Patch Clamp Enregistrement de cellules amacrines Starburst dans un plat de montage Préparation de Deafferentated Souris Retina

Hung-Ya Tu; Chih-Chun Hsu; Yu-Jiun Chen; Ching-Kang Chen

doi:10.3791/54608

Article de méthode

Patch Clamp Enregistrement de cellules amacrines Starburst dans un plat de montage Préparation de Deafferentated Souris Retina

DOI :

10.3791/54608

⸱

13 octobre 2016

Hung-Ya Tu¹ , Chih-Chun Hsu¹^,² , Yu-Jiun Chen¹ , Ching-Kang Chen¹^,²^,³

¹Department of Ophthalmology, Baylor College of Medicine, ²Department of Neuroscience, Baylor College of Medicine, ³Department of Biochemistry and Molecular Biology, Baylor College of Medicine

Dans cet article

Résumé

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Ce protocole montre comment effectuer des cellules entières d'enregistrement patch clamp sur les neurones de la rétine à partir d'une préparation plate-montage.

Résumé

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La rétine est un tissu de mammifère en couches composée de plusieurs types de neurones. Pour comprendre comment les signaux visuels sont traités au sein de son réseau synaptique complexe, des enregistrements électrophysiologiques sont fréquemment utilisés pour étudier les liens entre les neurones individuels. Nous avons optimisé une préparation plate-support pour l'enregistrement patch clamp de neurones génétiquement marqués dans les deux GCL (couche de cellules ganglionnaires) et INL (couche nucléaire interne) de rétines de souris. Enregistrement neurones INL en-supports plats sont favorisés par rapport aux tranches car les connexions verticales et latérales sont conservées dans l'ancienne configuration, permettant des circuits rétiniens avec de grands composants latéraux à étudier. Nous avons utilisé cette procédure pour comparer les réponses des neurones miroirs en partenariat dans rétines telles que les cellules amacrines Starburst cholinergiques (ZSC).

Introduction

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En tant que partie facilement accessible du système nerveux central, la rétine est depuis des décennies un modèle utile dans les études en neurosciences. Le marquage génétique des neurones a permis une caractérisation détaillée des connexions synaptiques dans la rétine. Avec de nombreuses méthodologies disponibles pour examiner la fonction et la morphologie des neurones rétiniens, la technique d’enregistrement par patch clamp a joué un rôle déterminant dans notre compréhension actuelle des signaux transmis verticalement dans la rétine. Ces signaux proviennent de l’absorption de photons dans les photorécepteurs et sont envoyés aux centres visuels du cerveau par le biai....

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Protocole

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L'approbation éthique - les procédures impliquant des sujets animaux ont été menées en conformité avec les règles et règlements des Instituts nationaux de la santé des lignes directrices pour les animaux de recherche, tel qu'approuvé par la protection des animaux et l'utilisation comité du Baylor College of Medicine.

1. externe et interne Solutions

Utilisez la solution de Ringer mammifère lors de la dissection rétine et que la solution externe pour l'enregistrement électrophysiologique ultérieure. Préparer la solution de Ringer de mammifère à partir de 10x solution mère (sans calcium) le jour de l' enregistrement, et ajoutez

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Résultats

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Enregistrements représentatifs de ON- et OFF de type ZSC d'une rétine de souris deafferentated sont présentés dans la figure 1. Cellules cholinergiques dans les deux GCL et INL peuvent être identifiés de façon fiable par tdTomato fluorescence et ciblées pour l' ensemble de cellules d' enregistrement patch clamp sous DIC (figure 1A) pour révéler l' oscillation de leurs potentiels de membrane (top traces) et les courants synaptiques qui l' animent (traces .......

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Discussion

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De nombreux laboratoires ont enregistré des neurones GCL dans la préparation ^15-18 plate-montage, mais nos procédures permettent l' enregistrement à partir de neurones INL. Nous soulignons par la présente plusieurs étapes qui sont essentielles pour les enregistrements de routine avec succès.

La fraîcheur et la planéité de la rétine sont importantes pour pénétrer avec une pipette d'enregistrement. A cet égard, la fixation solide de la rétine à la membrane de nitrocellulose .......

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

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Nous remercions Joung Jang et Xin Guan pour leur assistance technique. Nous remercions le Dr Rory McQuiston de l’Université du Commonwealth de Virginie pour la mise en place de notre premier dispositif de serrage de patch et nos conseils sur les procédures expérimentales. Nous remercions le Dr Samuel Wu pour ses suggestions sur l’enregistrement par pince de tension. Les travaux sont soutenus par des subventions des NIH EY013811, EY022228 et une subvention de base pour la vision EY002520. C-KC est la chaire dotée de la Fondation de recherche sur la rétine Alice R. McPherson au Baylor College of Medicine.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
Nom	Entreprise	Numéro de catalogue
Microscope fluorescent à platine fixe avec micromanipulateurs DIC	Olympus	BX51-WI
	Sutter	MP-225
Amplificateur à pince de patch	A-M System	AM2400
Convertisseur AD	National Instrument	NI-USB-6221
Contrôleur de chauffage	Warner Instrument	TC-324B
Inline Chauffage	Warner Instrument	SC-20
Pompe péristaltique	Rainin	Dynamax
Extracteur de pipette	Sutter Instrument	P-1000
Tube en verre avec filament	King Precision Glass	Stimulateur personnalisé
	A.M.P.I.	Master-8
Biocytine	Sigma	B4261
NaCl	Sigma	S6191
KCl	Sigma	P5405
NaHCO₃	Fisher	BP328-1
Na₂HPO₄	Sigma	S0876
Na₂HPO<>4	Sigma	S5011
CaCl₂	Sigma	C5670
MgSO₄	Sigma	M1880
D-glucose	Sigma	G6152
K-gluconate	Sigma	G4500
ATP-Mg	Sigma	A9187
Li-GTP	Sigma	G5884
EGTA	Sigma	E0396
HEPES	Sigma	H4034
KOH	Sigma	P5958
Cs-méthanesulfonate	Sigma	C1426
CsOH	Sigma	232041
Seringue	Nalgene	171
1 ml seringue	Rainin
10 &mu ; l pointe de pipette	Genesee Scientific	24-130RL
Streptavidin-488	ThermoFisher	S-11223
10x PBS	Lonza	17-517Q

17013002

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Choi, H., et al. Intrinsic bursting of AII amacrine cells underlies oscillations in the rd1 mouse retina. J Neurophysiol. 112 (6), 1491-1504 (2014).
Gregg, R. G., et al.

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Mots-clés

Patch clamp en configuration cellule enti re neurobiologie r tinienne fluorescence tdTomato couche des cellules ganglionnaires couche nucl aire interne circuits r tiniens

Patch Clamp Enregistrement de cellules amacrines Starburst dans un plat de montage Préparation de Deafferentated Souris Retina

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