Article de méthode

Patch Clamp Enregistrement de cellules amacrines Starburst dans un plat de montage Préparation de Deafferentated Souris Retina

DOI :

10.3791/54608

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13 octobre 2016

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1Department of Ophthalmology, Baylor College of Medicine, 2Department of Neuroscience, Baylor College of Medicine, 3Department of Biochemistry and Molecular Biology, Baylor College of Medicine

Dans cet article

Résumé

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Ce protocole montre comment effectuer des cellules entières d'enregistrement patch clamp sur les neurones de la rétine à partir d'une préparation plate-montage.

Résumé

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La rétine est un tissu de mammifère en couches composée de plusieurs types de neurones. Pour comprendre comment les signaux visuels sont traités au sein de son réseau synaptique complexe, des enregistrements électrophysiologiques sont fréquemment utilisés pour étudier les liens entre les neurones individuels. Nous avons optimisé une préparation plate-support pour l'enregistrement patch clamp de neurones génétiquement marqués dans les deux GCL (couche de cellules ganglionnaires) et INL (couche nucléaire interne) de rétines de souris. Enregistrement neurones INL en-supports plats sont favorisés par rapport aux tranches car les connexions verticales et latérales sont conservées dans l'ancienne configuration, permettant des circuits rétiniens avec de grands composants latéraux à étudier. Nous avons utilisé cette procédure pour comparer les réponses des neurones miroirs en partenariat dans rétines telles que les cellules amacrines Starburst cholinergiques (ZSC).

Introduction

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En tant que partie facilement accessible du système nerveux central, la rétine est depuis des décennies un modèle utile dans les études en neurosciences. Le marquage génétique des neurones a permis une caractérisation détaillée des connexions synaptiques dans la rétine. Avec de nombreuses méthodologies disponibles pour examiner la fonction et la morphologie des neurones rétiniens, la technique d’enregistrement par patch clamp a joué un rôle déterminant dans notre compréhension actuelle des signaux transmis verticalement dans la rétine. Ces signaux proviennent de l’absorption de photons dans les photorécepteurs et sont envoyés aux centres visuels du cerveau par le biais de l’enrichissement des cellules ganglionnaires rétiniennes (CGR). Malgré un grand nombre de connaissances accumulées jusqu’à présent, la diversité neuronale dans la rétine vascularisée des mammifères reste non résolue et empêche l’appréciation complète des circuits rétiniens qui desservent la vision normale. Cela s’explique en partie par le fait que la plupart des enregistrements ont été effectués sur des coupes rétiniennes afin d’échanger l’intégrité du circuit latéral contre l’accès à des neurones rétiniens plus proximaux1 à 3. Pour obtenir une image complète de la façon dont la rétine calcule les signaux visuels, il est donc souhaitable d’enregistrer les neurones dans des montages plats où les connexions latérales, grandes et petites, peuvent être mieux préservées.

Lorsque la transmission synaptique des photorécepteurs aux cellules bipolaires est interrompue en raison d’une voie de signalisation métabotropique défectueuse du récepteur du glutamate 6 (mGluR6) dans les cellules bipolaires dépolarisantes4-6 ou simplement à la suite d’une perte de photorécepteurs dans les rétines dégénérées7-10, de nombreux CGR présentent des activités oscillatoires. Ces oscillations proviennent de sources multiples, mais celle impliquant le couplage de jonctions lacunaires entre les cellules amacrines AII (AII-AC) et les cellules bipolaires à cône dépolarisant (DCBC) a reçu le plus d’attention et est donc mieux comprise1,7,11. Nous avons trouvé une autre source, qui persiste sous le blocage pharmacologique du réseau AII-AC/DCBC susmentionné et entraîne l’oscillation des SAC de type OFF chez les souris RhoΔCTA et Nob avec des rétines déafférentées7,8,12. Nous détaillons ici notre protocole de préparation des montages plats rétiniens pour l’enregistrement des neurones INL. Cette approche utilise des lignées de souris commerciales (stock Jax n° 006410 et 007905) pour marquer les neurones rétiniens cholinergiques par l’expression de la protéine fluorescente (tdTomato) identifiable au microscope fluorescent équipé d’une optique améliorant le contraste. Certains résultats expérimentaux obtenus grâce à cette approche ont déjà été rapportés4,5,7,13.

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Protocole

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L'approbation éthique - les procédures impliquant des sujets animaux ont été menées en conformité avec les règles et règlements des Instituts nationaux de la santé des lignes directrices pour les animaux de recherche, tel qu'approuvé par la protection des animaux et l'utilisation comité du Baylor College of Medicine.

1. externe et interne Solutions

  1. Utilisez la solution de Ringer mammifère lors de la dissection rétine et que la solution externe pour l'enregistrement électrophysiologique ultérieure. Préparer la solution de Ringer de mammifère à partir de 10x solution mère (sans calcium) le jour de l' enregistrement, et ajoutez CaCl2 goutte à goutte au bout de 15 min de carbogenation (95% O 2 et 5% de CO 2). La solution finale 1x contient (en mM): 120 NaCl, 5 KCl, 25 NaHCO 3, 0,8 Na 2 HPO 4, 0,1 NaH 2 PO 4, 2 CaCl2, 1 MgSO4 et 10 D-glucose.
  2. Utilisez deux solutions internes pour caractériser les oscillations SAC. Testerl'utilité des solutions préparées dans les enregistrements de patch clamp à cellules entières sur de longues RGC de souris adultes et de stocker les lots vérifiés dans 500 uL d'aliquotes à -20 ° C jusqu'à utilisation.
    1. Pour l'enregistrement d'une membrane d'oscillation potentielle, utilisant une solution interne à base de potassium qui contient (en mM): 125 K-gluconate, le 8 NaCl, 4 ATP-Mg 0,5 Li-GTP, 5 EGTA, 10 HEPES et 0,2% de la biocytine (p / v). Ajuster le pH à 7,3 avec KOH.
    2. Pour l'enregistrement d'excitateur et des courants postsynaptiques inhibiteurs, en utilisant une solution interne à base de césium, qui contient (en mM): 100 Cs méthanesulfonate, 8 NaCl, 4 ATP-Mg 0,5 Li-GTP, 5 EGTA, 10 HEPES et 0,2% de la biocytine ( p / v). Ajuster le pH à 7,3 avec CsOH.

2. Préparation de la Journée de l'enregistrement

  1. Pour préparer une membrane de nitrocellulose avec des trous ouverts, poinçon manuellement la membrane avec un perforateur sur mesure fabriqué à partir d'un 16 G aiguille de seringue émoussé et aplatir la membrane entre deux plaques de verre propres. Pour un sistesrétine monter, faire un trou central de 0,2 mm de diamètre et de l'entourer par 4 grands trous qui sont 1-1,2 mm de diamètre.
  2. Pour faire un filament de remplissage personnalisé pour le chargement de solution interne en électrodes, faire fondre une pointe de pipette 10 pi au milieu et d'allonger délicatement la partie fondue jusqu'à ce qu'il se refroidit et se durcit. Juste avant l'utilisation, utiliser une lame de rasoir propre pour couper le filament jusqu'à ce qu'il soit légèrement plus long que les pipettes de patch.
  3. Tirez pipettes de patch dans un extracteur programmable de tube de verre borosilicate avec un filament interne. Fabrication micropipettes le jour de l'expérience et de les utiliser immédiatement.
    NOTE: Pour ZSC d'enregistrement, nous utilisons le réglage de traction suivant: la chaleur: 484; tirez: 0; vitesse: 25; temps de retard: 1; pression: 400 et une valeur de rampe 462. Le diamètre extérieur et de l'ID des tubes de borosilicate sont 1,65 mm et 1,0 mm, respectivement. Résistance des pipettes est 10-14 MQ.
  4. Une heure avant la récolte des tissus, décongeler un tube de solution interne par shaking sur un vortex pendant> 30 min.

3. Retina Dissection

  1. Anesthetize l'animal de 4% d'isoflurane dans de l'oxygène jusqu'à ce que l'animal perd la réactivité à un pincement de l'orteil. Sacrifiez l'animal par dislocation cervicale.
  2. Couper les deux globes oculaires au large des nerfs optiques à 1-2 mm de la tête du nerf optique avec iris droites-ciseaux pointus.
  3. Rouler les yeux sur une serviette en papier propre pour enlever le sang, puis les plonger dans une solution de Ringer mammifère carbogenated. Percez un trou sur le limbe avec une aiguille 23 G et bisect les globes oculaires en coupant le long du limbe avec des micro-ciseaux. Retirez la cornée et le cristallin en utilisant une pince fine.
    1. Pour la rétine entière montage, retirez délicatement toute la rétine de l'épithélium pigmentaire avec une pince fine et faire des coupes quatre 1,5-2 mm orthogonales à partir du bord vers la tête du nerf optique.
  4. Immergez une membrane de nitrocellulose poinçonné dans le plat et doucement glisser la rétine dessus avecGCL vers le haut. Placez la tête du nerf optique dans le trou central lors de la préparation entière monter une rétine. Transférer la membrane avec la rétine dans un autre plat propre. aplatir délicatement la rétine avec un pinceau fin pour ressembler à une croix de Malte et de jeter les quatre bords sur les trous.
    1. Si une fraction de la rétine doit être examinée à la fois, couper chaque œilleton préparé à partir de l'étape 3.3 en 3-4 morceaux avec une lame de rasoir avec l'épithélium pigmentaire reste attaché. Protéger les morceaux inutilisés de la lumière dans la solution externe carbogenated et de les utiliser dans les 12 heures.
  5. Tamponnez la membrane de nitrocellulose avec un morceau de papier filtre sec et retirer la membrane vitreuse et intérieure limitant avec une pince et un pinceau.
  6. Assurez-vous que tous les bords de la rétine sont entièrement attachés à la membrane avant de transférer l'ensemble dans la chambre d'enregistrement avec une lamelle de verre scellé au fond. Fixer la membrane avec de la graisse à vide à la lamelle et rehydrate la rétine avec la solution externe. Veillez à ne pas piéger les bulles d'air en dessous de l'ensemble.
  7. Réglez la chambre sur la scène d'un microscope droit. Perfuser la chambre avec chaud (34-35 ° C) solution externe carbogenated à un taux de ~ 3 ml par min.
  8. Examiner la rétine sous un objectif 10x d'abord, puis utiliser une lentille 60x immersion dans l'eau pour voir les neurones GCL et INL sous contraste d'interférence différentiel (DIC) et / ou épifluorescence. Pour visualiser ZSC tdTomato exprimant, utiliser une LED blanche source de lumière en combinaison avec un filtre d'excitation de 554 nm et un filtre d'émission de 581 nm.

4. Le total des cellules Patch Clamp Enregistrement de Flat-mount Retina

  1. Filtrer la solution à travers un filtre interne de la seringue dans le filament de remplissage personnalisée.
  2. Insérez le filament dans une micropipette fraîchement tirée et distribuer la solution interne près de la pointe jusqu'à ce que la solution couvre le fil d'électrode d'argent pour>5 mm. Fixer la micropipette sur un porte-électrode avec un pôle d'aspiration, à travers lequel la pression à l'intérieur de l'électrode peut être réglée en poussant ou en tirant le piston d'une seringue de 10 ml en matière plastique en forme de tube relié.
  3. Trouver la pipette sous l'objectif et de le ramener à ~ 100 um au-dessus de la rétine. Dans le mode courant suiveur (I = 0), l'utilisation de décalage continu à zéro le signal debout de tension continue. Mesurer la résistance de la pipette sous la pince de courant de mode (I Clamp) par injection d' amplitude fixe courants d'onde carrée par la pipette alors qu'il est dans le bain et de neutraliser la différence en tournant le bouton raccess. Utilisez la lecture sur le bouton de raccess pour calculer la résistance de la pipette par la loi d'Ohm.
  4. Ramenez lentement l'électrode à ~ 10 um au-dessus de la rétine. Appliquer une pression positive à l'électrode. Regardez le changement de réflexion à proximité de la pointe de la pipette à l'approche de la rétine. Rapidement, mais forcer doucement la pipette dans le GCL et réduire le PRESSU positifre immédiatement.
  5. Déplacer la pipette vers un neurone marqué. Éviter tout contact avec d'autres neurones, des vaisseaux sanguins et des cellules endfeet Muller. Appliquer une pression plus positive si nécessaire pour empêcher l'électrode de colmatage.
  6. Positionner la pointe de la pipette près de la ligne médiane d'un neurone marqué jusqu'à une fossette est visible. Relâchez la pression positive et permettre à la membrane plasmique de rebondir sur la pointe de la pipette.
  7. Appliquer 20 à 120 pA courants négatifs à la pipette pour aider à la formation d'un joint d'étanchéité giga-ohms. Appliquer une légère aspiration si nécessaire pour tirer la membrane plasmique dans la pipette. Attendre 5 min après la formation du joint d'étanchéité pour rompre la membrane cellulaire. Cela permet à la solution interne renversé est interceptée par surfusion. Rompre la membrane par une aspiration douce.
  8. Après la rupture de la membrane et en mode de pince de courant, allumez l'équilibre du pont et de l'ajuster en utilisant le bouton raccess.
    NOTE: Pour une petite cellule comme le SAC, seulement un léger ajustement est nécessaire, le cas échéant. Alterntivement, record excitateurs et courants postsynaptiques inhibiteurs dans le mode de verrouillage de tension (V Clamp) en maintenant la cellule à des potentiels d'inversion de chlorure (environ -75 mV) et le glutamate (environ 0 mV), respectivement. Vérifier et régler la position de la pipette si nécessaire pour accueillir la rétine occasionnelle et / ou la dérive du micromanipulateur.
  9. Pour enregistrer le potentiel de membrane ou de changement de courant avant, pendant et après le traitement pharmacologique, préparer les bloqueurs synaptiques (par exemple, CNQX, AP5, picrotoxine, tubocurarine, etc.) et des modulateurs de canaux (par exemple, la flupirtine, la dopamine, l' acide méclofénamique, etc.) frais sur le jour de l'expérience à partir de stocks congelés. Diluer les médicaments avec la solution de carbogenated Ringer. Appliquez-les dans une manière discontinue par perfusion.
  10. Après l'enregistrement, retirez délicatement la pipette du soma. Transférer l'ensemble de la chambre à un plat propre. Détachez et re-fixer la rétine sur une autre membrane de nitrocellulose aplati sans hol perforées pour assurer la planéité rétine lors de la fixation.
  11. Fixer la rétine par immersion dans du paraformaldehyde à 4% pendant 30 min à température ambiante. Retirer la rétine à partir de la membrane de nitrocellulose et rincer abondamment avec PBS 1x. Révéler la morphologie des cellules enregistrées par O / N coloration avec de la streptavidine conjugué à un colorant dilué dans 1 x PBS avec 0,4% de Triton X-100 à 4 ° C 14. Monter la rétine en milieu antifade et observer les cellules enregistrées à l'aide d'un microscope confocal à balayage.
    NOTE: Les procédures impliquant paraformaldehyde, qui est volatile et toxique, devraient être menées dans un projet de chambre pour la sécurité.

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Résultats

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Enregistrements représentatifs de ON- et OFF de type ZSC d'une rétine de souris deafferentated sont présentés dans la figure 1. Cellules cholinergiques dans les deux GCL et INL peuvent être identifiés de façon fiable par tdTomato fluorescence et ciblées pour l' ensemble de cellules d' enregistrement patch clamp sous DIC (figure 1A) pour révéler l' oscillation de leurs potentiels de membrane (top traces) et les courants synaptiques qui l' animent (traces ...

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Discussion

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De nombreux laboratoires ont enregistré des neurones GCL dans la préparation 15-18 plate-montage, mais nos procédures permettent l' enregistrement à partir de neurones INL. Nous soulignons par la présente plusieurs étapes qui sont essentielles pour les enregistrements de routine avec succès.

La fraîcheur et la planéité de la rétine sont importantes pour pénétrer avec une pipette d'enregistrement. A cet égard, la fixation solide de la rétine à la membrane de nitrocellulose ...

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

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Nous remercions Joung Jang et Xin Guan pour leur assistance technique. Nous remercions le Dr Rory McQuiston de l’Université du Commonwealth de Virginie pour la mise en place de notre premier dispositif de serrage de patch et nos conseils sur les procédures expérimentales. Nous remercions le Dr Samuel Wu pour ses suggestions sur l’enregistrement par pince de tension. Les travaux sont soutenus par des subventions des NIH EY013811, EY022228 et une subvention de base pour la vision EY002520. C-KC est la chaire dotée de la Fondation de recherche sur la rétine Alice R. McPherson au Baylor College of Medicine.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Microscope fluorescent à platine fixe avec micromanipulateurs DICOlympusBX51-WI
SutterMP-225
Amplificateur à pince de patchA-M SystemAM2400
Convertisseur ADNational InstrumentNI-USB-6221
Contrôleur de chauffageWarner InstrumentTC-324B
Inline ChauffageWarner InstrumentSC-20
Pompe péristaltiqueRaininDynamax
Extracteur de pipetteSutter InstrumentP-1000
Tube en verre avec filamentKing Precision GlassStimulateur personnalisé
A.M.P.I.Master-8
BiocytineSigmaB4261
NaClSigmaS6191
KClSigmaP5405
NaHCO3FisherBP328-1
Na2HPO4SigmaS0876
Na2HPO<>4SigmaS5011
CaCl2SigmaC5670
MgSO4SigmaM1880
D-glucoseSigmaG6152
K-gluconateSigmaG4500
ATP-MgSigmaA9187
Li-GTPSigmaG5884
EGTASigmaE0396
HEPESSigmaH4034
KOHSigmaP5958
Cs-méthanesulfonateSigmaC1426
CsOHSigma232041
SeringueNalgene171
1 ml seringueRainin
10 &mu ; l pointe de pipetteGenesee Scientific24-130RL
Streptavidin-488ThermoFisherS-11223
10x PBSLonza17-517Q
17013002

Références

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