Xenopus Ovocytes: Méthodes optimisées pour microinjection, suppression des couches de cellules folliculaires, et les changements de solution rapide dans les expériences électrophysiologiques

Summary

Des procédures optimisées pour l’isolement des follicules uniques, les micro-injections d’ARN cytoplasmique, l’élimination des couches cellulaires environnantes et l’expression des protéines dans les ovocytes de xénope sont décrites. En outre, une méthode simple pour des changements rapides de solution dans des expériences électrophysiologiques avec des canaux ioniques ligand-dépendants est présentée.

Abstract

L'ovocyte de Xenopus comme un système d'expression hétérologue des protéines, a été décrite par Gurdon et al. ¹ et a été largement utilisé depuis sa découverte (Références 2 - 3, et les références qui y sont). Une caractéristique qui rend l'ovocyte attrayant pour l' expression de chaîne étrangère est la faible abondance de canaux ioniques endogènes ^4. Ce système d'expression se sont révélées utiles pour la caractérisation de nombreuses protéines, parmi lesquelles des canaux ioniques ligand-dépendants.

L'expression des récepteurs GABA _A dans les ovocytes de Xenopus et de leur caractérisation fonctionnelle est décrite ici, y compris l'isolement d'ovocytes, des microinjections de l' ARNc, l'enlèvement des couches de cellules folliculaires, et les changements rapides de solutions dans des expériences électrophysiologiques. Les procédures ont été optimisés dans ce laboratoire ^5,6 et dévient de ceux couramment utilisés ^7-9. Traditionnellement, les ovocytes dénudés sont préparésavec un traitement prolongé de la collagénase des lobes d'ovaire à la température ambiante, et ces ovocytes dénudés sont microinjecté avec l'ARNm. En utilisant les procédés optimisés, des protéines membranaires diverses ont été exprimées et étudié avec ce système, tels que les récepteurs recombinants GABA _A ^10-12, les canaux chlorure humains recombinants ^13, trypanosomes canaux de potassium ¹⁴ et un transporteur de myo - inositol ^{15, 16.}

Les méthodes décrites ici peuvent être appliquées à l'expression d'une protéine de choix dans les ovocytes de Xenopus, et le changement rapide de la solution peut être utilisée pour étudier d' autres canaux ioniques ligand-dépendants.

Introduction

Des ovocytes de Xenopus sont largement utilisés en tant que système d'expression (références 2 - 3, et les références qui s'y trouvent ). Ils sont capables d'assembler et d'intégrer des protéines fonctionnellement actives dans unités multiples leurs membranes plasmiques correctement. En utilisant ce système, il est possible d'étudier les protéines de membrane fonctionnelle seules ou en combinaison avec d'autres protéines, en vue d'étudier les propriétés de la ou des protéines chimères, des mutants concaténés, et pour cribler des médicaments potentiels.

Avantages de l'utilisation d'ovocytes sur les autres systèmes d'expression hétérologues comprennent la manipulation simple des cellules géantes, la forte proportion de cellules exprimant l'information génétique étrangère, le simple contrôle de l'environnement de l'ovocyte au moyen d'un bain de perfusion, et le contrôle du potentiel de membrane .

L'inconvénient de ce système d'expression est la variation saisonnière observée dans de nombreux laboratoires ^17-20. La raison de cette variationest loin d'être clair. En outre, la qualité des ovocytes est souvent observée pour faire varier fortement. Les méthodes traditionnelles ^7-9 ont inclus l'isolement des lobes de l' ovaire, l'exposition des lobes de l' ovaire à la collagénase pendant un certain h, la sélection des ovocytes dénudés, et la microinjection ovocytaire. Ici, un certain nombre de procédures, rapides alternatives sont rapportées qui nous ont permis de travailler avec ce système d'expression depuis plus de 30 ans, sans variation saisonnière et peu de variation dans la qualité de l'ovocyte.

Les procédés modifiés et améliorés décrits ici pour l'isolement d'ovocytes, la micro - injection de l' ARNc et l' enlèvement des couches de cellules folliculaires peuvent être utilisés pour l'expression d'une protéine de choix dans l'ovocyte de Xenopus. La méthode très simple pour les changements de solution rapide du milieu autour de l'ovocyte peut être appliqué à l'étude d'un canal ionique ligand-dépendant et des supports.

Protocol

Les expérimentations animales ont été approuvés par le comité local du canton de Berne Kantonstierarzt, Kantonaler Veterinärdienst Berne (BE85 / 15).

1. Préparation des oocytes de Xenopus

1. Maintenir grenouilles (Xenopus laevis) sur 12 h / 12 h cycle lumière / obscurité dans l' eau qui est strictement maintenue à 20 ° C.
2. Supprimer les lobes des ovaires de grenouilles femelles ^9.
   REMARQUE: La suppression des lobes est un stimulus pour la régénération, et souvent la qualité des ovocytes améliore la chirurgie. L'ovocyte est recouvert d'une couche vitelline, une couche de cellules folliculaires et le tissu conjonctif contenant des vaisseaux sanguins ^21. La structure entière est appelée le "follicule."
3. Placer les lobes des ovaires qui sont très denses avec les follicules contenant les ovocytes dans une solution saline stérile ⁷ Barth (MBS) supplémenté avec de la pénicilline et de la streptomycine (88 mM de NaCl, 1 mM de KCl, 2,4 mMNaHCO _3, 0,82 mM de _MgSO4, 0,41 mM de _CaCl2, Ca 0,33 mM (NO _{3) 2,} 10 mM d' acide 4- (2-hydroxyéthyl) -1-piperazineethanesulfonic; HEPES (pH 7,5, NaOH), 100 ug / ml de pénicilline et 100 pg / ml de streptomycine).
4. Simple étage-out V-VI ²¹ follicules. Tenez le lobe de l'ovaire avec une pince. Abaisser la boucle de platine (figure 1) sur les follicules et retirer doucement la boucle de perturber le tissu conjonctif contenant le follicule du tissu ovarien.
   NOTE: Etape V-VI ²¹ follicules sont caractérisés par leur taille (1,0 - 1,2 mm de diamètre) et par le bon contraste entre le noir pigmenté hémisphère animal et l'hémisphère végétatif jaunâtre.
5. Transférer seulement follicules sains prospectifs (ie parfaitement sphériques et avec pigmentation intacte) à un diamètre boîte de Pétri de 35 mm au moyen d'une pipette en plastique de Pasteur (couper le dos à un diamètre d'ouverture de 1,5 mm).

2. Microinjection d'ARNm dans le cytoplasme

Remarque: Le système de microinjection décrit ici est dérivé de celui rapporté par Kressmann et Birnstiel ^22.

1. Préparer ARNc à partir des ADNc codant respectivement pour les sous - unités de l'α ₄ β ₂ δ du récepteur GABAA par transcription in vitro, l'addition d'un poly (A ⁺⁾ de queue, et la quantification de l' ARN par électrophorèse sur gel ^23.
2. Préparer pipettes microinjection des capillaires en borosilicate de verre (1,0 mm de diamètre extérieur (OD), 0,58 mm de diamètre interne (ID), longueur de 100 mm) à l'aide d'un extracteur de micropipette. Casser les pointes des capillaires en verre au microscope en utilisant un micromanipulateur et microfilaments pour créer un diamètre de 12 pointe - 15 um avec une pointe biseautée.
3. Remblayer les pipettes microinjection avec de l'huile de paraffine en utilisant une seringue de 10 ml, puis monter la pipette de microinjection sur un micr de homebuiltAppareil de oinjection (figure 2).
   NOTE: L'appareil d'injection d'huile hydraulique de fabrication artisanale se compose d'un moteur à grille commandée par un interrupteur à pédale. Un commutateur supplémentaire modifie le mode de fonctionnement du moteur tournant. Ce moteur entraîne une vis micrométrique (0,5 mm / tour) qui avance et se rétracte le piston d'une seringue en verre de 10 pi. L'injection est à une vitesse d'environ 3 tours par minute et un virage à 0,5 correspond à une injection de 50 nL dans un follicule. L'embout de la seringue est relié à un tube de polytétrafluoréthylène à paroi épaisse qui est lui-même relié à l'aiguille d'injection par un très court morceau de tube Tygon. Le capillaire d'injection est maintenue par un mandrin de perçage qui est contrôlée par un micromanipulateur. L'ensemble du système est rempli d'huile de paraffine. Les bulles d'air doivent être évités, car ils altèrent le système d'injection. La configuration est éclairée par une source de lumière froide. Un stéréomicroscope est nécessaire pour un contrôle optique. Follicules sont visualisés sous lumière froide avec un stereomicroscope (40X). Le rendement de l'installation d'injection est testée par injection de traceur radioactif dans des ovocytes de Xenopus. Un volume de 45 - 55 nL doit être livré par injection.
4. En utilisant une pipette avec un embout en plastique stérile, tester la configuration en plaçant une goutte d'eau stérile sur l'intérieur propre d'un matériau thermoplastique résistant à l'humidité (2 x 2 cm). Immerger la pointe de la pipette d'injection dans cette goutte, puis tourner le moteur pour rétracter le piston (de pression négative à l'intérieur de la pipette d'injection).
   REMARQUE: L'eau doit entrer dans la pipette et former une interface visible à l'huile.
5. Rentrez la pointe de la pipette de la gouttelette et appliquer une pression positive à l'intérieur de la pipette d'injection. Une goutte d'eau doit se former à la pointe de la pipette d'injection.
6. Préparer pour l'injection des follicules en les alignant avec les pôles végétaux orientée vers le haut dans les interstices d'un filet de nylon (G: 0,8 mm) collées au fond d'un PeAntenne tri (60 mm) recouvert de MBS.
7. Distribuer 2 pl de l'ARNm en utilisant une pipette avec un embout en plastique stérile sur l'intérieur propre d'un thermoplastique. Prendre l'ARNm dans la pipette d'injection en appliquant une pression négative à l'intérieur de la pipette d'injection.
8. Placez la pipette d'injection sur un follicule individuel à l'aide du micromanipulateur.
9. Insérer l'aiguille d'injection dans le centre du pôle végétal et d'injecter 50 nL d'ARNm à un débit de 0,6 ul / min en appliquant une pression positive à l'intérieur de la pipette. Attendre 5 - 10 s avant de retirer la pointe de la pipette d'injection à partir du follicule pour éviter l'ARNm évasion.
   NOTE: L'ARNm doit être injecté dans le végétal polaire (jaune) afin d'éviter l'injection dans le noyau, qui est situé dans l'hémisphère animal.
10. Transférer les follicules injectés à une nouvelle boîte de Pétri (35 mm) remplie de 2 ml de MBS. Placer le plat dans un refroidisseur de vin fixé à 18 ° C. Incuber les follicules injecté pendant 1 -7 jours avant l'enregistrement, en fonction de l'identité de la protéine nouvellement exprimée.

3. Décapage des follicules (Figure 3)

Remarque: Comme indiqué plus haut, l'ovocyte recouverte par une couche vitelline, les cellules de follicules, et du tissu conjonctif, qui contient les vaisseaux sanguins ^24, est connu comme un «follicule». Toutes les couches à l'exception de la couche vitelline, ce qui assure une stabilité mécanique sans empêcher l'accès des solutions à la surface cellulaire, doivent être enlevés avant les expériences électrophysiologiques. Le follicule sans les couches de cellules environnantes a été précédemment appelé un ovocyte "dénudé" ^25. Cette étape est généralement réalisée le même jour que les expériences électrophysiologiques.

1. Transfert des follicules dix injecté dans un tube en verre de borosilicate contenant 0,5 ml de MBS, 1 mg / ml de collagénase et 0,1 mg / ml d'inhibiteur de trypsine. Immerger le tube dans un bain d'eau maintenu à 36 ° C. incuber lafollicules pour 20 min et se serrent les tubes de temps en temps.
2. Rincer les follicules en les transférant dans un second tube contenant 1 ml de MBS à TA. Laissez-les dans le tube pendant environ 10 s.
3. Transférer les follicules à un troisième tube contenant 0,5 ml de MBS doublement concentrées contenant 4 mM d' éthylène glycol-bis (2-aminoéthyléther) - N, N, N ', N'- tétraacétique (EGTA) et les incuber pendant 4 min à TA. Agiter le tube de temps en temps.
   REMARQUE: La solution hypertonique (MBS doublement concentré) est utilisé pour induire le retrait des ovocytes à l'intérieur des couches de cellules de follicules, en détachant ainsi les couches de cellules folliculaires de l'ovocyte; EGTA est ajouté pour inhiber l'activité de la collagénase.
4. Rincer les follicules en les transférant dans un second tube contenant 1 ml de MBS à TA. Laissez-les dans le tube pendant environ 10 s.
5. Transférer les ovocytes à une boîte de Pétri (diamètre 35 mm) contenant 2 ml de MBS. En vertu d'un stéréomicroscope, séparer les enveloppes extérieures des follicules parpoussant simplement l'ovocyte nue loin en utilisant la boucle de platine.
   REMARQUE: Les enveloppes extérieures des ovocytes collent fermement à la boîte de culture et peuvent être facilement séparés des ovocytes. Certains ovocytes spontanément perdre leurs enveloppes extérieures et seront récupérés comme ovocytes dénudés. Ce procédé aboutit à une préparation relativement stable qui garde l'aspect sphérique des ovocytes.

4. Solution rapide changement dans l'ovocyte

1. Effectuer une expérience de serrage de tension, comme décrit ^9,26.
2. Modifier la résolution du système de perfusion alimenté par gravité en tournant les commutateurs de perfusion tel que requis par l'expérience.
   1. Appliquer la solution de perfusion à 6 ml / min à travers un capillaire de verre avec un diamètre intérieur de 1,35 mm, dont l'embouchure est placée à environ 0,4 mm de la surface de l'ovocyte, pour permettre des changements rapides de la concentration d'agoniste autour de l'ovocyte.
      NOTE: Le taux de variation a été précédemment estimationd jusqu'à 70% en moins de 0,5 s ^27.

Results

Des ovocytes de Xenopus ont été mécaniquement distingués en utilisant une boucle de platine (figure 1). Les ovocytes ont été micro - injectés avec de l' ARNm codant pour le récepteur GABA _A - unités de récepteur alpha _{4, ß2,} δ, 0,5: 0,5: 2,5 fmol / ovocyte (figure 2). Après 4 d, des couches de cellules folliculaires ont été retirées (figure 3). Les ovocytes ont été tension serrées à -80 mV et exp...

Discussion

Les méthodes décrites dans cet article diffèrent de celles utilisées traditionnellement ^7-9. Il est classique d'exposer les lobes de l'ovaire a 1 à 2 heures de traitement par la collagénase ^8; isoler en bon état, ovocytes dénudés; et les injecter avec de l'ARNm en utilisant des dispositifs d'injection commerciaux. Cette procédure classique présente les inconvénients suivants: 1) Les ovocytes sont susceptibles d'être endommagés par l'exposition prolongée à des concentrations ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
NaCl	Sigma	71380
KCl	Sigma	P-9541
NaHCO3	Sigma	S6014
MgSO4  ;	Sigma	M-1880
CaCl2  ;	Sigma	223560
Ca(NO3)2  ;	Sigma	C1396
HEPES	Sigma	H3375
Péniciline/streptomycine	Gibco	15140-148	100 &mu ; g de pénicilline/mL et 100 &mu ; g streptomycine/mL
Boucle de fil de platine Extracteur	fait
	Zeitz-Instruments GmBH	DMZ
Seringue Hamilton  ;	Hamilton	80300	10 &mu ; L, Type 701N
Tube en polytétrafluoroéthylène à paroi épaisse	Labmarket GmBH		1,0 mm OD  ;
Huile de paraffine	Sigma	18512
Filet en nylon, G : 0,8 mm  ;	ZBF Zü ; plus riche Beuteltuchfabrik AG
Tube en verre borosilicaté  ;	Corning	99445-12	PYREX
Collagénase NB Standard Grade	SERVA	17454
Inhibiteur de trypsine type I-S	Sigma	T-9003
EGTA	Sigma	E3389
Capillaire en verre	Jencons (Scientific) LTD.	H15/10	1,35 ID mm (pour la perfusion), société alternative : Harvard Apparatus Limited
Capillaire en verre borosilicaté	Harvard Apparatus Limited	30-0019	1,0 OD x  ; 0,58 ID x 100 Longueur mm (pour la microinjection)  ;
Capillaire en verre borosilicaté  ;	Harvard Apparatus Limited	30-0044	1,2 OD x 0,69 ID x 100 Longueur mm (pour pince de tension à deux électrodes)
&gamma ;-Acide aminobutyrique (GABA)	Sigma	A2129
3&alpha ;,21-Dihydroxy-5&alpha ;-pregnan-20-one (THDOC)	Sigma	P2016
moteur de gril	Faulhaber  ;		Micromoteur à courant continu Type 2230 avec engrenage Type 22/2
vis micrométrique	Kiener-Wittlin	10400	TESA, AR 02.11201
Pipettes de transfert stériles en plastique	Saint-Amand  ; Mfg.	222-20S