) réaction en chaîne de -polymerase (PCR) et oligo (dT) according le protocole du fabricant, pour obtenir 50 ng / ul d'ADNc. Diluer ADNc avec de l'eau sans RNase à une concentration de 10 ng / ul.
  2. Effectuer une RT-PCR en utilisant la polymerase d'ADN selon le protocole du fabricant, en utilisant 1 ng / pl d'ADNc.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Résultats

Pour évaluer la capacité de reprogrammation, les cellules AF souris ont été prélevés sur des foetus de souris GFP. Les cellules ont été transfectées avec le plasmide transposon circulaire PB-tetO2-IRES-OKMS, qui exprime les facteurs Yamanaka (Oct4, Sox2, cMyc et Klf4) liés à la protéine fluorescente mCherry d'une manière doxycycline inductible, et inverse la tetracycline transactivateur (PB- ACG rtTA) plasmides conjointement avec le plasmide d'expression de la transposase (mPBase). Cellu...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Discussion

La méthode choisie pour obtenir l'induction de la pluripotence est pertinente pour la sécurité clinique cellule par rapport à la greffe à long terme. De nos jours, il existe plusieurs méthodes appropriées pour la reprogrammation. Parmi les méthodes non-intégration, le viral (SeV) vecteur Sendai est un virus à ARN qui peut produire de grandes quantités de protéines sans intégrer dans le noyau des cellules infectées 40 et pourrait être une stratégie pour obtenir des cellules iPS. vecteurs SeV p...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Déclarations de divulgation

Les auteurs n'ont rien à dévoiler.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par la Fondation CARIPARO Subvention numéro 13/04 et Fondazione Istituto di Ricerca Pediatrica Città della Speranza Bourse numéro 10/02. Martina Piccoli, Chiara Franzin et Michela Pozzobon sont financées par la Fondazione Istituto di Ricerca Pediatrica Città della Speranza. Enrica Bertin est financée par la Fondation CARIPARO Bourse numéro 13/04. Paolo De Coppi est financé par la Great Ormond Street Hospital Children’s Charity.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Boîtes de Pétri de qualité bactérienne de 100 mm  ;BD Falcon351029Pour la différenciation in vitro
2-mercaptoéthanol  ;SigmaM6250Pour la FA de souris, les cellules iPS-AF et le milieu de différenciation
IgM de chèvre conjuguée à Alexa568.Thermo Fisher ScientificA21043Anticorps secondaire (immunofluorescence)
Poulet conjugué à Alexa594 IgG de poulet  ;Thermo Fisher ScientificA21468Anticorps secondaire (immunofluorescence)
Poulet conjugué à Alexa594 IgG  ;Thermo Fisher ScientificA21442Anticorps secondaire (immunofluorescence)
IgG de chèvre conjuguée à Alexa594 IgG  ;Thermo Fisher ScientificA11005Kit d’anticorps secondaires (immunofluorescence)
Phosphatase alcaline  ;Sigma85L1Phosphatase alcaline  ; coloration
AmpicillineSigmaA0166Pour la sélection bactérienne
Sérum bovin Albumine  ;SigmaA7906BSA, pour solution de blocage. Dilué dans du PBS 1x
ChloroformSigmaC2432Pour l’extraction de l’ARN
Cellules DH5&alphaThermo Fisher Scientific18265-017Bactéries pour procédure de clonage
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)Thermo Fisher Scientific41965039Pour MEF, souris AF, cellules iPS-AF et milieu
de différenciationDoxycycline  ;SigmaD9891Pour l’expression de facteurs exogènes
Tubes à microcentrifuger (1,5 ml)  ;Sarstedt  ;72.706Pour la production de PB
ES FBS  ;Thermo Fisher Scientific10439024Pour la FA de souris, les cellules iPS-AF et le milieu de différenciation
FBS  ;Thermo Fisher Scientific10270106Pour MEF Pince à
pointe finemoyenne F.S.TDumont #5  ;Isolation AF
GélatineJ.T.Baker131Utilisé 0,1 %, dilué dans du PBS 1x
GlycineBio-Rad161-0718Pour solution bloquante. Dilué dans PBS 1x
Haematoxylin QSVector LaboratoriesH3404Détection des noyaux
HE  ;Bio-Optica04-061010Analyse histologique du tératome
Hoechst  ;Thermo Fisher ScientificH3570Détection
de noyaux Sérum de chevalThermo Fisher Scientific16050-122Pour solution bloquante
HRP chèvre conjuguée anti-souris IgGSantaCruzsc2005Anticorps secondaire (immunoperoxydase)
ImmPACT NovaRED  ;Vector LaboratoriesSK4805Substrat de la peroxydase
Seringue à insuline avec aiguille (25 G)TerumoSS+01H25161Procédure d’amniocentèse
Klf4  ;SantaCruzsc-20691IgG polyclonales
de lapin L-glutamine  ;Thermo Fisher Scientific25030Pour la FA de souris, les cellules iPS-AF et le milieu de différenciation
LB bouillon (Lennox)SigmaL3022Pour la croissance bactérienne
LIF  ;SigmaL5158Pour les cellules AF de souris et les cellules iPS-AF moyennes
Matrigel  ;BD354234Pour la différenciation in vitro. Dilué 1:10 dans DMEM
MéthanolSigma32213peroxydase
MULTIWELL Plaque à 24 puitsBD Falcon353047Pour la différenciation in vitro
MULTIWELL Plaque à 6 puitsBD Falcon353046Pour la culture de cellules MEF, AF de souris et iPS-AF
Nanog  ;ReproCELLRCAB0002P-FIgG polyclonaux de lapin
Acides aminés non essentiels  ;SigmaM7145Pour la souris AF, les cellules iPS-AF et le milieu de différenciation
Normal Goat SerumVector LaboratoriesS2000Pour la solution de blocage. Dilué dans du PBS 1x
NP-40Sigma12087-87-0Pour la perméabilisation cellulaire. Dilué dans PBS 1x
Oct4SantaCruzsc-5279Souris monoclonale IgG2b
Oligo (dT)  ;Thermo Fisher Scientific18418012Pour RT-PCR
Paraformaldéhyde (solution)Sigma441244PFA, fixateur, dilué dans PBS
PBS 10xThermo Fisher Scientific14200-067D-PBS, sans Ca2+/Mg2+. Dilué avec de l’eau stérile pour obtenir du PBS 1x
Pénicilline - Streptomycine  ;Thermo Fisher Scientific15070063Pour MEF, souris AF, cellules iPS-AF et milieu de différenciation
Boîte de Petri (150 mm)BD Falcon 353025Pour la culture MEF, la culture tissulaire
Plasmide d’expression de la transposase PiggyBac  ;Fourni par le professeur Andras Nagylaboratoire-mPBase
PiggyBac-tetO2-IRES-OKMS plasmide de transposonFourni par le professeur Andras Nagylaboratoire-PB-tetO2-IRES-OKMS
QIAprep Spin Maxiprep KitQiagen12663Pour la purification des plasmides
QIAprep Spin Miniprep KitQiagen27106Pour la purification
des plasmidesPlasmide de transposon transactivateur de tétracycline inverse  ;Fourni par le professeur Andras Nagylaboratoire-rtTA
RNeasy Mini Kit  ;Qiagen74134Pour l’extraction de l’ARN
Sox2  ;SantaCruzsc-17320IgG polyclonale de chèvre
SSEA1  ;Abcamab16285Souris monoclonale IgM
SuperScript II Transcriptase inverse  ;Thermo Fisher Scientific18064-014pour RT-PCR
T  ;Abcamab20680Lapin polyclonal IgG
Taq ADN polyméraseThermo Fisher Scientific10342020PCR
Trypsine  ;Thermo Fisher Scientific25300-054Passage de culture cellulaire
Triton X-100Bio-Rad161-047Pour la perméabilisation cellulaire, dilué dans du PBS 1x
Réactif TRIzolThermo Fisher Scientific15596-026Pour l’extraction
Tubb3  ;   ;Promega  ;G712ASouris monoclonale IgG1
TWEEN-20SigmaP1379Pour la perméabilisation cellulaire, diluée dans PBS 1x
&alpha ; fp  ;   ;   ;R& D SystemsMAB1368souris monoclonales IgG1
&alpha ;SMA  ;Abcamab7817monoclonal IgG2a
de souris (FuGENE HD)Promega  ;E2311Pour la transfection des cellules AF
StéréomicroscopeNikonSM2645Pour effectuer l’amniocentèse  ;
200 &mu ; l conseilsSarstedt  ;70.760012Pour prélever des colonies de bactéries
CiseauxF.S.T14094-11 inox 25UPour effectuer l’amniocentèse  ;
ÉthanolSigma2860Pour nettoyer la paroi abdominale de la mère gravide
Boîte de Pétri de culture tissulaire (150 mm)BD Falcon353025Pour l’expansion MEF
Mitomycine CSigmaM4287-2MGPour l’inactivation MEF
MULTIWELL 96 Plaqueà puits BD Falcon353071Pour la culture iPS-AF
 ; Blocage de la de l’ARN Réactif de transfection

Références

  1. You, Q., et al. Isolation of human mesenchymal stem cells from third-trimester amniotic fluid. Int J Gynaecol Obstet. 103 (2), 149-152 (2008).
  2. Prusa, A. R., Hengstschlager, M. Amniotic fluid cells and human stem cell research: a new connection. Med Sci Monit. 8 (11), RA253-RA257 (2002).
  3. Ditadi, A., et al. Human and murine amniotic fluid c-Kit+ Lin- cells display hematopoietic activity. Blood. 113 (17), 3953-3960 (2009).
  4. Piccoli, M., et al. Amniotic fluid stem cells restore the muscle cell niche in a HSA-Cre, Smn(F7/F7) mouse model. Stem Cells. 30 (8), 1675-1684 (2012).
  5. Zani, A., et al. Amniotic fluid stem cells improve survival and enhance repair of damaged intestine in necrotising enterocolitis via a COX-2 dependent mechanism. Gut. 63 (2), 300-309 (2014).
  6. Rota, C., et al. Human amniotic fluid stem cell preconditioning improves their regenerative potential. Stem Cells Dev. 21 (11), 1911-1923 (2012).
  7. Mirabella, T., et al. Pro-angiogenic soluble factors from Amniotic Fluid Stem Cells mediate the recruitment of endothelial progenitors in a model of ischemic fasciocutaneous flap. Stem Cells Dev. 21 (12), 2179-2188 (2012).
  8. Mirabella, T., Cili, M., Carlone, S., Cancedda, R., Gentili, C. Amniotic liquid derived stem cells as reservoir of secreted angiogenic factors capable of stimulating neo-arteriogenesis in an ischemic model. Biomaterials. 32 (15), 3689-3699 (2011).
  9. Yeh, Y. C., et al. Cardiac repair with injectable cell sheet fragments of human amniotic fluid stem cells in an immune-suppressed rat model. Biomaterials. 31 (25), 6444-6453 (2010).
  10. Kim, J. A., et al. MYOD mediates skeletal myogenic differentiation of human amniotic fluid stem cells and regeneration of muscle injury. Stem Cell Res Ther. 4 (6), 147(2013).
  11. Vadasz, S., et al. Second and third trimester amniotic fluid mesenchymal stem cells can repopulate a de-cellularized lung scaffold and express lung markers. J Pediatr Surg. 49 (11), 1554-1563 (2014).
  12. Turner, C. G., et al. Preclinical regulatory validation of an engineered diaphragmatic tendon made with amniotic mesenchymal stem cells. J Pediatr Surg. 46 (1), 57-61 (2011).
  13. Galende, E., et al. Amniotic Fluid Cells Are More Efficiently Reprogrammed to Pluripotency Than Adult Cells. Cloning Stem Cells. 12 (2), 117-125 (2009).
  14. Li, C., et al. Pluripotency can be rapidly and efficiently induced in human amniotic fluid-derived cells. Hum Mol Genet. 18 (22), 4340-4349 (2009).
  15. Ye, L., et al. Induced pluripotent stem cells offer new approach to therapy in thalassemia and sickle cell anemia and option in prenatal diagnosis in genetic diseases. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (24), 9826-9830 (2009).
  16. Wolfrum, K., et al. The LARGE Principle of Cellular Reprogramming: Lost, Acquired and Retained Gene Expression in Foreskin and Amniotic Fluid-Derived Human iPS Cells. PLoS ONE. 5 (10), 137-138 (2010).
  17. Ye, L., et al. Generation of induced pluripotent stem cells using site-specific integration with phage integrase. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (45), 19467-19472 (2010).
  18. Lu, H. E., et al. Selection of alkaline phosphatase-positive induced pluripotent stem cells from human amniotic fluid-derived cells by feeder-free system. Exp Cell Res. 317 (13), 1895-1903 (2011).
  19. Lu, H. E., et al. Modeling Neurogenesis Impairment in Down Syndrome with Induced Pluripotent Stem Cells from Trisomy 21 Amniotic Fluid Cells. Exp Cell Res. 319 (4), 498-505 (2012).
  20. Kobari, L., et al. Human induced pluripotent stem cells can reach complete terminal maturation: in vivo and in vitro evidence in the erythropoietic differentiation model. Haematologica. 97 (12), 1795-1803 (2012).
  21. Li, Q., Fan, Y., Sun, X., Yu, Y. Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Human Amniotic Fluid Cells by Reprogramming with Two Factors in Feeder-free Conditions. J Reprod Dev. 59 (1), 72-77 (2012).
  22. Fan, Y., Luo, Y., Chen, X., Li, Q., Sun, X. Generation of Human β-thalassemia Induced Pluripotent Stem Cells from Amniotic Fluid Cells Using a Single Excisable Lentiviral Stem Cell Cassette. J Reprod Dev. 58 (4), 404-409 (2012).
  23. Liu, T., et al. High efficiency of reprogramming CD34+ cells derived from human amniotic fluid into induced pluripotent stem cells with Oct4. Stem Cells Dev. 21 (12), 2322-2332 (2012).
  24. Jiang, G., et al. Human transgene-free amniotic-fluid-derived induced pluripotent stem cells for autologous cell therapy. Stem Cells Dev. 23 (21), 2613-2625 (2014).
  25. Drozd, A. M., et al. Generation of human iPSC from cells of fibroblastic and epithelial origin by means of the oriP/EBNA-1 episomal reprogramming system. Stem Cell Res Ther. 6 (122), (2015).
  26. Moschidou, D., et al. Human mid-trimester amniotic fluid stem cells cultured under embryonic stem cell conditions with Valproic acid acquire pluripotent characteristics. Stem Cells Dev. 22 (3), 444-458 (2012).
  27. Moschidou, D., et al. Valproic Acid Confers Functional Pluripotency to Human Amniotic Fluid Stem Cells in a Transgene-free Approach. Mol Ther. 20 (10), 1953-1967 (2012).
  28. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
  29. Mikkelsen, T. S., et al. Dissecting direct reprogramming through integrative genomic analysis. Nature. 454 (7200), 49-55 (2008).
  30. Sridharan, R., et al. Role of the murine reprogramming factors in the induction of pluripotency. Cell. 136 (2), 364-377 (2009).
  31. Knight, S., Collins, M., Takeuchi, Y. Insertional mutagenesis by retroviral vectors: current concepts and methods of analysis. Curr Gene Ther. 13 (3), 211-227 (2013).
  32. Fraser, M. J., Ciszczon, T., Elick, T., Bauser, C. Precise excision of TTAA-specific lepidopteran transposons piggyBac (IFP2) and tagalong (TFP3) from the baculovirus genome in cell lines from two species of Lepidoptera. Insect Mol Biol. 5 (2), 141-151 (1996).
  33. Woltjen, K., Kim, S. I., Nagy, A. The PiggyBac Transposon as a Platform Technology for Somatic Cell Reprogramming Studies in Mouse. Methods Mol Biol. 1357, 1-22 (2015).
  34. Wu, S. C., et al. piggyBac is a flexible and highly active transposon as compared to sleeping beauty, Tol2, and Mos1 in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (41), 15008-15013 (2006).
  35. Ding, S., et al. Efficient transposition of the piggyBac (PB) transposon in mammalian cells and mice. Cell. 122 (3), 473-483 (2005).
  36. Wang, W., et al. Chromosomal transposition of PiggyBac in mouse embryonic stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (27), 9290-9295 (2008).
  37. Cadiñanos, J., Bradley, A. Generation of an inducible and optimized PiggyBac transposon system. Nucleic Acids Res. 35 (12), e87(2007).
  38. Bertin, E., et al. Reprogramming of mouse amniotic fluid cells using a PiggyBac transposon system. Stem Cell Research. 15 (3), 510-513 (2015).
  39. Woltjen, K., et al. piggyBac transposition reprograms fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Nature. 458 (7239), 766-770 (2009).
  40. Fusaki, N., et al. Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome. Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci. 85 (8), 348-362 (2009).
  41. Nishishita, N., et al. Generation of virus-free induced pluripotent stem cell clones on a synthetic matrix via a single cell subcloning in the naive state. PLoS One. 7 (9), e38389(2012).
  42. Ono, M., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human nasal epithelial cells using a Sendai virus vector. PLoS One. 7 (8), e42855(2012).
  43. Yant, S. R., et al. High-resolution genome-wide mapping of transposon integration in mammals. Mol Cell Biol. 25 (6), 2085-2094 (2005).
  44. Wilson, M. H., Coates, C. J., George, A. L. PiggyBac transposon-mediated gene transfer in human cells. Mol Ther. 15 (1), 139-145 (2007).
  45. Galvan, D. L., et al. Genome-wide mapping of PiggyBac transposon integrations in primary human T cells. J Immunother. 32 (8), 837-844 (2009).
  46. Huang, X., et al. Gene transfer efficiency and genome-wide integration profiling of Sleeping Beauty, Tol2, and piggyBac transposons in human primary T cells. Mol Ther. 18 (10), 1803-1813 (2010).
  47. Meir, Y. J., et al. Genome-wide target profiling of PiggyBac and Tol2 in HEK 293: pros and cons for gene discovery and gene therapy. BMC Biotechnol. 11 (28), (2011).
  48. Moretti, A., et al. Patient-specific induced pluripotent stem-cell models for long-QT syndrome. N Engl J Med. 363 (15), 1397-1409 (2010).
  49. Filareto, A., et al. An ex vivo gene therapy approach to treat muscular dystrophy using inducible pluripotent stem cells. Nat Commun. 4 (1549), (2013).
  50. Darabi, R., et al. Human ES- and iPS-derived myogenic progenitors restore DYSTROPHIN and improve contractility upon transplantation in dystrophic mice. Cell Stem Cell. 10 (5), 610-619 (2012).

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Réimpressions et autorisations

Demander l’autorisation de réutiliser le texte ou les figures de cet article JoVE

Demander une autorisation

Mots-clés

Reprogrammation de cellules iPSdiff renciation des feuillets embryonnairesformation de t ratomesmicroscopie fluorescenceanalyse par RT PCRinduction la doxycyclinecellules nourrici res MEF

Articles connexes