Ce protocole montre comment effectuer des cellules entières d'enregistrement patch clamp sur les neurones de la rétine à partir d'une préparation plate-montage.
Article de méthode
Ce protocole montre comment effectuer des cellules entières d'enregistrement patch clamp sur les neurones de la rétine à partir d'une préparation plate-montage.
La rétine est un tissu de mammifère en couches composée de plusieurs types de neurones. Pour comprendre comment les signaux visuels sont traités au sein de son réseau synaptique complexe, des enregistrements électrophysiologiques sont fréquemment utilisés pour étudier les liens entre les neurones individuels. Nous avons optimisé une préparation plate-support pour l'enregistrement patch clamp de neurones génétiquement marqués dans les deux GCL (couche de cellules ganglionnaires) et INL (couche nucléaire interne) de rétines de souris. Enregistrement neurones INL en-supports plats sont favorisés par rapport aux tranches car les connexions verticales et latérales sont conservées dans l'ancienne configuration, permettant des circuits rétiniens avec de grands composants latéraux à étudier. Nous avons utilisé cette procédure pour comparer les réponses des neurones miroirs en partenariat dans rétines telles que les cellules amacrines Starburst cholinergiques (ZSC).
En tant que partie facilement accessible du système nerveux central, la rétine est depuis des décennies un modèle utile dans les études en neurosciences. Le marquage génétique des neurones a permis une caractérisation détaillée des connexions synaptiques dans la rétine. Avec de nombreuses méthodologies disponibles pour examiner la fonction et la morphologie des neurones rétiniens, la technique d’enregistrement par patch clamp a joué un rôle déterminant dans notre compréhension actuelle des signaux transmis verticalement dans la rétine. Ces signaux proviennent de l’absorption de photons dans les photorécepteurs et sont envoyés aux centres visuels du cerveau par le biais de l’enrichissement des cellules ganglionnaires rétiniennes (CGR). Malgré un grand nombre de connaissances accumulées jusqu’à présent, la diversité neuronale dans la rétine vascularisée des mammifères reste non résolue et empêche l’appréciation complète des circuits rétiniens qui desservent la vision normale. Cela s’explique en partie par le fait que la plupart des enregistrements ont été effectués sur des coupes rétiniennes afin d’échanger l’intégrité du circuit latéral contre l’accès à des neurones rétiniens plus proximaux1 à 3. Pour obtenir une image complète de la façon dont la rétine calcule les signaux visuels, il est donc souhaitable d’enregistrer les neurones dans des montages plats où les connexions latérales, grandes et petites, peuvent être mieux préservées.
Lorsque la transmission synaptique des photorécepteurs aux cellules bipolaires est interrompue en raison d’une voie de signalisation métabotropique défectueuse du récepteur du glutamate 6 (mGluR6) dans les cellules bipolaires dépolarisantes4-6 ou simplement à la suite d’une perte de photorécepteurs dans les rétines dégénérées7-10, de nombreux CGR présentent des activités oscillatoires. Ces oscillations proviennent de sources multiples, mais celle impliquant le couplage de jonctions lacunaires entre les cellules amacrines AII (AII-AC) et les cellules bipolaires à cône dépolarisant (DCBC) a reçu le plus d’attention et est donc mieux comprise1,7,11. Nous avons trouvé une autre source, qui persiste sous le blocage pharmacologique du réseau AII-AC/DCBC susmentionné et entraîne l’oscillation des SAC de type OFF chez les souris RhoΔCTA et Nob avec des rétines déafférentées7,8,12. Nous détaillons ici notre protocole de préparation des montages plats rétiniens pour l’enregistrement des neurones INL. Cette approche utilise des lignées de souris commerciales (stock Jax n° 006410 et 007905) pour marquer les neurones rétiniens cholinergiques par l’expression de la protéine fluorescente (tdTomato) identifiable au microscope fluorescent équipé d’une optique améliorant le contraste. Certains résultats expérimentaux obtenus grâce à cette approche ont déjà été rapportés4,5,7,13.
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L'approbation éthique - les procédures impliquant des sujets animaux ont été menées en conformité avec les règles et règlements des Instituts nationaux de la santé des lignes directrices pour les animaux de recherche, tel qu'approuvé par la protection des animaux et l'utilisation comité du Baylor College of Medicine.
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De nombreux laboratoires ont enregistré des neurones GCL dans la préparation 15-18 plate-montage, mais nos procédures permettent l' enregistrement à partir de neurones INL. Nous soulignons par la présente plusieurs étapes qui sont essentielles pour les enregistrements de routine avec succès.
La fraîcheur et la planéité de la rétine sont importantes pour pénétrer avec une pipette d'enregistrement. A cet égard, la fixation solide de la rétine à la membrane de nitrocellulose ...
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Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Nous remercions Joung Jang et Xin Guan pour leur assistance technique. Nous remercions le Dr Rory McQuiston de l’Université du Commonwealth de Virginie pour la mise en place de notre premier dispositif de serrage de patch et nos conseils sur les procédures expérimentales. Nous remercions le Dr Samuel Wu pour ses suggestions sur l’enregistrement par pince de tension. Les travaux sont soutenus par des subventions des NIH EY013811, EY022228 et une subvention de base pour la vision EY002520. C-KC est la chaire dotée de la Fondation de recherche sur la rétine Alice R. McPherson au Baylor College of Medicine.
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| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Microscope fluorescent à platine fixe avec micromanipulateurs DIC | Olympus | BX51-WI | |
| Sutter | MP-225 | ||
| Amplificateur à pince de patch | A-M System | AM2400 | |
| Convertisseur AD | National Instrument | NI-USB-6221 | |
| Contrôleur de chauffage | Warner Instrument | TC-324B | |
| Inline Chauffage | Warner Instrument | SC-20 | |
| Pompe péristaltique | Rainin | Dynamax | |
| Extracteur de pipette | Sutter Instrument | P-1000 | |
| Tube en verre avec filament | King Precision Glass | Stimulateur personnalisé | |
| A.M.P.I. | Master-8 | ||
| Biocytine | Sigma | B4261 | |
| NaCl | Sigma | S6191 | |
| KCl | Sigma | P5405 | |
| NaHCO3 | Fisher | BP328-1 | |
| Na2HPO4 | Sigma | S0876 | |
| Na2HPO<>4 | Sigma | S5011 | |
| CaCl2 | Sigma | C5670 | |
| MgSO4 | Sigma | M1880 | |
| D-glucose | Sigma | G6152 | |
| K-gluconate | Sigma | G4500 | |
| ATP-Mg | Sigma | A9187 | |
| Li-GTP | Sigma | G5884 | |
| EGTA | Sigma | E0396 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| KOH | Sigma | P5958 | |
| Cs-méthanesulfonate | Sigma | C1426 | |
| CsOH | Sigma | 232041 | |
| Seringue | Nalgene | 171 | |
| 1 ml seringue | Rainin | ||
| 10 &mu ; l pointe de pipette | Genesee Scientific | 24-130RL | |
| Streptavidin-488 | ThermoFisher | S-11223 | |
| 10x PBS | Lonza | 17-517Q |
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