Article de méthode

LED Thermo Flow - Optogenetics Combinant avec cytométrie de flux

DOI :

10.3791/54707

⸱

30 décembre 2016

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1Max-Planck Institute for Immunobiology und Epigenetics, 2Spemann Graduate School of Biology and Medicine (SGBM), University of Freiburg, 3Centre for Biological Signaling Studies, BIOSS, University of Freiburg, 4Albert-Ludwigs-Universität, 5Institute for Biology III (Mol. Immunology), Albert-Ludwigs-Universität

Dans cet article

Résumé

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Les substances optiquement contrôlées sont des outils puissants pour étudier les voies de signalisation. Pour élargir le spectre des expériences possibles, nous avons développé un appareil permettant d’étudier en temps réel des substances optiquement contrôlées à l’aide de la cytométrie en flux : la LED Thermo Flow.

Résumé

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Les outils optogénétiques permettent des investigations fonctionnelles isolées de presque toutes les molécules de signalisation dans des voies de signalisation complexes. Un obstacle majeur est l’apport contrôlé de lumière à l’échantillon cellulaire et, par conséquent, les outils les plus populaires pour les études optogénétiques sont les analyses cellulaires basées sur la microscopie et les expériences in vitro. Le cytomètre en flux présente des avantages majeurs par rapport à un microscope, notamment la capacité de mesurer rapidement des milliers de cellules à une résolution de cellule unique. Cependant, il n’est pas encore largement utilisé en optogénétique. Nous vous présentons ici un appareil qui combine la puissance de l’optogénétique et de la cytométrie en flux : la LED Thermo Flow. Cet appareil éclaire les cellules à des longueurs d’onde, des intensités lumineuses et des températures spécifiques lors de mesures cytométriques en flux. Il peut être construit à faible coût et être utilisé avec les cytomètres en flux les plus courants. Pour démontrer son utilité, nous avons caractérisé la cinétique de photocommutation des protéines Dronpa in vivo et en temps réel. Ce protocole peut être adapté à presque toutes les substances optiquement contrôlées et élargit considérablement l’ensemble des expériences possibles. Plus important encore, il simplifiera considérablement la découverte et le développement de nouveaux outils optogénétiques.

Introduction

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Outils optogénétiques ont gagné en popularité, en partie parce qu'ils peuvent être utilisés pour déchiffrer le câblage des voies de signalisation 1-4. Ils sont basés sur la capacité des protéines photoactivables pour changer leur conformation et l'affinité de liaison lorsqu'il est éclairé par la lumière. Fusionnant ces protéines à des éléments de signalisation permet la régulation spécifique d'un seul joueur dans complexes voies de signalisation intracellulaires 5-12. Par conséquent, une voie de signalisation peut être étudiée avec une résolution spatiale et temporelle élevée.

La plupart des études basées sur des cellules optogénétiques utilisent des méthodes basées sur la microscopie, combinée à la culture en présence de lumière, suivie par l' analyse biochimique 11,12. En revanche, un flux singularise cytomètre de cellules le long d'un capillaire et mesure la taille de la cellule, la granularité et l'intensité de fluorescence. Cette méthode présente des avantages majeurs sur la microscopie ou biochimiques méthodes, y compris la capacité d'analyser thousands de cellules à une résolution unique cellule vivante dans un temps très court. Par conséquent, il est souhaitable de combiner avec optogénétique cytométrie de flux.

À notre connaissance, il n'y a pas de protocole établi pour cytométrie de flux optogenetic. Une méthode largement acceptée consiste à éclairer manuellement les cellules à l'extérieur du tube de réaction avec des dispositifs d'affichage lumineux. Cependant, l'éclairage manuel du débit nécessite cytomètre la lumière de passer à travers le tube de réaction et, pour l'imagerie des cellules vivantes, une forme cylindrique, chambre d'eau chauffée. Cela provoque la diffusion de lumière importante et la perte de lumière. En outre, l'intensité de la lumière fournie par un éclairage manuel est pas reproductible entre les expériences (angle, distance, etc.) et il y a une limite pratique au nombre de longueurs d'onde dans une expérience.

En construisant le dispositif LED Thermo Flow, nous avons pu surmonter ces limitations. Avec ce dispositif, les cellules peuvent être éclairées par des longueurs d'onde spécifiques dans une températurelit- contrôlée de manière pendant les mesures de cytométrie en flux. Cela permet des quantités précises et reproductibles de la lumière à l'intérieur et entre les expériences.

Pour démontrer l'utilité de notre dispositif in vivo, nous avons enregistré le signal de fluorescence de Dronpa dans les cellules B Ramos pendant photocommutation. les cellules B Ramos sont dérivées d'un lymphome de Burkitt humain. Dronpa est une protéine fluorescente qui existe sous forme d'un monomère, dimère ou un tétramère. Dans sa forme monomère, il est non-fluorescent. Illumination avec 400 nm de lumière induit dimérisation et tétramérisation et rend la protéine fluorescente Dronpa. Ce processus peut être inversé par illumination avec 500 nm de lumière. La protéine Dronpa a été utilisé pour contrôler la fonction et la localisation des protéines de signalisation 4,13.

Ici, nous avons exprimé une protéine Dronpa-Linker-Dronpa dans les cellules B Ramos pour étudier photocommutation de Dronpa dans un cytomètre de flux. En utilisant notre dispositif, nous avons pu efficacement etPHOTOSWITCH reproductible Dronpa lors de l'enregistrement de son intensité de fluorescence en temps réel. Cette méthode offre des avantages substantiels par rapport aux protocoles d'éclairage actuels avec éclairage manuel et élargit considérablement le répertoire expérimental pour les outils optogénétiques et des composés de la cage. Grâce à notre dispositif simplifiera considérablement et d'accélérer la découverte et le développement de nouveaux outils de optogénétiques.

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Protocole

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1. Conception et création de l'appareil

  1. Des expériences pilotes
    NOTE: L'intensité lumineuse nécessaire pour un outil et une cellule optogenetic type spécifique peut varier de façon significative. Des expériences pilotes avec des prototypes sont utiles pour estimer l'intensité de la lumière minimale nécessaire. L'outil optogenetic utilisé pour les expériences suivantes est une construction de fusion Dronpa-Lieur-Dronpa. La séquence Dronpa a été obtenu dans le commerce (voir la liste des matériaux). Une longue liaison a été clone entre les deux séquences Dronpa pour permettre la construction exprimée pour former des dimères intramoléculaires (et intermoléculaires). Les étapes décrites ci-dessous peuvent être adaptées à de nombreux autres outils optogénétiques ou des substances optiquement contrôlées.
    1. Transduction des lymphocytes B Ramos avec un contenant construction Dronpa-Linker-Dronpa suivant les instructions du fabricant pour la transduction en utilisant le surnageant retroviral contenant des cellules d'emballage. La récolte et des cellules de comptage en fonction d'un prédemment publié le protocole 13.
    2. Resuspendre les cellules à une concentration de 1 x 10 6 / ml dans du milieu (RPMI 1640, 10% de FCS, 2 mM de L-glutamine inactivé par la chaleur, 100 U / ml de pénicilline, 100 U / ml de streptomycine et 50 pM de 2-mercaptoéthanol) et les transférer dans un tube FACS de verre.
    3. Insérer le tube dans un cytomètre de flux et de mesurer l'intensité de fluorescence de Dronpa (canal de GFP) 14,15.
    4. Porter des lunettes de protection pour toutes les autres mesures pour protéger les yeux des longueurs d'onde éventuellement dommageables.
    5. Placer manuellement un éclairage à LED 500 nm à l'extérieur du tube et continuer à mesurer l'intensité de fluorescence de Dronpa.
    6. Augmenter le nombre et / ou l'intensité des lumières LED jusqu'à Dronpa intensité de fluorescence diminue.
    7. Placer manuellement un éclairage à LED 400 nm à l'extérieur du tube et continuer à mesurer l'intensité de fluorescence de Dronpa.
    8. Augmenter le nombre et / ou l'intensité des lumières LED jusqu'à ce que le fluo Dronparescence intensité augmente.
    9. Utilisez au moins autant de lumières LED pour la construction de l'appareil comme prévu nécessaire du photocommutation dans les étapes 1.1.5 et 1.1.7.
  2. Construire le dispositif
    REMARQUE: L'appareil a été construit par un atelier d'usinage professionnel, le Arbeitsgruppe Technik de l'Université de Fribourg. La plupart des pièces sont fabriquées sur mesure et non disponibles dans le commerce. Les dimensions exactes de chaque pièce sont représentés sur les figures 1 et 2. Pour clarifier l'ensemble de ce dispositif, complémentaire vidéo 1 est fourni et les étapes les plus essentielles sont décrites ci-dessous.
    1. Un broyeur pièce à partir de chlorure de polyvinyle (PVC) , avec les dimensions exactes représentées sur la figure 1A.
    2. Insérez les lumières LED dans les trous percés de la pièce A et sceller chaque trou avec de la colle PVC pour éviter les fuites d'eau.
    3. Connecter les LED à un transformateur multicanal (chaque longueur d'onde doit occuper une chann séparéeel) avec une puissance de sortie réglable 0-29 mA.
    4. Fixer la gaine extérieure (B) avec 3 vis à la pièce A comme représenté pour protéger les LED contre les dommages physiques.
    5. Pour être en mesure de connecter l'appareil à une pompe à eau, de la colle dans les colliers de serrage (C) dans les trous forés de la pièce A (représentée sur la figure 1a, section transversale Y: 9 mm et 61,5 mm) à l' aide de la colle PVC.
    6. Coupez un long tube en plexiglas de 58,5 mm (D1).
    7. Fabriquer des pièces D2 et D3 à partir de Plexiglas comme cela est représenté sur la figure 2.
    8. Pièce de colle D3 au fond de D1 en Plexiglas avec de la colle.
    9. Fixer un joint torique en caoutchouc pour pièce D2 et il colle à la partie supérieure de D1 avec Plexiglas colle.
      NOTE: Les pièces D1, D2 et D3 forment ensemble pièce D.
    10. Insérez la pièce D dans la pièce A avec 3 vis.
    11. Testez le dispositif de fuite d'eau avant la mise sous tension du transformateur.

2. Mesurer la cinétique d'un outil optogénétiques

  1. préparer des cellules
    1. La culture de cellules B Ramos dans le milieu RPMI (RPMI 1640, 10% de FCS, 2 mM de L-glutamine inactivé par la chaleur, 100 U / ml de pénicilline, 100 U / ml de streptomycine et 50 pM de 2-mercaptoéthanol) à une densité de 3- 10 x 10 6 cellules / mL à 37 ° C et 5% de CO 2.
    2. la récolte des cellules B Ramos par centrifugation à 350 x g et 4 ° C pendant 5 min.
    3. Nombre de cellules en utilisant une chambre de comptage de Neubauer en suivant les instructions du fabricant et resuspendre 1-5 x 10 6 cellules dans 600 ul de milieu.
    4. Transférer les cellules dans un tube de FACS de verre, mettez-les sur de la glace et de les protéger de la lumière jusqu'à la mesure.
  2. Préparer le cytomètre de flux et le dispositif.
    1. Connectez l'appareil à une pompe à eau chauffée et régler la température à 37 ° C.
    2. Lors de l'utilisation des tubes FACS de verre, échanger le joint torique noir de la cytométrie de flux avec un joint torique en caoutchouc et appliquer en plus gr de siliciumfacilité.
  3. La mesure
    1. Insérez soigneusement le verre FACS tube dans le dispositif et le connecter à la cytométrie de flux (Figure 3).
    2. Lancer la mesure et enregistrer Dronpa intensité de fluorescence (canal GFP).
    3. Illuminez l'échantillon de cellules avec 400 nm ou 500 nm de lumière, respectivement, et enregistrer l'intensité de fluorescence Dronpa (canal GFP).
  4. L'analyse des données
    1. Analyser les données expérimentales avec un débit approprié cytomètre logiciel. Plot diffusion vers l'avant contre la dispersion et la porte latéralement les cellules vivantes. Tracer l'intensité de fluorescence Dronpa au fil du temps.

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Résultats

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Utilisation de la Thermo flux LED avec un cytomètre de flux

Le noyau fonctionnel du dispositif est une chambre cylindrique dans laquelle les lumières LED sont disposées de manière circulaire pointant vers l'intérieur. Cette chambre peut être reliée à une alimentation et une pompe d'eau, ce qui permet de contrôler la température des diodes électroluminescentes, ainsi que de l'échantillon de cellules. Les DEL sont connectées à un ...

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Discussion

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Le Thermo flux LED est un dispositif innovant pour étudier les outils optogénétiques dans un cytomètre de flux.

Jusqu'à présent, les échantillons optogénétiques ont été illuminée seulement avec des lasers de microscopie ou des dispositifs de lampe de poche 11,12. En fonction de l'angle et la distance de la lampe torche à l'échantillon, la variabilité importante de la quantité d'éclairement est prévu entre les expériences. En outre, il y a une limite au nombre de la...

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Remerciements

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Nous remercions J. Schmidt de l’Université de Fribourg pour la construction de l’appareil. Nous remercions P. Nielsen et D. Medgyesi pour leur soutien et leur lecture critique de ce manuscrit. Cette étude a été soutenue par la Deutsche Forschungsgemeinschaft par le biais de SFB746 et par l’Initiative d’excellence de la Fondation allemande pour la recherche (GSC-4, Spemann Graduate School).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Tube en verre FACSThermo Fisher Scientific ; Waltham, États-Unis14-961-26Tubes en verre borosilicaté 12x75 mm
Cytomètreen flux BD Bioscienceg ; Heidelberg, AllemagneFortessa IICommande spéciale
Dronpa : pcDNA3-mNeptune2-NAddgene ; Cambridge, États-Unis41645
PolyJetSignaGen, Rockville, États-UnisSL100688
LED 505 nmAvago Technologies ; Boeblingen, AllemagneHLMP-CE34-Y1CDD
LED 400 nmAvago Technologies ; Boeblingen, AllemagneUV5TZ-400-15
Tube plexiglas 15 mmMaertin ; Fribourg, Allemagne76999
Plexiglas 3 mmMaertin ; Fribourg, Allemagne692230
Plexiglas 2,5 mmMaertin ; Fribourg, Allemagne692225
Plexiglas 1,5 mmMaertin ; Fribourg, Allemagne692215
dalle PVC 5 mmMaertin ; Fribourg, Allemagne690020.005
Dalle PVC 6 mmMaertin ; Fribourg, Allemagne690020.006
Bloc PVC 50 mmMaertin ; Fribourg, Allemagne690020.050
RPMIInvitrogen, Life Technologies ; Darmstadt, Allemagne61870-010
2-MercaptoethanolEMD ; Allemagne805740
FCSPAN Biotech ; Aidenbach, AllemagneP30-3302
Pénicilline/Strptomycine (10 000 U/mL)Invitrogen, Life Technologies ; Darmstadt, Allemagne15140-122
Colle plexiglas AcrifixEvonic industries, Essen, Allemagne1R0192
Tangit Colle PVC-UHenkel, Dü ; sseldorf, Allemagne

Références

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  2. Tischer, D., Weiner, O. D. Illuminating cell signalling with optogenetic tools. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (8), 551-558 (2014).
  3. Toettcher, J. E., Voigt, C. A., Weiner, O. D., Lim, W. A. The promise of optogenetics in cell biology: interrogating molecular circuits in space and time. Nat Methods. 8 (1), 35-38 (2011).
  4. Zhang, K., Cui, B. Optogenetic control of intracellular signaling pathways. Trends Biotechnol. 33 (2), 92-100 (2015).
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  8. Taslimi, A., et al. An optimized optogenetic clustering tool for probing protein interaction and function. Nat Commun. 5, 4925(2014).
  9. Toettcher, J. E., Gong, D., Lim, W. A., Weiner, O. D. Light-based feedback for controlling intracellular signaling dynamics. Nat Methods. 8 (10), 837-839 (2011).
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Mots-clés

Optogenetics Flow CytometryLED Thermo FlowPhotoswitching KineticsDronpa ProteinsFluorescence IntensityLight IntensityWavelength LEDsFlow Cytometric MeasurementsCell Signaling PathwaysRamos B Lymphocytes

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