Intracarotidienne Cancer Cell Injection pour produire des modèles de souris de Brain Métastase

Résumé

métastases cérébrales est devenu un besoin médical non satisfait urgent que son incidence a augmenté tandis que les options thérapeutiques sont restés palliatifs. La création de modèles animaux expérimentaux de métastases cérébrales par injection artérielle intracarotidienne des cellules cancéreuses facilite les études mécanistiques de la biologie de la maladie et l' évaluation de nouveaux schémas d'intervention.

Résumé

Les métastases, la prolifération et la croissance des cellules malignes à des sites secondaires à l'intérieur du corps d'un patient, représente> 90% de la mortalité liée au cancer. Récemment, des progrès impressionnants dans les nouvelles thérapies ont considérablement prolongé la survie et l'amélioration de la qualité de vie de nombreux patients atteints de cancer. Malheureusement, l'incidence du cerveau récurrences métastatiques est en augmentation rapide, et toutes les thérapies actuelles ne sont que des palliatifs. Par conséquent, de bons modèles animaux expérimentaux sont nécessaires de toute urgence pour faciliter les études approfondies de la biologie de la maladie et d'évaluer de nouveaux schémas thérapeutiques pour l'évaluation préclinique. Cependant, la norme dans le dosage des métastases in vivo via une injection dans la veine caudale des cellules cancéreuses produit principalement des lésions métastasiques du poumon; animaux succombent généralement à la charge de la tumeur du poumon avant toute excroissance significative des métastases cérébrales. l'injection intracardiaque de cellules tumorales produit des lésions métastatiques à des sites multiples organes, y compris le cerveau; cependant, le variabilité de la croissance tumorale produite avec ce modèle est grand, freinant son utilité dans l'évaluation de l'efficacité thérapeutique. Pour générer des modèles animaux fiables et cohérentes pour l' étude du cerveau de métastases, ici , nous décrivons une procédure pour la production expérimentale des métastases du cerveau dans la maison de souris (Mus musculus) par injection intracarotidienne des cellules tumorales. Cette approche permet de produire un grand nombre de cerveau des souris métastase porteurs ayant des caractéristiques de croissance et de mortalité similaires, facilitant ainsi les efforts de recherche pour étudier les mécanismes biologiques de base et d'évaluer de nouveaux agents thérapeutiques.

Introduction

La métastase du cancer du système nerveux central (SNC) est une maladie dévastatrice, et peut impliquer soit le parenchyme cérébral ou les méninges ( «métastases cérébrales» désigne à la fois dans cet article). Il est la tumeur maligne intracrânienne prédominante, dépassant les gliomes primaires par> 10: 1 ^{1, 2.} Le cancer du poumon, le cancer du sein et le mélanome sont les trois principales maladies néoplasiques principales qui produisent une forte incidence de métastases cérébrales ^{3, 4.} Au cours des dernières années, des progrès impressionnants dans de nouvelles thérapies contre le cancer ont considérablement prolongé la survie et l'amélioration de la qualité de vie de nombreux patients atteints de cancer. Cependant, lors de la récurrence, l'incidence des métastases cérébrales augmente rapidement. Par exemple, le trastuzumab anticorps anti-HER2 (Herceptin) a démontré une efficacité clinique significative chez les patients atteints HER2 cancer du sein; encore une tendance inquiétante est apparuechez ces patients: jusqu'à 1/3 de ceux dont la maladie systémique extracrânien initialement bénéficié d' un traitement de trastuzumab plus tard développer des métastases cérébrales ^{5, 6, 7.} Malheureusement, les patients atteints de métastases cérébrales sont réfractaires à presque tous les traitements actuels, connaît généralement une détérioration traumatique de la qualité de vie et leur survie à un an après le diagnostic est seulement ~ 20% ^8. Les thérapies actuelles pour des métastases cérébrales (y compris des stéroïdes, la radiothérapie crânienne, et la résection chirurgicale chez des patients sélectionnés) sont palliatifs simplement, non curatif ^9. Par conséquent, des métastases cérébrales est en train de devenir le prochain imposant défi en cette ère de nouvelles thérapies contre le cancer. Pour relever le défi non satisfaits des patients sont confrontés chaque jour à la clinique, il est urgent de mieux comprendre le mécanisme sous-jacent de métastases cérébrales et utiliser ces connaissances pour développer de nouvelles thérapies.

colonisation réussie du cerveau par des cellules cancéreuses métastatiques nécessite des performances d'une série de fonctions médiées par l'interaction complexe de plusieurs joueurs biologiques, tels que le by-pass de la barrière hémato-encéphalique (BBB) ​​et d'échapper à partir du cerveau de intrinsèque des mécanismes de défense immunitaire ^10, aucune d' entre elles est récapitulée dans une ex vivo ou in vitro. système Par conséquent, bon et fidèle des modèles in vivo sont critiques pour les études de métastases cérébrales. Un essai classique dans les métastases in vivo des cellules cancéreuses introduit par injection dans la veine caudale, ce qui entraîne la majorité des cellules à se loger dans les poumons. Lésions métastatiques cérébrales sont rarement produites dans ces modèles avant la mort animale causée par la charge tumorale dans les poumons ^11. injection intracérébrale directe des cellules cancéreuses de la tumeur produit excroissance constante dans le système nerveux central et est largement utilisé dans les études de gliomes primaires. Cependant, sinjection uch compromet la BHE et provoque des lésions traumatiques au niveau du site d'injection, les deux principaux points de préoccupation quant à la pertinence physiologique de ce modèle. Une autre cellule cancéreuse l'introduction voie fréquemment utilisé, l'injection intracardiaque, est facile à administrer et ne produit métastase expérimentale au SNC. Cependant, les métastases simultanées vers des sites d'organes autres que le SNC sont toujours produites et peuvent causer la mortalité des animaux ^11; par conséquent, le degré élevé de variabilité de ce modèle, il est inapproprié pour l'évaluation quantitative des mécanismes biologiques ou d'agents thérapeutiques avec un nombre limité d'animaux.

Nous décrivons ici les procédures pour produire expérimentale des métastases cérébrales via l'injection de cellules cancéreuses dans l'artère carotide commune. Nous avons utilisé cette approche pour disséquer les contributions des gènes individuels à la cascade métastatique des métastases cérébrales et d'évaluer l'efficacité d'une intervention thérapeutiques ^{12, 13.} Les principaux avantages de cette approche sont le degré élevé de reproductibilité et de faible degré de variabilité; l'inconvénient majeur est la sophistication et de la dextérité nécessaire pour réaliser la microchirurgie.

Protocole

déclaration éthique: Toutes les études animales ont été approuvées par le Comité institutionnel des animaux soin et l'utilisation (IACUC) de l'Université du Texas MD Anderson Cancer Center.

1. Préparation de cellules cancéreuses pour injection

1. Ensemencer les cellules cancéreuses d'un ou deux jours avant l'injection. Utilisez DMEM / F12 supplémenté avec 10% de FBS, à moins qu'un moyen de spécialité est indiqué dans la littérature pour une lignée cellulaire particulière.
2. Le jour de l'opération chirurgicale, les cellules de la récolte quand ils atteignent 70-80% de confluence par un premier lavage avec un milieu sans sérum une fois avant trypsinisation (0,25%) pendant 1 - 2 min à 37 ° C. Ajouter dans les cellules de 10% de FBS contenant du milieu DMEM / F12 pour étancher la trypsine à 0,25%.
3. Centrifuger les cellules à 80 × g pendant 3 min. Laver les cellules dans un milieu sans sérum deux fois pour éliminer le sérum résiduel, compter les cellules avec un hémocytomètre et remettre en suspension dans une solution saline équilibrée de Hank (HBSS) à 1 - 5 x 10 ⁶ cellules / ml, en fonction de la lignée cellulaire. Gardez sur la glacejusqu'au moment de l'injection.
   REMARQUE: MDA-MB-231 cellules de cancer du sein et des cellules de mélanome K1735 ont été utilisés dans cette étude, et les deux lignées cellulaires ont été utilisées à 2 x 10 ⁶ cellules / ml de concentration. Gardez la durée de trypsinisation aussi courte que possible que surtraitement peut influencer les résultats des tests de métastases.

2. Préparer les souris pour cellules tumorales Injection

1. Anesthetize souris par voie intrapéritonéale (ip) injection de kétamine / xylazine cocktail (kétamine 100 mg / kg, xylazine 10 mg / kg).
2. Confirmer anesthésie complète en pinçant les pieds des animaux et observer l'absence de réponse.
3. Placez la souris sur une plaque de verre (utilisé pour la coulée de gels de protéines), et fixer avec des bandes de caoutchouc.
4. Si nécessaire, enlever les poils du cou par le rasage ou en appliquant une petite quantité de produit d'épilation et essuyer les cheveux avec une serviette en papier. NOTE: Si vous utilisez la souris nude, sauter cette étape car ils ne possèdent pas les poils du corps.
5. Nettoyer la peau du cou en appliquantpovidone-iode et 70% d'alcool.
6. Placer la souris sur platine du microscope à dissection
7. Faire une incision dans la peau ~ 1 cm de long avec un scalpel chirurgical.
8. Carrément disséquer le muscle avec une pince à dents pour exposer l'artère carotide en dessous.
9. Séparer l'artère carotide du nerf pneumogastrique adjacente avec des pinces chirurgicales.
10. En utilisant des pinces chirurgicales, séparer un peu de coton à partir d'une boule de coton, humidifier, et de la mode dans une boule de coton plus petit. Placez cette boule de coton tampon humidifié sous l'artère carotide du site prévu de l'injection.
11. Placez une extrémité distale de suture et à proximité de la boule de coton et faire des noeuds lâches. Serrez le noeud proximal pour bloquer le flux sanguin dans le site d'injection.
12. Passez à l'injection des cellules cancéreuses si l'artère carotide sur la boule de coton apparaît totalement sous pression avec du sang rouge frais.

3. Cancer cellulaire injection dans l'artère carotide

1. Vortex et d'en tirer 100 pi oles cellules cancéreuses f dans la seringue.
2. Sous le microscope de dissection, insérez lentement le G aiguille 31 (avec biseau vers le haut) dans la lumière de l'artère carotide assis sur le dessus de la boule de coton.
3. injecter lentement les cellules de la seringue dans l'artère carotide. injection réussie peut être observée au microscope par la couleur changeante des vaisseaux sanguins à proximité et la musculature lorsque les cellules cancéreuses tamponnées sont poussés dans la circulation.
4. Lors de l'injection de la totalité du volume est terminée, lever l'artère carotide distale doucement pour éviter la régurgitation.
5. serrez rapidement le noeud distal pour terminer le processus d'injection.
6. Après avoir terminé l'injection, serrer les ligatures et couper la suture de soie en excès avec des micro-ciseaux sous le microscope de dissection. Reculer le muscle séparé pour couvrir le site de la plaie. Fermer la peau avec deux agrafes.

4. Récupération chirurgicale

1. Déplacer l'animal opéré sur un coussin chauffantpour la récupération. Il peut prendre 30 - 60 min pour que les animaux reprennent conscience. En attendant, administrer la buprénorphine (0,05 mg / kg) par injection sous - cutanée comme l' analgésie post-chirurgicale. Remarque: L'analgésie doit être fourni en fonction de votre IACUC locale protocole approuvé.
2. Une fois que les animaux se réveillent et reprennent leur comportement normal, retourner les souris à l'emplacement de leur logement. Fournir des souris avec de la nourriture de gel pendant plusieurs jours après la chirurgie. Tenir un registre chirurgical et le garder dans la chambre.

5. Non-invasive imagerie in vivo

1. Pour les cellules marquées avec des constructions rapporteurs luciférase, mesurer l' efficacité des cellules cancéreuses d'injection in vivo en utilisant le système d'imagerie ^14.
   REMARQUE: L'imagerie est pas effectuée le jour de l'injection pour éviter des contraintes excessives aux animaux de recherche.

Résultats

Il y a deux points où la qualité de l'injection peut être évaluée. La première occasion est par l'observation de l'opérateur de changer les couleurs des vaisseaux sanguins lors de l'injection. Fuites d'injections pauvres peut être facilement observé sous le microscope de dissection. Le placement stable et sécurisé du corps de la souris (figure 1A) et son artère carotide (figure 1B) sur la boule de coton de soutien sont des facteurs cr...

Discussion

Les étapes les plus critiques pour l'injection artérielle carotidienne réussie de cellules cancéreuses sont: 1) une anesthésie profonde de la souris en vue d'une opération chirurgicale; 2) mise en place régulière de l'artère carotide au-dessus du support de coton; 3) la ligature serrée de l'artère carotide après l'injection réussie.

anesthésie profonde de ~ 30 min est généralement nécessaire pour une performance chirurgicale régulière sous le microscope de dissection. Nou...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Solution de chlorhydrate de kétamine/chlorhydrate de xylazine	Sigma-Aldrich	K113
Stéréomicroscope de routine Leica M50	Leica	M50	Le microscope est modulaire et hautement configurable pour s’adapter à des exigences d’espace particulières.
Scapel chirurgical jetable	Integra Miltex	4-410	pour faire des incisions cutanées
Pince à tissus - 1 x 2 dents	Fine Science Tools	11021-12	pour disséquer brutalement les mucles
Dumont #5 - Pince à finition miroir	Outils de science fine	11252-23	pour séparer et préparer l’artère carotide pour l’injection
Ciseaux à ressort	Outils de science fine	15025-10	pour couper les sutures
EZ Clip Kit	Stoelting	59020	pour plaie cloure
BD Seringue à insuline	Becton Dickinson	328438	pour injection cellulaire
IVIS Spectrum In Vivo Système d’imagerie	PerkinElmer	124262