Article de méthode

Extension nanostructurées Substrats utilisant la technique de point pour Nanotopographical Modulation of Cell Comportement

DOI :

10.3791/54840

⸱

8 décembre 2016

 ,  , 
1Department of Chemical and Biomedical Engineering, West Virginia University, 2Department of Biomedical Engineering, Columbia University

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Un protocole pour produire une grande surface de substrat nanopatterned à partir de petits moules nanopatterned pour l’étude de la modulation nanotopographique du comportement cellulaire est présenté.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La nanotopographie du substrat s’est avérée être un puissant modulateur du phénotype et de la fonction cellulaires. Pour disséquer la modulation du comportement cellulaire par nanotopographie, une grande surface de substrat nanopatterned est souhaitable afin que suffisamment de cellules puissent être cultivées sur la nanotopographie pour des analyses biochimiques et de biologie moléculaire ultérieures. Cependant, les techniques actuelles de nanofabrication ont des limites pour générer des nanomotifs hautement définis sur une grande surface. Ici, nous présentons une méthode pour étendre des substrats nanopatterned d’un petit nanomotif hautement défini à une grande surface en utilisant la technique du point. La méthode combine plusieurs techniques, impliquant la lithographie douce pour reproduire des moules en poly(diméthylsiloxane) (PDMS) à partir d’un moule bien défini, la technique de couture pour assembler plusieurs moules PDMS en un seul grand moule et la nano-impression pour générer un moule maître sur des substrats en polystyrène (PS). Avec le moule maître PS, nous produisons des substrats de travail PDMS et démontrons la modulation nanotopographique de l’étalement cellulaire. Cette méthode offre une voie simple, abordable mais polyvalente pour générer des nanomotifs bien définis sur de grandes surfaces, et est potentiellement étendue pour créer des dispositifs à l’échelle micro/nanométrique avec des composants hybrides.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Un certain nombre de découvertes récentes révèlent que la nanotopographie du substrat a une influence prononcée sur le comportement cellulaire, de l’adhésion, de l’étalement et de la migration cellulaires, à la prolifération et à la différenciation1-6. Par exemple, une taille cellulaire plus petite et un taux de prolifération plus faible ont été observés dans les cellules cultivées sur des nanoréseaux profonds, conduisant même à l’apoptose, bien que l’alignement, l’élongation et la migration cellulaires aient été améliorés, par rapport aux témoins plats2,7-10. De plus, il a été démontré que la nanotopographie facilite la différenciation des cellules souches en certaines lignées telles que le neurone2,11,12, le muscle13 et l’os3,4. De plus, en raison des préoccupations croissantes concernant la toxicité des nanomatériaux manufacturés14,15, il est nécessaire d’intégrer la nanotopographie dans des modèles in vitro physiologiquement pertinents pour une évaluation précise des risques des nanomatériaux. Pour réaliser les analyses biochimiques et de biologie moléculaire, il faut suffisamment de cellules pour être cultivées sur une grande surface de substrat nanopattern. Cependant, les techniques de nanofabrication conventionnelles ont des limites pour générer des nanomotifs hautement définis sur une grande surface.

L’auto-assemblage, y compris la lithographie colloïdale16 et le démélange des polymères17, peut facilement générer des nanostructures de grande surface à faible coût. Parce que l’auto-assemblage repose sur les interactions entre les éléments d’assemblage tels que les particules colloïdales et les macromolécules, et les interactions possibles entre ces éléments et le substrat, il ne peut pas s’agir d’une méthode autonome de production de nanostructures avec un positionnement spatial précis et des formes arbitraires18. La forte densité de défauts qui l’accompagne est également un inconvénient. Un contrôle spatial précis des nanomotifs peut être obtenu en utilisant l’auto-assemblage de modèles, qui utilise des approches lithographiques descendantes pour fournir le modèle topographique et/ou chimique pour guider l’assemblage ascendant des éléments d’assemblage19-21. D’autres techniques de nanofabrication, telles que la lithographie par étapes et flash22 et la lithographie par nanoimpression rouleau à rouleau23, ont été mises au point, mais leur utilisation est limitée en raison de leur processus sophistiqué ou de la nécessité d’un équipement spécialisé. Néanmoins, un modèle ou un moule maître avec des motifs à l’échelle nanométrique définis est nécessaire pour les techniques de nanofabrication modélisées ou alternatives.

De tels modèles et moules maîtres sont générés conventionnellement en utilisant la lithographie focalisée par faisceau d’électrons, d’ions ou de photons. Par exemple, la lithographie par faisceau d’électrons (EBL)24 et la lithographie par faisceau d’ionsfocalisés25 peuvent générer des motifs définis avec une résolution inférieure à 5 nm. La lithographie à deux photons a démontré une taille de caractéristique aussi petite que 30 nm26. Bien que les techniques de lithographie par faisceau focalisé permettent de générer des structures bien définies à l’échelle nanométrique, l’investissement en capital et le processus long et coûteux limitent leur utilisation généralisée dans la recherche universitaire27. Par conséquent, il est hautement souhaitable de développer des techniques permettant mais abordables de produire une grande surface de surfaces nanostructurées avec une haute fidélité.

Nous avons signalé une technique de couture simple et rentable pour générer une grande surface de surface nanostructurée à partir d’un petit moule bien défini28. Ce protocole fournit une procédure étape par étape, de la réplication de moules en poly(diméthylsiloxane) (PDMS) à l’aide d’un modèle écrit par EBL, à l’assemblage de plusieurs moules PDMS en un seul grand moule, à la génération d’un moule maître sur des substrats polymères tels que le polystyrène (PS), à la production de substrats de travail. Avec les substrats nanopatterned expansés, nous avons démontré la modulation nanotopographique de l’étalement cellulaire.

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Protocole

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. La réplication de PDMS Moisissures à partir d'un moule EBL

  1. Fabriquez moule en silicone 29
    1. couche d'essorage 200 ul de polyméthacrylate de méthyle (PMMA) sur un substrat une solution de 1 x 1 cm de silicium (Si) à 2500 tours par minute pendant 1 min pour former un film mince.
    2. Cuire le film de PMMA sur le substrat de silicium à 180 ° C pendant 2 min.
    3. Écrivez le nanopattern conçu sur le film de PMMA en utilisant un faisceau d'électrons focalisé à une dose de surface de 300 uC / cm 2.
    4. Développer le nanopattern PMMA dans le révélateur pour 80 sec.
    5. Déposer le nanopattern PMMA avec une couche de nickel de 50 nm d'épaisseur en utilisant un évaporateur à faisceau d'électrons à une tension de sortie de 10 kV, le courant d'émission de 0,5 mA et une vitesse de 0,5 nm / s ou de dépôt.
    6. Soulevez la partie PMMA dans 20 ml solvant à 80 ° C pendant 20 min.
    7. gravure ionique réactive (RIE) la nanopattern dans le substrat en Si pour obtenir un moule en Si de la profondeur désirée.
      NOTE: Mélange de gaz de tetrafluoromethane (CF 4) / oxygène (O 2) (90% / 10%) à un plasma à couplage inductif (ICP) , puissance de 400 W de puissance et de RIE de 150 W est utilisée pour graver le substrat de Si à une profondeur de 560 nm.
  2. Silaniser Si moule
    1. Mettez une lamelle de verre et le moule Si dans une boîte de 100 mm PS Petri et les transférer dans un dessiccateur en verre situé dans une hotte.
    2. Déposer 10 ul 1H, 1H, 2H, 2H-Perfluorooctyltrichlorosilane sur la lamelle.
      Attention: 1H, 1H, 2H, 2H-Perfluorooctyltrichlorosilane peut provoquer la corrosion de la peau et des lésions oculaires graves. Porter un équipement de protection individuelle (EPI).
    3. Couvrir la boîte de Pétri partiellement.
    4. Gardez le dessiccateur sous vide pendant 5 heures dans une hotte pour compléter la silanisation du moule Si.
  3. Préparer PDMS prépolymère
    1. Peser 10 g de résine de PDMS et 1,05 g agent de durcissement dans une nacelle de pesée jetable.
    2. Mélanger le prépolymère PDMS soigneusement à l'aide d'une cuillère en plastique.
    3. Dégazer le prépolymère PDMS dans un dessiccateur en plastique sous vide pendant environ 20 minutes jusqu'à ce qu'un mélange limpide est observée.
  4. Répliquer moules PDMS
    1. Mettre le moule Si silanisé dans une boîte de Pétri de 60 mm.
    2. Verser le prépolymère PDMS sur le moule Si dans la boîte de Pétri.
    3. Placez la boîte de Petri dans un dessiccateur et dégazer en plastique pendant environ 10 min jusqu'à ce que toutes les bulles disparaissent.
    4. Transférer la boîte de Petri vers une plaque chauffante et durcir le prépolymère PDMS à 70 ° C pendant 4 heures.
    5. Décoller le moule PDMS du moule Si soigneusement à l'aide d'une pince à épiler.
      REMARQUE: Les moules en PDMS peuvent être stockés dans des conditions ambiantes pendant jusqu'à une semaine. Après le durcissement, il existe des molécules de résine PDMS non réticulé et un agent de durcissement résiduel dans les moules 30 PDMS. Les molécules de faible poids moléculaire va progressivement diffuser vers l'extérieur et s'accumuler à la surface au cours du temps. Ceci affecte les propriétés topographiques et mécaniques de la surface du PDMS 31. La diffusion est non significatif dans la semaine.

2. Brochage de PDMS Moisissures dans un Grand, Mold Simple

  1. Préparer plusieurs PDMS moules en répétant l'étape 1.4.
    NOTE: Peser même quantité de mélange PDMS à chaque fois pour obtenir des moules PDMS de même épaisseur.
  2. Déterminer l'orientation de anisotropes PDMS nanoschémas tels que nanogratings sous un microscope optique et le marquer sur la face arrière des moules PDMS avec un stylo marqueur.
    NOTE: Il est nécessaire de marquer l'orientation de nanotopographie isotrope tels que nanopiliers.
  3. Nettoyer un substrat en Si avec de l'éthanol dans une hotte et le sécher à l'air comprimé.
  4. Coupez les zones sans motif de chaque moule PDMS avec une lame.
    NOTE: Pour les moules PDMS qui seront placés à la périphérie du moule cousu, seules les zones sans motif en contact avec d'autres doivent être coupés au large.
  5. Placer le moule PDMS garni de la nanopattern face vers le bas surdu côté du miroir du substrat Si et ensuite aligner d'autres moules à proximité de mais ne touchant pas le moule (s) entourant.
  6. Préparer une couche adhésive PDMS
    1. Cast 1 g dégazé PDMS prépolymère (résine PDMS et le durcissement de rapport de l'agent: 10: 1,05) sur une lame de verre propre (7,5 cm x 2,5 cm) pour former une couche épaisse de 0,5 mm.
    2. Cuire la couche de PDMS à 100 ° C sur une plaque chauffante pendant 3 à 5 min. Utiliser une aiguille de toucher la couche et veiller à ce que la couche est partiellement mais pas complètement guéri.
      NOTE: PDMS partiellement durci ne peut pas circuler comme non vulcanisé PDMS prépolymère, mais il est collant par rapport aux PDMS durcis.
  7. Placez la couche PDMS à l'arrière de alignés PDMS moules et inverser rapidement cette assemblée et le transférer sur la plaque chauffante.
  8. Appliquer une force de compression (5 kPa) en utilisant un bloc de métal sur le dessus de l'assemblage afin d'assurer un bon contact entre la couche adhésive PDMS et le côté arrière du moule PDMS et durcir PDMS couche d'adhésif à 100 ° C pendant 1 h.
    NOTE: Ajustez soigneusement la position du bloc de métal pour éviter l'inclinaison de l'ensemble.
  9. Retirez le bloc de métal et de décoller l'unique, cousu moule PDMS du substrat Si.

3. Génération d'un moule maître sur PS Substrats

Remarque: Le moule PDMS cousu immobilisé sur une lame de verre peut être utilisé pour générer un moule maître sur une plaque de PS ou un film mince PS, à partir de laquelle travaillent des substrats nanostructurés peuvent être produits.

  1. Générer un moule maître sur une plaque PS
    1. Préparer une plaque PS
      1. Sécher les pastilles PS dans une étuve sous vide à 80 ° C pendant deux jours.
      2. Préchauffer une machine de presse à 230 ° C.
      3. Assembler une plaque d'aluminium, un polytétrafluoroéthylène (PTFE) feuille et l'entretoise en aluminium dans un ordre de bas en haut.
      4. Charger 3,5 g de pastilles PS dans l'entretoise en aluminium avec une ouverture carrée de 3 cm (L) x 3 cm (W) x 0,3 cm (H).
        NOTE: L'entretoise est d'environ 0.1 cm plus épais que les PDMS moules, et donc le substrat nanostructuré PS finale est d'environ 0,1 cm d'épaisseur.
      5. Placez une autre feuille de PTFE puis une autre plaque d'aluminium sur l'entretoise en aluminium.
      6. Placer l'ensemble dans la machine de presse.
      7. Préchauffer les pastilles PS à 230 ° C pendant 30 min.
      8. Appliquer une pression de compression (0,1 MPa) sur l'ensemble pendant 5 min.
      9. Relâchez la pression, puis réappliquer une pression de compression de 0,5 MPa sur l'assemblage.
      10. Répétez l'étape 3.1.1.9 avec une augmentation de pression de 0,5 MPa jusqu'à ce que la pression souhaitable de 1,5 MPa soit atteinte.
      11. Eteignez le chauffage de la machine de la presse et le refroidir en dessous de 70 ° C à une pression constante de 1,5 MPa.
      12. Prenez l'assemblage hors et stocker la plaque de PS dans un four à vide à 80 ° C pour empêcher l'humidité de revenir dans la plaque PS.
    2. Nanoimpression le moule PDMS cousu dans la plaque de PS
      1. Placer la plaque PS dans une entretoise en aluminiummettre sur un 3 pouces Si wafer.
        REMARQUE: Les dimensions intérieures de la pièce d'écartement sont les mêmes que celles de la plaque PS de sorte que la plaque PS correspond à droite dans l'entretoise.
      2. Chauffer la plaque PS sur une plaque chauffante à 250 ° C pendant 30 min.
      3. Mettez le moule PDMS cousu avec nanoschémas face vers le bas sur la plaque PS fondu.
        REMARQUE: L'un des côtés du moule PDMS est mis en contact avec la surface de la plaque PS premier et un autre côté est abaissée progressivement en contact avec la surface PS pour éviter la formation de bulles d'air à l'interface.
        Attention: La surface de la plaque de cuisson est chaude. Porter thermogloves pendant le processus de nanoimpression.
      4. Placez une plaque d'aluminium sur la lame de verre du moule PDMS cousu.
      5. Appliquer une pression de compression (12,5 kPa) en utilisant des blocs de métal sur la plaque d'aluminium et attendre 3 min.
        REMARQUE: Assurez-vous que la plaque d'aluminium est pas incliné.
      6. Soulevez et remplacer le bloc de métal à partir de la plaque d'aluminium et iUGMENTATION la pression de compression à 25 kPa.
      7. Répétez l'étape 3.1.2.6 avec la pression augmentée à 50 kPa.
        REMARQUE: Cette étape est d'enlever l'air emprisonné entre le moule PDMS et la plaque PS.
      8. Maintenir la température de la plaque chauffante entre 240 et 250 ° C sous la pression constante de 50 kPa pendant 15 minutes.
      9. Éteignez la plaque chauffante et refroidir l'ensemble de l'installation.
        REMARQUE: Un ventilateur peut être utilisé pour accélérer le processus de refroidissement.
      10. Retirez les blocs métalliques après que la température est inférieure à 50 ° C, et soigneusement décoller le moule PDMS cousue de la plaque PS.
        NOTE: Le substrat de PS a les nanoschémas inverse et peut être utilisé comme un moule maître pour produire de travail PDMS substrats.
  2. Générer un moule maître sur un film mince PS
    1. Préparer un film mince PS
      1. Dissoudre 1 g de PS dans 10 ml de toluène dans une hotte.
        Attention: Toluène peut causer irritatio de la peaun et des lésions oculaires graves, et peuvent causer des lésions aux organes à une exposition prolongée ou répétée. Porter des EPI appropriés.
      2. Spin-coat solution de PS 1 ml sur un 2-en plaquette à 2500 rpm pendant 1 min pour former ~ 1 um d'épaisseur PS film mince.
      3. Toluène s'évaporer du film en réglant le film PS sur une tranche de Si dans une hotte pendant 3 jours.
      4. Recuire le film mince PS dans une étuve sous vide à 80 ° C pendant une nuit.
    2. Nanoimpression le moule PDMS sur un film mince PS
      1. Mettez le moule PDMS cousu avec nanotopographie face vers le bas sur le film mince PS, qui est fixé sur une plaque chauffante.
      2. Appliquer une pression de compression de 12 kPa, sur le moule PDMS en utilisant des blocs de métal sur le côté de verre du moule PDMS.
      3. Augmenter la température de la plaque chauffante à 180 ° C et la maintenir pendant 15 min.
        Attention: Le film de PS en fusion peut fonctionner en tant que lubrifiant. Faites attention à éviter les blocs métalliques de glisser.
      4. Éteignez la plaqueet refroidir l'ensemble de l'installation.
        REMARQUE: Un ventilateur peut être utilisé pour accélérer le processus de refroidissement.
      5. Retirer les blocs métalliques après que la température descend en dessous de 50 ° C et soigneusement décoller le moule PDMS cousue à partir du film PS.
        NOTE: Le film nanostructuré PS servira de moule maître pour produire des substrats de travail PDMS.

4. Nanotopographical Modulation of Cell Comportement

Remarque: les cellules épithéliales humaines sont cultivées sur les nanotopographies représentatives pour démontrer la modulation nanotopographical de la cellule d'étalement.

  1. Cast substrats de travail PDMS du moule maître généré soit de l'étape 3.1 ou 3.2 en fonction de l'application.
  2. L' utilisation d' un creux arc en acier punch, couper les PDMS nanostructurées substrats en disques pour adapter la configuration d'une plaque multi-puits spécifique (plaque par exemple, 24 puits).
  3. Utilisez des pinces pour placer les disques PDMS dans les puits ofa plaque multi-puits.
  4. Stériliser les substrats PDMS à l'aide d'éthanol à 70%, puis exposition aux UV, chacun pendant 30 minutes.
  5. Laver les PDMS substrats avec 1x phosphate stérile saline tamponnée (PBS) à trois reprises.
  6. Revêtir les substrats avec des PDMS de matrice extracellulaire protéique ( par exemple, 20 pg / ml de fibronectine) pendant 30 min à température ambiante.
  7. Rincer les PDMS substrats trois fois avec du PBS stérile, chacun pendant 5 min.
  8. Suspendre le cancer du poumon cellules A549 humaines dans un milieu Eagle modifié par Dulbecco avec 10% de sérum de veau fœtal et compter les cellules en utilisant un hémocytomètre.
  9. Plaquer les cellules à une densité d'ensemencement de 2.000 cellules / cm2 sur les substrats et la culture PDMS eux à 37 ° C dans une atmosphère humidifiée contenant 5% de CO 2 pendant une journée.
  10. Laver les cellules avec du PBS trois fois.
  11. Fixer les cellules dans un mélange de paraformaldehyde à 4% et 2% de glutaraldéhyde dans du PBS pendant 4 h et déshydrater les cellules en utilisant un groupe CO 2 PO critiqueint sèche pour balayer l' observation microscopique électronique 29.
    Attention: paraformaldéhyde et le glutaraldéhyde peuvent causer de graves brûlures de la peau et des lésions oculaires. Opérer dans une hotte chimique et porter des EPI appropriés.

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Résultats

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La technique de point peut générer une grande surface de substrats nanostructurés avec une grande fidélité. Figure 1a et 1b afficher la grande surface de nanoschémas transférés du moule PDMS cousu à la plaque PS et PS film mince sur un substrat Si, respectivement. La comparaison entre le moule original EBL-écrite (Figure 1c) et les PDMS finaux travaillant substrat (Figure 1d) confirme que les nanoschémas EBL-écrites peuv...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous présentons une méthode simple, abordable et polyvalent pour générer une grande surface du substrat nanostructuré. Pour développer fidèlement nanoschémas hautement définis, une grande attention doit être accordée à plusieurs étapes critiques. La première est de couper les PDMS moules multiples. les zones sans motif du moule PDMS doivent être enlevés. En outre, les parois latérales des moules doivent être coupés à la verticale aussi parfaite que possible afin de minimiser les écarts entre les moules. Collectivement, ...

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Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce travail a été en partie soutenu par NSF CBET 1227766, NSF CBET 1511759 et Byars-Tarnay Endowment. Nous reconnaissons avec gratitude l’utilisation des installations de recherche partagées de l’Université de Virginie-Occidentale qui sont soutenues, en partie, par NSF EPS-1003907.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Émission de champ JEOL SEMJEOLJSM-7600FEBL
E-BEAM E-évaporateurKurt J. LeskerModèle : LAB 18 e-beam e-vaporatornickel deposition
Trion Minilock III ICP/RIETriontechnology Modèle : Minilock-phantom III
PressePHI Presse hydraulique Molde : SQ-230H
Spin coaterLaurell TechnologiesModèle : WS-400A-6NPP-LITE
CO2 séchoir critiqueTousimisModèle : Autosamdri-815
Plaquette de siliciumUniversity Wafer1080
Plaques d’aluminiumMcMaster-carr9057K123
Feuilles de téflonMcMaster-carr8711K92
100 mm Boîte de PétriFALCON
Boîte de Pétri 60 mmFALCON353004
Lamelle en verreFisher Scientific12-542-B
Lame en verreFisher Scientific12-550-34
Bateaux de pesée jetablesFisher Scientific13-735-743
Dessiccateur en verreFisher Scientific02-913-360
Dessiccateur en plastiqueBel-Art ProductsF42025-000
Plaque chauffanteFisher Scientific1110049SH
Pince à épilerTed Pella, inc.5726
BladeFisher ScientificS17302
Blocs métalliquesMcMaster-carr
PunchBrettuns Village Leather Craft SuppliesArch punch
Poly(méthacrylate de méthyle)MicroChem495 PMMA A4
PDMSDow CorningSylgard 184 kit
PolystyrèneDow ChemicalStyron 685D
1H,1H,2H,2H-perfluorooctylméthyldichlorosilaneOakwood Chemical7142
DéveloppeurMicroChemMIBK/IPA à rapport
DécapantMicroChemRemover PG
ÉthanolFisher ScientificBP2818500
ToluèneFisher ScientificT324-500
Saline tamponnée au phosphateSigma AldrichD8537
Dulbecco' s aigle modifié moyenSigma AldrichD5796
Sérum fœtal bovinAtlanta BiologicalsS11550
ParaformaldéhydeMicrosopie électronique Science15712-S
Glutaraldéhyde  ;Fisher ChemicalG151-1
FibronectineCorning356008
cellules A549ATCCATCC CCL-185
3530031 : 3

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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