Dans cette étude, nous générons des cellules souches pluripotentes induites à partir de cellules de liquide amniotique de souris, en utilisant un système de transposon non viral.
Un abonnement JoVE est requis pour visualiser ce contenu. Connectez-vous ou commencez votre période d'essai gratuite.
Article de méthode
La production de cellules souches pluripotentes de souris amniotique Cellules Fluid Utilisation d'un système de transposon
Dans cet article
Résumé
Résumé
Les cellules souches pluripotentes induites (iPS) sont générées à partir de cellules somatiques de souris et d’humains par expression forcée de facteurs de transcription définis à l’aide de différentes méthodes. Ici, nous avons produit des cellules iPS à partir de cellules de liquide amniotique de souris, en utilisant un système de transposon non viral. Toutes les lignées cellulaires iPS obtenues présentaient des caractéristiques des cellules pluripotentes, y compris la capacité de se différencier vers des dérivés des trois couches germinales in vitro et in vivo. Cette stratégie ouvre la possibilité d’utiliser des cellules de fœtus malades pour développer de nouvelles thérapies contre les malformations congénitales.
Introduction
Le diagnostic prénatal est un outil clinique important d'évaluer les maladies génétiques (ie des aberrations chromosomiques, des maladies monogéniques ou polygéniques / multifactorielle) et des malformations congénitales (hernie diaphragmatique congénitale ie, lésions pulmonaires kystiques, omphalocèle, gastroschisis). Cellules de liquide amniotique (AF) sont simples à obtenir des procédures régulièrement programmées au cours du deuxième trimestre de la grossesse (c. -à- amniocentèse et amnioreduction) ou césariennes 1, 2. La disponibilité des cellules AF de patients prénatales ....
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Protocole
Toutes les procédures étaient conformes à la loi italienne. échantillons murin AF ont été récoltées à partir de souris enceintes à 13,5 jours après le coït (dpc) à partir de C57BL / 6-Tg souris (UBC-GFP) 30Scha / J appelé GFP.
1. transposon production
REMARQUE: transposon des vecteurs d'expression ont été générés en utilisant des procédures de clonage standard. L'ADN plasmidique pour la transfection des cellules de souris AF a été préparé à l'aide de kits commerciaux.
- Mélanger 10 ng d'ADN plasmidique avec 50 ul de bactéries DH5a dans un tube de 1,5 ml. Laisser incuber le microtube su....
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Résultats
Pour évaluer la capacité de reprogrammation, les cellules AF souris ont été prélevés sur des foetus de souris GFP. Les cellules ont été transfectées avec le plasmide transposon circulaire PB-tetO2-IRES-OKMS, qui exprime les facteurs Yamanaka (Oct4, Sox2, cMyc et Klf4) liés à la protéine fluorescente mCherry d'une manière doxycycline inductible, et inverse la tetracycline transactivateur (PB- ACG rtTA) plasmides conjointement avec le plasmide d'expression de la transposase (mPBase). Cellu.......
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Discussion
La méthode choisie pour obtenir l'induction de la pluripotence est pertinente pour la sécurité clinique cellule par rapport à la greffe à long terme. De nos jours, il existe plusieurs méthodes appropriées pour la reprogrammation. Parmi les méthodes non-intégration, le viral (SeV) vecteur Sendai est un virus à ARN qui peut produire de grandes quantités de protéines sans intégrer dans le noyau des cellules infectées 40 et pourrait être une stratégie pour obtenir des cellules iPS. vecteurs SeV p.......
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Déclarations de divulgation
Les auteurs n'ont rien à dévoiler.
Remerciements
Ce travail a été soutenu par la Fondation CARIPARO Subvention numéro 13/04 et Fondazione Istituto di Ricerca Pediatrica Città della Speranza Bourse numéro 10/02. Martina Piccoli, Chiara Franzin et Michela Pozzobon sont financées par la Fondazione Istituto di Ricerca Pediatrica Città della Speranza. Enrica Bertin est financée par la Fondation CARIPARO Bourse numéro 13/04. Paolo De Coppi est financé par la Great Ormond Street Hospital Children’s Charity.
....Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Boîtes de Pétri de qualité bactérienne de 100 mm ; | BD Falcon | 351029 | Pour la différenciation in vitro |
| 2-mercaptoéthanol ; | Sigma | M6250 | Pour la FA de souris, les cellules iPS-AF et le milieu de différenciation |
| IgM de chèvre conjuguée à Alexa568. | Thermo Fisher Scientific | A21043 | Anticorps secondaire (immunofluorescence) |
| Poulet conjugué à Alexa594 IgG de poulet ; | Thermo Fisher Scientific | A21468 | Anticorps secondaire (immunofluorescence) |
| Poulet conjugué à Alexa594 IgG ; | Thermo Fisher Scientific | A21442 | Anticorps secondaire (immunofluorescence) |
| IgG de chèvre conjuguée à Alexa594 IgG ; | Thermo Fisher Scientific | A11005 | Kit d’anticorps secondaires (immunofluorescence) |
| Phosphatase alcaline ; | Sigma | 85L1 | Phosphatase alcaline ; coloration |
| Ampicilline | Sigma | A0166 | Pour la sélection bactérienne |
| Sérum bovin Albumine ; | Sigma | A7906 | BSA, pour solution de blocage. Dilué dans du PBS 1x |
| Chloroform | Sigma | C2432 | Pour l’extraction de l’ARN |
| Cellules DH5&alpha | Thermo Fisher Scientific | 18265-017 | Bactéries pour procédure de clonage |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Thermo Fisher Scientific | 41965039 | Pour MEF, souris AF, cellules iPS-AF et milieu |
| de différenciationDoxycycline ; | Sigma | D9891 | Pour l’expression de facteurs exogènes |
| Tubes à microcentrifuger (1,5 ml) ; | Sarstedt ; | 72.706 | Pour la production de PB |
| ES FBS ; | Thermo Fisher Scientific | 10439024 | Pour la FA de souris, les cellules iPS-AF et le milieu de différenciation |
| FBS ; | Thermo Fisher Scientific | 10270106 | Pour MEF Pince à |
| pointe fine | moyenne F.S.T | Dumont #5 ; | Isolation AF |
| Gélatine | J.T.Baker | 131 | Utilisé 0,1 %, dilué dans du PBS 1x |
| Glycine | Bio-Rad | 161-0718 | Pour solution bloquante. Dilué dans PBS 1x |
| Haematoxylin QS | Vector Laboratories | H3404 | Détection des noyaux |
| HE ; | Bio-Optica | 04-061010 | Analyse histologique du tératome |
| Hoechst ; | Thermo Fisher Scientific | H3570 | Détection |
| de noyaux Sérum de cheval | Thermo Fisher Scientific | 16050-122 | Pour solution bloquante |
| HRP chèvre conjuguée anti-souris IgG | SantaCruz | sc2005 | Anticorps secondaire (immunoperoxydase) |
| ImmPACT NovaRED ; | Vector Laboratories | SK4805 | Substrat de la peroxydase |
| Seringue à insuline avec aiguille (25 G) | Terumo | SS+01H25161 | Procédure d’amniocentèse |
| Klf4 ; | SantaCruz | sc-20691 | IgG polyclonales |
| de lapin L-glutamine ; | Thermo Fisher Scientific | 25030 | Pour la FA de souris, les cellules iPS-AF et le milieu de différenciation |
| LB bouillon (Lennox) | Sigma | L3022 | Pour la croissance bactérienne |
| LIF ; | Sigma | L5158 | Pour les cellules AF de souris et les cellules iPS-AF moyennes |
| Matrigel ; | BD | 354234 | Pour la différenciation in vitro. Dilué 1:10 dans DMEM |
| Méthanol | Sigma | 32213 | peroxydase |
| MULTIWELL Plaque à 24 puits | BD Falcon | 353047 | Pour la différenciation in vitro |
| MULTIWELL Plaque à 6 puits | BD Falcon | 353046 | Pour la culture de cellules MEF, AF de souris et iPS-AF |
| Nanog ; | ReproCELL | RCAB0002P-F | IgG polyclonaux de lapin |
| Acides aminés non essentiels ; | Sigma | M7145 | Pour la souris AF, les cellules iPS-AF et le milieu de différenciation |
| Normal Goat Serum | Vector Laboratories | S2000 | Pour la solution de blocage. Dilué dans du PBS 1x |
| NP-40 | Sigma | 12087-87-0 | Pour la perméabilisation cellulaire. Dilué dans PBS 1x |
| Oct4 | SantaCruz | sc-5279 | Souris monoclonale IgG2b |
| Oligo (dT) ; | Thermo Fisher Scientific | 18418012 | Pour RT-PCR |
| Paraformaldéhyde (solution) | Sigma | 441244 | PFA, fixateur, dilué dans PBS |
| PBS 10x | Thermo Fisher Scientific | 14200-067 | D-PBS, sans Ca2+/Mg2+. Dilué avec de l’eau stérile pour obtenir du PBS 1x |
| Pénicilline - Streptomycine ; | Thermo Fisher Scientific | 15070063 | Pour MEF, souris AF, cellules iPS-AF et milieu de différenciation |
| Boîte de Petri (150 mm) | BD Falcon 353025 | Pour la culture MEF, la culture tissulaire | |
| Plasmide d’expression de la transposase PiggyBac ; | Fourni par le professeur Andras Nagy | laboratoire-mPBase | |
| PiggyBac-tetO2-IRES-OKMS plasmide de transposon | Fourni par le professeur Andras Nagy | laboratoire-PB-tetO2-IRES-OKMS | |
| QIAprep Spin Maxiprep Kit | Qiagen | 12663 | Pour la purification des plasmides |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | Pour la purification |
| des plasmidesPlasmide de transposon transactivateur de tétracycline inverse ; | Fourni par le professeur Andras Nagy | laboratoire-rtTA | |
| RNeasy Mini Kit ; | Qiagen | 74134 | Pour l’extraction de l’ARN |
| Sox2 ; | SantaCruz | sc-17320 | IgG polyclonale de chèvre |
| SSEA1 ; | Abcam | ab16285 | Souris monoclonale IgM |
| SuperScript II Transcriptase inverse ; | Thermo Fisher Scientific | 18064-014 | pour RT-PCR |
| T ; | Abcam | ab20680 | Lapin polyclonal IgG |
| Taq ADN polymérase | Thermo Fisher Scientific | 10342020 | PCR |
| Trypsine ; | Thermo Fisher Scientific | 25300-054 | Passage de culture cellulaire |
| Triton X-100 | Bio-Rad | 161-047 | Pour la perméabilisation cellulaire, dilué dans du PBS 1x |
| Réactif TRIzol | Thermo Fisher Scientific | 15596-026 | Pour l’extraction |
| Tubb3 ; ; | Promega ; | G712A | Souris monoclonale IgG1 |
| TWEEN-20 | Sigma | P1379 | Pour la perméabilisation cellulaire, diluée dans PBS 1x |
| &alpha ; fp ; ; ; | R& D Systems | MAB1368 | souris monoclonales IgG1 |
| &alpha ;SMA ; | Abcam | ab7817 | monoclonal IgG2a |
| de souris (FuGENE HD) | Promega ; | E2311 | Pour la transfection des cellules AF |
| Stéréomicroscope | Nikon | SM2645 | Pour effectuer l’amniocentèse ; |
| 200 &mu ; l conseils | Sarstedt ; | 70.760012 | Pour prélever des colonies de bactéries |
| Ciseaux | F.S.T | 14094-11 inox 25U | Pour effectuer l’amniocentèse ; |
| Éthanol | Sigma | 2860 | Pour nettoyer la paroi abdominale de la mère gravide |
| Boîte de Pétri de culture tissulaire (150 mm) | BD Falcon | 353025 | Pour l’expansion MEF |
| Mitomycine C | Sigma | M4287-2MG | Pour l’inactivation MEF |
| MULTIWELL 96 Plaque | à puits BD Falcon | 353071 | Pour la culture iPS-AF |
Références
- You, Q., et al. Isolation of human mesenchymal stem cells from third-trimester amniotic fluid. Int J Gynaecol Obstet. 103 (2), 149-152 (2008).
- Prusa, A. R., Hengstschlager, M. Amniotic fluid cells and human stem cell research: a new connection.
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Réimpressions et autorisations
