ADSC-feuille Transplantation à prévenir Rétrécissement après oesophagienne prolongée Endoscopic dissection sous-muqueuse

Résumé

Cette étude rapporte une méthode efficace de la cellule adipeuse endoscopiques dérivée du tissu stromal (ADSC) feuillet transplantation pour la prévention de la sténose oesophagienne après une dissection étendue endoscopique sous-muqueuse (ESD) dans un modèle porcin.

Résumé

Au cours des dernières années, la cellule-feuille construction a suscité un grand intérêt dans la médecine régénérative, notamment pour les procédures de chirurgie reconstructive. Le développement des technologies diversifiées, combinant des cellules stromales dérivées de tissu adipeux (ADSCs) avec diverses biomatériaux a conduit à la construction de nombreux types de substituts du génie tissulaire, tels que les os, le cartilage et les tissus adipeux de rongeurs, porcine ou ADSCs humaines. dissection prolongée oesophagienne endoscopique sous-muqueuse (ESD) est responsable de la formation de sténose de l'œsophage. la prévention des Rétrécissement reste difficile, sans traitements efficaces disponibles. Des études antérieures ont rapporté l'efficacité de la muqueuse cellulaire feuilles transplantation dans un modèle canin et chez les humains. ADSCs sont attribuées des propriétés anti-inflammatoires, des effets immunitaires locales de modulation, néovascularisation induction, et les capacités de différenciation en mésenchymateuses et lignées non-mésenchymateuses. Cette étude originale décrit la tra endoscopiquensplantation d'une construction de génie tissulaire ADSC pour empêcher sténose de l'œsophage dans un modèle porcin. La construction ADSC est composée de deux feuilles ADSC allogéniques en couches les unes sur les autres sur une membrane de support en papier. Les ADSCs ont été marqués avec le fluorophore PKH67 pour permettre endomicroscopie laser confocale à base de sonde (pCLE) suivi. Le jour de la transplantation, à 5 cm et une ESD hémi-circulaire connu pour induire œsophage a été réalisée. Les animaux ont été immédiatement transplantées par voie endoscopique avec 4 constructions ADSC. L'adhérence complète des constructions ADSC a été obtenu après 10 min d'application douce. Les animaux ont été sacrifiés au jour 28. Tous les animaux ont été transplantés avec succès. Transplantation a été confirmée le jour 3 avec une évaluation de pCLE positive. Par rapport aux animaux transplantés, les animaux témoins ont développé des sténoses sévères, avec grand développement du tissu fibrotique, trouble alimentaire plus fréquent, et le gain de poids réduit. Dans notre modèle, la transplantation de allogenic ADSCs, organisés en feuilles doubles de cellules, après ESD prolongée a réussi et fortement associée à un taux de sténose de l'œsophage inférieur.

Introduction

La gestion des tumeurs œsophagiennes superficielles a changé avec le développement de nouvelles techniques endoscopiques. De nos jours, la résection endoscopique est le traitement de première ligne. En effet, elle est associée à la morbidité et de mortalité inférieurs à ceux d' une chirurgie avec des résultats oncologiques égaux ^{1, 2, 3.} La résection endoscopique de la muqueuse (EMR) et muqueux résection endoscopique (ESD) sont les techniques les plus couramment utilisés. Dans le cas d'une tumeur superficielle étendue, l'EDD est préférable. Par rapport à EMR, ESD permet en bloc résection, indépendamment de la taille de la lésion et de la forme ^{4, 5, 6.} La principale complication tardive de l'EDD est la formation de sténose de l'œsophage, ce qui se produit généralement entre une et deux semaines après la résection. Des études récentes publiées ont montré que la formation de sténose est corrélée à lataille de la résection. La Endoscopic Société japonaise recommande d'éviter l'EDD taille est supérieure à ¾ de la circonférence de l'œsophage, car ils sont associés au développement de sténoses dans plus de 90% des cas et sont responsables de troubles alimentaires graves et la détérioration importante de la qualité de vie.

La prévention de la sténose de l'œsophage reste difficile. Mécanismes impliqués dans la formation de sténoses ne sont que partiellement connus. Rétrécissement formations semble résulter de l'association de deux mécanismes différents: (1) le recrutement cellulaire pro-inflammatoire et (2) le développement excessif de la fibrose ^7. Plusieurs traitements préventifs ont été proposés. Cependant, les résultats ne sont pas satisfaisants, avec peu d' avantages et d' effets secondaires graves , ^{8, 9.} Récemment, une équipe japonaise, Ohki et al. , A proposé de transplanter une feuille cellulaire à une seule couche de cellules de la muqueuse orale autologues dans le Esophcicatrice ageal. La transplantation a été effectuée immédiatement après ESD ^{10, 11.} Ils ont démontré l'efficacité de cette approche novatrice, d'abord dans un modèle canin, puis chez les patients.

cellules adipeuses dérivées de tissu stromales (ADSCs) sont prometteurs en médecine régénérative. Leur application dans plusieurs domaines, a donné des résultats intéressants, notamment dans le processus de cicatrisation. Thérapie ADSC offre plusieurs avantages, car les cellules sont facilement isolés et sont associés à des propriétés anti-inflammatoires, des effets immunomodulateurs locaux, néovascularisation induction et capacités de différenciation en lignées mésenchymateuses et non mésenchymateuses ^{12, 13, 14.}

Dans une précédente étude, notre équipe a démontré l'efficacité de la double ADSC-feuille endoscopique transplantation pour prev sténose oesophagienneention après ESD prolongée dans un modèle porcin ^15. Dans cet article, les rapports de construction ADSC-feuille et technique de transplantation endoscopiques sont présentés.

Protocole

Tous les animaux ont été traités selon le Comité d'éthique de la recherche animale (Lignes directrices du ministère français de l'Agriculture). Le protocole a reçu l'approbation du comité d'éthique local autorisé pour les expérimentations animales à l'Université Paris Descartes (numéro enregistré MESR 2035,02; Faculté de médecine Paris Descartes, Paris, France).

1. ADSC Culture et étiquetage

1. Obtenir ADSCs confirmés auprès d'une institution privée. Culture ADSCs allogéniques à 37 ° C et 5% de CO ₂ avec du milieu essentiel minimum alpha dont 10% de sérum de veau foetal et 1% d' antibiotiques (pénicilline et streptomycine).
2. Obtenir environ 24 x 10 ⁶ ADSCs par animal en utilisant des procédés d'expansion cellulaire standard (37 ° C et 5% CO _2). Récolter les ADSCs en utilisant une solution de trypsine standard (10 ml pour un plat de T150). Effectuer le comptage des cellules avec un hémocytomètre.
3. Effectuer étiqueter le jour avant la transplantation en utilisant la pr PKH67 de coloration cellulaireocedure décrit ci-dessous.
   NOTE: Le but de la procédure de marquage est de permettre le suivi des cellules après la transplantation.
   1. Afin de marquer 2 x 10 ⁶ ADSCs, préparer la solution A (2 x 10 ⁶ cellules avec 100 pi de diluant C) , et la solution B (4 pi de PKH67 avec 1 ml de solvant C).
   2. Incuber solutions A et B pendant 2 min. Ensuite, ajouter 100 ul de sérum de veau foetal pendant 1 min.
   3. Rincer la solution avec 300 ul de RPMI citraté (298,5 pi de RPMI et 1,5 pl de citrate) et centrifuger à 1500 g pendant 5 min. Répéter cette opération 2 fois. Maintenir les cellules marquées et de les protéger de la lumière jusqu'à la construction de la feuille.

2. Double ADSC-feuille Construct

1. Le jour avant la transplantation, préparer un plat de 12 puits de culture cellulaire sensible à la température avec 4 ml par puits du milieu de culture cellulaire, décrits ci-dessus, avant PKH-étiquetage. Graine le plat avec 1,5 x 10 ⁶ PKH-labelecellules d par puits et incuber pendant 12 h (37 ° C et 5% de CO _2).
2. Le jour de la transplantation, détacher la feuille de cellules confluentes par incubation de la cuvette à la température ambiante pendant 30 min.
3. Aspirer doucement une feuille de ADSC avec une pipette et la couche sur un papier hydrophobe (1,5 cm de diamètre). Utilisez ce document comme une membrane de support.
4. Saisir une autre feuille de ADSC et déposer délicatement sur le dessus de l'autre pour obtenir une construction à double couche.
5. Répétez ces procédures pour obtenir autant de constructions ADSC feuilles selon les besoins (4 par animal).

3. oesophagien Endoscopic dissection sous-muqueuse (ESD)

1. Le jour de la transplantation, de pré-traiter avec des médicaments les animaux avec 10 mg / kg de kétamine par voie intramusculaire et les amener à 8 mg / kg de propofol par voie intraveineuse. Ensuite, effectuez l'intubation endotrachéale et maintenir l'anesthésie avec de l'isoflurane 2,5% inhalation.
2. Une fois que l'animal est sous anesthésie générale, effectuer des décharges électrostatiques avec un gastroscope, un vidéoscope, et une unité d'électrochirurgie.
   1. Utilisez un couteau endoscopique et la coagulation douce pour obtenir des marques dorsales hémi-circonférentielle allant de 40 cm à 45 cm de l'arcade dentaire.
   2. Injecter une solution de glycérol contenant de l'indigo carmin de colorant dans la couche sous-muqueuse pour la séparation de la couche muqueuse de la couche musculaire.
   3. Utilisez un couteau endoscopique avec le mode endocut I pour obtenir des incisions circonférentielles.
   4. Utilisez un couteau endoscopique avec le mode de coagulation forcée pour effectuer la dissection sous-muqueuse, le déplacement de l'incision proximale à l'incision distale.
3. A la fin de la procédure d'ESD, observer la hémi-circonférentielle, 5 cm de long cicatrice oesophagien exposition de la couche musculaire.

4. Endoscopic Transplantation

1. Immédiatement après l'ESD, transplanter endoscopically animaux avec 4 doubles constructions ADSC-feuille.
   1. Attrapez une construction ADSC-feuille avec pince endoscopique etprotéger pendant le transport vers le site de la plaie à l'aide d'un grand bonnet endoscopique, transparent.
   2. Appliquer toute la surface de l'ADSC-feuille construit sur le lit de l'ulcère.
   3. Appliquez doucement la ADSC feuilles construction pendant 10 min pour obtenir une greffe complète et stable. Pour l'application, l'utilisation de pinces endoscopiques ou un capuchon endoscopique et appliquer toute la surface de l'ADSC construire sur la couche sous-muqueuse oesophagienne.
2. Répétez cette procédure quatre fois pour chaque animal afin d'obtenir quatre doubles constructions cellule de feuille transplantées et adhérentes.
   NOTE: L'objectif est de couvrir approximativement la moitié de la zone blessée.

5. postopératoires Évaluation et suivi

1. Pour chaque animal, assurer une analgésie-ESD après l'injection intramusculaire de 0,2 mg / kg de morphine trois fois par jour pour le premier jour et avec un traitement anti-acide de 28 jours de l'ésoméprazole (40 mg / jour). Effectuer une prophylaxie antibiotique avec amoxicilldans (1 g / jour) pendant 7 jours. Autorisez liquides le jour 1 et solides sur le jour suivant.
2. Suivi avec les animaux pendant 28 jours. Obtenir des évaluations cliniques quotidiennes en utilisant Mellow Pinkas dysphagie scores ¹⁶ et des mesures de variation de poids.
3. évaluation des sténoses Multimodal: sous anesthésie générale, les jours programmés 3, 14 et 28, procéder à une évaluation multimodale des sténoses événement.
   1. Effectuer une évaluation endoscopique en utilisant la description de la cicatrice, la mesure du rétrécissement, et le support de papier de détection de la membrane. Mesurer la sténose en utilisant le gastroscope à traverser le rétrécissement (le diamètre du gastroscope est de 8 mm). Observer la cicatrice, en accordant une attention à l'aspect inflammatoire (érythème des muqueuses, œdème de la muqueuse et la muqueuse des saignements spontanés) et l'absence ou la présence de la membrane du support papier au sein de la cicatrice.
   2. Appliquer pCLE sonde verte à travers le canal opérateur de gastroscope directement dans le lit de cicatrice. Rechercher un spontanéeet organisé signal vert compatible avec PKH67 marqué ADSC feuilles construction greffe.
   3. Effectuer 2 incidences orthogonales de baryte œsophagographie avec un cerceau radiologique (avant et l'incidence du côté gauche). Gardez le plus serré incidence pour l' évaluation des sténoses (degré de sténose (%) = [1- (longueur de l'axe court sous une sténose / longueur de l'axe normal dans la sténose) x 100)]) ^{17, 18.}
4. Les sacrifices d'animaux.
   1. Au jour 28, à la fin de la période de suivi, effectuer le sacrifice animal. Alors que l'animal est toujours sous anesthésie générale, injecter 100 mg / kg de phénobarbital par voie intraveineuse. Veiller à la mort des animaux en utilisant l'examen clinique de l'absence d'un rythme cardiaque et de la respiration mouvement.
   2. Après une exposition de sternotomie et orgue, enlever l'oesophage de chaque sacrifié l'animal (avec 10% de la fixation de la formaline tamponnée, inclusion dans la paraffine, et les articles 4 um d'épaisseur). Colorer les lamesavec hématoxyline et Saffron ^15. Numériser les diapositives de l' analyse informatisée et de comparer les groupes d'animaux ^15.

Résultats

La culture de ADSCs et la procédure pour obtenir la feuille de ADSC est représentée sur la figure 1. La figure 2 montre la construction de la greffe, composé de deux feuilles ADSC en couches les unes sur les autres sur leur membrane support papier. ADSCs ont déjà été marqués avec le fluorophore PKH67 pour permettre la surveillance de la greffe in vivo avec pCLE. La figure 3 montre les différentes étapes d'extension ...

Discussion

Dans ce modèle de porc, la transplantation ADSC-feuille était techniquement réussie, et l'évaluation in vivo de pCLE permis pour la surveillance de la greffe de cellules. Des évaluations cliniques, endoscopiques, radiologiques et histologiques ont démontré l'efficacité de la feuille de ADSC endoscopique à la prévention de la sténose oesophagienne après ESD prolongée.

La transplantation endoscopique d'une solution ADSC de glycérol contenant une feuille carmin de teinture ...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Capuchon endoscopique transparent compatible Q180 Olympus	Optical Co
GIF-Q180 gastroscope  ;	Olympus Optical Co
Système de vidéoscope Exera II  ;	Olympus Optical Co
Aiguille d’injection 18 G	Olympus Optical Co
Unité d’électrochirurgie ERBE ICC 350  ;	ERBE Technology
Indigo carmin 1 %	Life
Couteau hybride endoscopique	Life
Minisonde Z pCLE green probe	Mauna Kea Technology		Vous devez apprendre à utiliser la sonde. La manipulation pourrait être difficile.
Sérum fœtal bovin	Sigma Aldrich	12105C
Trypsine	Sigma Aldrich	T146
Alpha minimum essentiel	milieu Thermo Fisher	22561-021
Salines tamponnées au phosphate	Thermo Fisher	10010-023
PKH67 kit de colorant	Sigma Aldrich	Mini67-KT
Cellule sensible à la température 12 puits boîte de culture	Upcell Thermo Scientific	174900	Sentir le sol avec 4 mL de culture moyenne standard 30 min avant l’ensemencement des cellules
Ésoméprazole 40 mg  ;	Biogaran
Moprhine sulfate 50 mg/mL	Lavoisier
Amoxicilline 1 g	Biogaran
Kétamine 250 mg/5 mL	Panpharma
Propofol 10 mg/mL	Fresenius
Papier hydrophobe	Carrefour