Imaging of Cell Forme Altération et Mouvement cellulaire dans Drosophila Gastrulation Utilisation DE-cadhérine Reporter mouches transgéniques

Résumé

Nous décrivons ici une procédure permettant de capturer des images en direct de la gastrulation de la drosophile. Cela nous a permis de mieux comprendre la constriction apicale impliquée dans le développement précoce et d’analyser davantage les mécanismes régissant les mouvements cellulaires lors de la modification de la structure tissulaire.

Résumé

Gastrulation est le premier ensemble d'événements morphologiquement dynamiques qui se produisent pendant le développement embryonnaire des animaux pluricellulaires tels que la drosophile. Cette altération morphologique est également reconnu comme transition épithélio mésenchymateuse (EMT). Dysrégulation de EMT est associée à la fibrose et les métastases du cancer. Il existe des preuves émergentes que EMT est contrôlé par un certain nombre de mécanismes moléculaires. En tant que tels, de nombreux gènes clés qui contrôlent la constriction apicale sont également connus pour être des facteurs importants dans l'OGD observée dans les métastases du cancer. Comme EMT pendant la drosophile gastrulation, les cellules épithéliales peuvent être amenés à changer leur forme et être reprogrammées pour rediriger le destin des cellules vers d'autres types de cellules. Ici , nous fournissons une méthode d'imagerie robuste de Drosophila gastrulation pour doser l'initiation des mouvements cellulaires morphogénétiques et l' identification du destin cellulaire au cours de ce stade de développement embryonnaire. En utilisant cette méthode, nous identifions cell réarrangement au moment de la gastrulation et de démontrer l'importance de la constriction apicale pendant la gastrulation utilisant GFP marquées DE-cadhérine.

Introduction

Gastrulation est le premier ensemble d'événements morphologiquement dynamiques qui se produisent au cours du développement embryonnaire des animaux pluricellulaires tels que la drosophile ^1,2. Il est intéressant de nouvelles preuves suggèrent que ce processus est régi par l'interaction entre les mécanismes mécaniques et moléculaires ^3. En outre, la transition épithélio - mésenchymateuse (EMT), qui est un processus crucial dans la gastrulation, est également impliquée dans des processus pathologiques humains tels que les métastases du cancer ^8/4. En tant que tels, de nombreux gènes qui contrôlent la constriction apicale sont également connus pour être des facteurs clés dans l'OGD observée dans les métastases du cancer ^9. Ainsi, constriction apicale au moment de la gastrulation est un excellent modèle pour étudier les mécanismes de régulation précités et d'améliorer notre compréhension des métastases du cancer. L'avantage de cette technique est que nous pouvons observer le mouvement des cellules au moment de la gastrulation en temps réel et, par conséquent, nous seronsen mesure de dépister les gènes impliqués dans la gastrulation, ainsi que les métastases du cancer.

Bien que relativement inconnu, l' adhésion de cellule à cellule est pensé pour jouer un rôle central dans la constriction apicale ^1. Génétique de la Drosophile est bien adapté pour les enquêtes individuelles au niveau cellulaire explorant les mécanismes moléculaires de régulation. Ce modèle nous permettra de découvrir l'importance de la constriction apicale pendant la gastrulation. En outre, cette méthode peut être utilisée pour cribler des gènes impliqués dans la métastase du cancer. Capture d' images en direct de la drosophile gastrulation nous a en outre permis de comprendre plus en détail les mécanismes moléculaires qui régissent le réarrangement des tissus. Ici, nous fournissons une description complète d'une méthode simple pour y parvenir.

Protocole

NOTE: Les mouches transgéniques utilisées dans cette étude sont les suivants: DE-cad :: GFP ^10.

1. Préparation d'Apple Plate

1. Préparer un mélange de 12,5 g d' agar, 125 mL 100% disponible dans le commerce de jus de pomme, 12,5 g de glucose et 375 ml H ₂ O. Chauffer le mélange dans un micro - ondes et versez - le dans une boîte de culture de cellules de 3 cm. Stocker le mélange à 4 ° C pour une utilisation future.
2. Après la préparation de la plaque de pomme, ajouter une fine couche de pâte malaxée de levure au-dessus de celui-ci pour permettre aux mouches de jeter l'œuf.

2. Embryon Préparation et direct Protocole d'imagerie

1. Placez environ 50 mouches (25 mâles et 25 femelles) dans une bouteille pour accoupler et ensuite pondre des œufs durant la nuit sur une plaque de pomme couverte dans la levure malaxée. Placer la plaque de jus de pomme à l'embouchure de la bouteille. Gardez la bouteille à l'envers dans un incubateur. Envelopper les bouteilles en plastique Drosophila d'actions avec une feuille d'aluminium pour inciter ee vole à pondre plus d'œufs.
2. Le lendemain matin, remplacer l'ancienne plaque de jus de pomme avec un nouveau.
3. Que les mouches pondent des œufs pendant 3 à 4 h en enveloppant la bouteille avec du papier d'aluminium.
4. Trois à quatre heures plus tard, de recueillir les embryons dans une passoire à l'embryon de la plaque de jus de pomme à l'aide d'une brosse ou de coton mauvais et les laver avec du PBS. Laver les embryons de 2 à 3 fois plus avec PBS dans des boîtes de culture de 12 puits.
5. Dechorionate les embryons avec 50% de javel pendant 5 min dans des boîtes de culture de 12 puits.
6. Après le processus de dechorionation, laver les embryons de 2 à 3 fois plus avec PBS.
7. Transférer les embryons dans une boîte de culture cellulaire 3 cm contenant du PBS et sélectionnez l'étape 5 embryons au microscope sur la base du niveau de transparence à leurs frontières. Pipeter les embryons mis en scène à l'aide d'une pipette de 200 pi.
8. Ensuite, placez deux embryons sélectionnés sur une lamelle de verre, et éliminer l'excès de PBS avec du papier de soie finement torsadée. Orientez les embryons côté dorsal surla lamelle en utilisant un papier de soie finement torsadée. Après cela, fixer les embryons à la lamelle de verre avec de la graisse de silicium en utilisant une aiguille fine et du papier de soie torsadée.
9. Ajouter une petite goutte d'huile d'halocarbures 700 sur les embryons et placer la lamelle contenant les embryons à l'envers sur la lame dentelée, en laissant un peu d'espace au bas de la diapositive.
10. Examiner les embryons en utilisant un système d'imagerie confocale, une Argon / 488 laser, et un objectif à immersion (63X).
    NOTE: Identification de l'embryon au stade de développement approprié est important de capturer des images de l'événement gastrulation. Dans ces conditions, observent presque tous les embryons se développent normalement au moins jusqu'à l'étape 14. L'embryon analysé peut être cultivé à développer davantage comme un adulte.

Résultats

Ici, nous montrons les événements gastrulation de l'embryon de drosophile et un aperçu général de la procédure de préparation de l' embryon (Figure 1). Les membranes cellulaires sont marquées en utilisant le document DE-cadhérine :: GFP et l' imagerie en temps réel des mouvements de cellules est effectuée au moment de la gastrulation chez la drosophile (figure 2). Depuis DE-cadhérine GFP mouches nous permettent de visualiser les jonctions d'adhé...

Discussion

Bien que nous ayons déjà rapporté une procédure similaire pour capturer des images en direct du processus de gastrulation chez Drosophilla¹, la méthode que nous décrivons ici est détaillée et facile à retracer l’expression endogène de la cadhérine et est donc très utile pour le dépistage génétique des facteurs clés impliqués dans la gastrulation. Pour maximiser le succès de cette procédure d’imagerie, il est essentiel d’utiliser une lame en retrait. La pression mécanique provoque parfois la mort embry...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Huile halocarbure 700	Sigma	MKBH 5726
Graisse sous vide Silicone	Beckman	335148
Lamelle en verre  ;	Verre Matsunami	Epaisseur No1	24 - 36 mm
Embryo stariner	Corning	Corning3477
Bouteilles en plastique Drosophilla Stock Bottles	Hitec	MKC-100
DE-Cadherin knock-in mouches			REF (10)