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Article de méthode

La puissance de la simplicité: Sea Urchin Embryons comme

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⸱

DOI :

10.3791/55113

⸱

16 février 2017

 ,  , 
1Department of Biological Sciences, Mississippi State University

Dans cet article

Résumé

Cet article vidéo détaille un simple dans la méthode in vivo qui peut être utilisé pour caractériser systématiquement et efficacement les composants de voies de signalisation complexes et les réseaux de régulation dans de nombreux embryons d' invertébrés.

Résumé

Remarquablement peu de voies de transduction du signal de cellule à cellule sont nécessaires au cours du développement embryonnaire pour générer la grande variété de types de cellules et de tissus dans la forme corporelle adulte. Pourtant, chaque année, de plus en plus de composants de voies de signalisation individuelles sont découverts, et des études indiquent que, selon le contexte, il existe une diaphonie significative entre la plupart de ces voies. Cette complexité rend difficile l’étude de la signalisation de cellule à cellule dans tout système de modèle de développement in vivo. De plus, des analyses fonctionnelles efficaces sont nécessaires pour caractériser les molécules associées aux voies de signalisation identifiées à partir des grands ensembles de données générés par les cribles différentiels de nouvelle génération. Ici, nous illustrons une méthode simple pour identifier efficacement les composants des voies de transduction du signal régissant le destin cellulaire et la spécification de l’axe chez les embryons d’oursins. La simplicité génomique et morphologique des embryons, similaire à celle de l’oursin, en fait de puissants modèles de développement in vivo pour comprendre les interactions de signalisation complexes. La méthodologie décrite ici peut être utilisée comme modèle pour identifier de nouvelles molécules de transduction de signal dans des voies individuelles ainsi que les interactions entre les molécules dans les différentes voies de nombreux autres organismes.

Introduction

réseaux de gènes de régulation (GRNS) et voies de signalisation établissent l'expression spatiale et temporelle des gènes au cours du développement embryonnaire qui sont utilisés pour construire le plan corporel de l'animal adulte. Cell-à-cellule des voies de transduction du signal sont des composants essentiels de ces réseaux de régulation, en fournissant les moyens par lesquels les cellules communiquent. Ces interactions cellulaires établir et affiner l'expression des gènes de régulation et de différenciation dans et entre les différents territoires pendant l' embryogenèse 1, 2. Les interactions entre les modulateurs sécrétées extracellulaires (ligands, des antagonistes), des récepteurs et co-récepteurs contrôlent les activités des voies de transduction du signal. Un assortiment de molécules intracellulaires transduction ces entrées résultant de l'expression altérée du gène, la division et / ou la forme d'une cellule. Bien que plusieurs des molécules clés utilisés aux niveaux extracellulaires et intracellulaires dans les principales voies sontconnu, il est une connaissance incomplète due en grande partie à la complexité des voies de signalisation individuelles. En outre, les différentes voies de signalisation interagissent souvent entre eux de façon positive ou négative au extracellulaire, intracellulaire, et les niveaux de transcription 3, 4, 5, 6. Fait important, les composants de base de voies de signalisation sont hautement conservées dans toutes les espèces de métazoaires, et, fait remarquable, la plupart des grandes voies de signalisation exercent souvent des fonctions de développement similaires dans de nombreuses espèces lorsque l'on compare les organismes de phyla étroitement liés , en particulier 7, 8, 9, 10, 11.

L'étude de la signalisation au cours du développement est une tâche ardue dans tout organisme, et il yPlusieurs défis importants pour l' étude des voies de signalisation dans la plupart des modèles deutérostomes (vertébrés, chordés invertébrés, hémichordés et échinodermes): 1) Chez les vertébrés , il y a un grand nombre de possibles ligand et les interactions récepteur / co-modulateurs, des molécules de transduction intracellulaire, ainsi que les interactions possibles entre les différentes voies de signalisation en raison de la complexité du génome 12, 13, 14; 2) La morphologie complexe et mouvements morphogénétiques chez les vertébrés font qu'il est souvent plus difficile d'interpréter les interactions fonctionnelles et entre les voies de transduction du signal; 3) Les analyses de la plupart des espèces modèles invertébré deutérostomien non échinodermes sont limitées par de courtes fenêtres de gravidity à l'exception de certaines espèces de tuniciers 15, 16.

leoursin embryon a quelques - unes des limitations mentionnées ci-dessus et offre de nombreuses qualités uniques pour effectuer une analyse détaillée des voies de transduction du signal in vivo. Ceux - ci sont les suivantes: 1) La relative simplicité du génome de l' oursin réduit de manière significative le nombre de possible ligand, un récepteur / co-récepteur et la molécule de transduction intracellulaire interactions 17; 2) Les GRNS contrôlant la spécification et la structuration des couches germinales et les grands axes embryonnaires sont bien établis dans les embryons d'oursins, d' aider à la compréhension du contexte réglementaire de la cellule / territoire recevant les signaux 18, 19; 3) De nombreuses voies de transduction du signal peuvent être étudiés entre les étapes de clivage et gastrula lorsque les embryons sont constitués d'un seul épithélium stratifié dont la morphologie est plus facile à analyser; 4) Les molécules comportentd dans les voies dans les oursins sont facilement manipulables de signalisation; 5) De nombreux oursins sont gravides pendant 10 à 11 mois par an (par exemple Strongylocentrotus purpuratus et Lytechinus variegatus).

Ici, nous présentons une méthode pour caractériser systématiquement et efficacement les composants des voies de signalisation qui précisent et territoires de modèle dans les embryons d'oursins pour illustrer les avantages que plusieurs systèmes de modèles d'invertébrés offrent dans l'étude des mécanismes moléculaires complexes.

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Protocole

1. Stratégie de conception morpholino Throughput haut

  1. Identifier un gène (s) d'intérêt (par exemple , l' approche de gène candidat, l' analyse des cis-régulatrices, et RNA-seq ou écrans différentiels / protéomique).
  2. Utilisez génomique, transcriptomique, et des données d'expression génique disponibles sur les sites Web fréquemment mis à jour (par exemple SpBase http://www.echinobase.org 20 et S. purpuratus Genome Recherche http: ///urchin.nidcr.nih.gov/blast/index .html) pour déterminer que le profil d'expression spatiotemporelle chevauche avec le mécanisme de développement en question. Si aucune donnée d'expression est disponible, puis générer des amorces qPCR et / ou un antisens sonde in situ pour évaluer le profil d'expression génique.
  3. Après avoir déterminé le modèle spatial et temporel d'expression, d'obtenir la séquence d'ADN à partir des sites web génomiques.
    1. Pour générer des oligonucléotides morpholino traduction-bloquant, d'obtenir la séquence of la «région non traduite (5 '5 UTR) directement en amont du codon d'initiation de la balise de séquence exprimée (EST) des bases de données disponibles sur SpBase ou S. purpuratus Genome recherche des sites Web. Si cette information est indisponible pour le gène d'intérêt, puis effectuer 5 'RACE.
    2. Pour concevoir un morpholino d'épissure de blocage, la recherche de la séquence génomique comprenant les exons et les introns en utilisant l'outil échafaudage blastn dans SpBase ou S. purpuratus Genome outil de recherche.
  4. Utilisez le site Web oligonucléotide conception http://oligodesign.gene-tools.com afin de concevoir la séquence paire morpholino 25 de base désirée.
    1. Pour une translation morpholino-blocage, en utilisant la séquence d'ARNm de 5 'à 3' comme source de la séquence cible de la traduction. Inclure la séquence 5 'UTR (environ 70 nucléotides en amont du site de début de transcription) plus de 25 bases de la région (en aval du site de départ) de codage avec le codon de départ wi marquéème parenthèse (ATG).
    2. Pour un morpholino d'épissure de blocage, sélectionnez intron-exon ou d'une séquence de frontière exon-intron et comprennent 50 bases (25 bases de séquence exon et 25 bases de séquence d'introns) autour des régions limitrophes. Scanner le génome avec la séquence morpholino pour vérifier que la séquence soit unique.

2. La micro-injection de morpholino oligonucleotides

  1. Préparer 3 mM solutions des oligonucléotides morpholino en ajoutant 100 pi d'eau sans nucléase dans le 300 nmol morpholino flacon.
    NOTE: Ne pas utiliser l'eau traitée DEPC pour la remise en suspension, car le pyrocarbonate de diéthyle peut endommager le morpholino.
  2. Pour la première rotation de reconstitution sur le flacon contenant la solution mère d'oligonucléotide pendant 30 s à pleine vitesse (14.000 - 16.000 xg), vortex brièvement, de la chaleur à 65 ° C pendant 5 à 10 min, vortex brièvement, et de garder le morpholino stock à la chambre température pendant au moins 1 h. Morpholino solution stock s sont stockés de -20 ° C à +4 ° C.
  3. Préparer une solution injectable contenant oligonucleotides morpholino, à la concentration souhaitée. Cette solution contient habituellement 20% de glycérol ou de KCl 125 en tant que support et 15% FITC-Dextran (isothiocyanate de fluorescéine dextrane 10.000 MW 2,5 mg / uL solution mère). FITC-Dextran et d'autres conjugués dextrane fluorescents sont utilisés en routine pour identifier les embryons injectés par microscopie à épifluorescence. Magasin solutions d'injection à -20 ° C.
  4. Chauffer la solution morpholino à 65 ° C dans un bloc chauffant ou un bain d'eau pendant au moins 2 - 5 min.
  5. En bref tourner la solution morpholino pendant 30 s à pleine vitesse (14.000 - 16.000 xg), vortex pendant 1 min et centrifuger à pleine vitesse (14.000 - 16.000 xg) pendant au moins 10 min.
  6. Charger les aiguilles d'injection avec la solution morpholino. Pour un protocole de microinjection détaillée s'il vous plaît voir Stepicheva et Song 2014 21 et Acclamations et Ettensohn 2004"> 22.

3. Fixation et In Situ Protocole à 24 h post-fécondation (HPF) dans S. purpuratus Embryons

NOTE: Ce protocole est modifié de Arenas-Mena et al. 2000 23 et Sethi et al. 2014 24.

  1. Fixation
    1. Ajouter quelques gouttes de fixateur (voir ci-dessous) à des puits contenant des embryons, mélanger doucement par pipetage, et leur permettre de se déposer. Retirer la solution de fixateur, puis mélanger les embryons avec deux lavages supplémentaires 180 uL de fixateur.
      NOTE: Il est important de bien mélanger les embryons pendant les lavages par pipetage doux monter et descendre plusieurs fois. Ne pas le faire peut réduire le rapport signal sur bruit.
    2. Laissez les embryons à fixer dans le second lavage de fixateur pendant 50 min à 1 h à température ambiante (RT) dans 4% de paraformaldehyde de qualité en microscopie électronique consistant en mM MOPS 10 pH 7,0, 0,1% de Tween-20, et artificielle seawater (ASW). Faire de cette solution fraîche chaque fois pour de meilleurs résultats. En outre, pour la facilité et l'aspect pratique des embryons sont fixés dans des plaques à 96 puits.
      1. Pour 20 ml de fixatif utiliser 5 ml 16% de paraformaldehyde, 15 ml ASW, 200 pi de 1 M de MOPS à pH 7,0, et 20 pi de Tween-20.
    3. Laver 5 fois à température ambiante avec 180 pi de tampon MOPS lavage consistant en 0,1 M de MOPS à pH 7,0, 0,5 M de NaCl et 0,1% de Tween-20 pendant au moins 5 minutes, ou jusqu'à ce que des embryons tomber au fond du puits. Encore une fois, il est important de bien mélanger les embryons dans le tampon de lavage par pipetage doucement monter et descendre plusieurs fois. tampon de lavage MOPS peut être utilisé pendant 2 jours si elle est conservée à 4 ° C.
      1. 40 ml de MOPS tampon de lavage utilisé 4 ml de MOPS 1 M pH 7,0, 4 ml de NaCl 5 M, 32 ml dH 2 O, et 40 pi de Tween-20.
      2. Embryons fixes peuvent être conservés à 4 ° C pendant 2 jours.
        NOTE: Si le stockage des embryons fixes plus, puis ajouter de l'azoture de sodium à 0,2% en MOPS tampon de lavage pour empêcher la croissance bactérienne.
  2. Préhybridation
    1. Aspirer le MOPS tampon de lavage et ajouter 180 ul d'un rapport de 2: 1 de MOPS tampon de lavage au tampon d'hybridation, mélanger les embryons dans la solution par pipetage doux à plusieurs reprises, et incuber pendant au moins 20 min à température ambiante. un tampon d'hybridation est constitué de 70% de formamide, 0,1 M de MOPS à pH 7,0, 0,5 M de NaCl, 1 mg / ml de BSA et 0,1% de Tween-20.
      1. Pour 40 mL utilisation du tampon d'hybridation 4 ml 1 M MOPS pH 7,0, 4 ml de NaCl 5 M, 4 ml dH 2 O, 0,04 g de BSA, et 40 pi de Tween-20. Bien mélanger par tourbillonnement, ajouter 28 ml de formamide, et le vortex à nouveau.
    2. Retirez le rapport 2: 1 de MOPS laver et les tampons d'hybridation et ajouter 180 ul d'un rapport 1: 2 de MOPS tampon de lavage au tampon d'hybridation, mélanger les embryons dans la solution, et incuber pendant au moins 20 min à température ambiante.
    3. Avant hybridation de sonde mélanger délicatement les embryons dans 100 - 150 pi de tampon d'hybridation. Incuber les embryons à 50 ° C pendant au moins 1h.
      NOTE: L'incubation des embryons nuit est acceptable. Avant l'incubation, sceller les puits avec une feuille adhésive afin d'éviter l'évaporation.
  3. Hybridation
    1. Dans un tube séparé ajouter 0,1 à 0,3 ng / pl de sonde et 500 pg / ml d'ARNt de levure dans un tampon d'hybridation, puis doucement vortex pour créer une solution de sonde. ARNt de levure est ajoutée à la solution de la sonde pour réduire la liaison non spécifique de la sonde anti-sens. Préchauffer cette solution à 50 ° C et le tampon d'hybridation aspirat.
    2. Mélanger les embryons pré-hybridés dans 100 ul de la solution de sonde, sceller avec une feuille adhésive, et hybrident à 50 ° C pendant 2 à 7 jours en fonction de la sonde (la sonde foxq2 peut être mis à incuber pendant 2 jours).
      NOTE: Les temps d'incubation peuvent varier en fonction de la sonde. Certains gènes exprimés à des niveaux faibles nécessitent jusqu'à une incubation de 7 jours. plaques à 96 puits peuvent être placés dans une boîte d'humidité comme une assurance contre l'évaporation si les ADHESfeuille ive ne parvient pas à sceller correctement.
    3. Laver 5 fois à 50 ° C avec 180 pi de MOPS fraîchement préparé le tampon de lavage pour un total de 3 h. Ensuite, laver 3 fois (15 min) avec 180 pi de MOPS tampon de lavage à température ambiante. Rappelez-vous de mélanger les embryons dans le tampon de lavage à chaque fois par un léger pipetage plusieurs fois.
  4. Anticorps incubation
    1. Aspirer le MOPS tampon de lavage et mélanger embryons dans 180 pi de tampon de blocage constitué de 10% sérum normal de mouton et 5 mg / ml de BSA dans MOPS tampon de lavage et incuber pendant au moins 45 min à température ambiante ou à 4 ° C pendant la nuit.
    2. Retirer le tampon de blocage, puis mélanger les embryons dans un tampon de blocage contenant une dilution à 1: 1500 d'anticorps anti-digoxigénine conjugué à la phosphatase alcaline diluée dans un tampon de blocage. Incuber une nuit à température ambiante dans une plaque scellée pour éviter l'évaporation. NOTE: Ne laissez pas l'anticorps sur plus d'un jour.
    3. Laver les embryons 6 fois (5 min ou jusqu'à ce que les embryons tombent) dans MOPS tampon de lavage à température ambiante. embryons peutêtre stocké pendant une nuit à 4 ° C.
  5. Dans le développement in situ
    1. Laver les embryons 3 fois (10 min) à température ambiante avec fraîchement préparée , pH 9,5 tampon constitué de Tris 0,1 M pH 9,5, 100 mM de NaCl, 50 mM de MgCl2, 1 mM de lévamisole, et du Tween-20 à 0,1%.
      1. Pour 20 ml de tampon pH 9,5 utiliser 2 ml de Tris 1 M pH 9,5, 400 ul de NaCl 5 M, 1 ml de 1 M de MgCl2, 20 pi de Tween-20, 16,6 ml dH 2 O et 0,0048 g lévamisole.
    2. Incuber les embryons à 37 ° C dans un tampon de coloration à l'abri de la lumière. un tampon de coloration est constitué de 10% de dimethyl formamide, 4,5 ul / ml de 4-nitro tétrazolium (NBT) et 3,5 ul / ml de 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate (BCIP) dans fraîchement préparé le tampon à pH 9,5 .
      1. Pour 1 ml de tampon de coloration en utilisant 100 ul dimethylformamide, 4,5 ul de NBT et 3,5 ul BCIP.
    3. Arrêter la réaction de la phosphatase alcaline par lavage 3 à 5 fois dans MOPS tampon de lavage. La réaction wie la sonde foxq2 prend généralement 30 min à 1 h. Certaines sondes peuvent avoir besoin d'une nuit d'incubation soit à la température ambiante ou à 4 ° C.
    4. Mélanger les embryons dans une solution de 70% de lavage MOPS et 30% de glycérol. Le glycérol fournit un indice de réfraction nécessaire pour la microscopie. Les embryons peuvent être conservés dans cette solution pendant plusieurs semaines. Sceller les plaques avec de la paraffine en plastique pour éviter l'évaporation.
  6. Préparation de diapositives et de capture d' image
    1. Préparer une diapositive en organisant trois petites bandes de ruban adhésif double face dans un triangle avec de petits écarts entre les bandes sur une lame.
    2. Transférer les embryons dans le lavage de MOPS 70% et une solution de glycérol à 30% au centre du triangle et couvrir avec une lamelle.
    3. Sceller la lamelle en appliquant une couche de vernis à ongles sur les bords de la lamelle.
    4. Capture d'images à l'aide d'un microscope optique composé avec un objectif 20X et une caméra attachée.

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Résultats

Dans l'embryon d'oursin , nous avons montré que 3 différents de signalisation Wnt branches (Wnt / β-caténine, Wnt / JNK et Wnt / PKC) 4, 25 interagissent pour former un réseau de signalisation Wnt qui régit antéro-postérieur (AP) patterning. Une des conséquences les plus importantes de ces événements de signalisation est que la large exprimé neurectoderme antérieure (ANE) GRN initial devient restreint à un petit territoir...

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Discussion

La méthodologie présentée ici est un exemple qui illustre le pouvoir d'utiliser des embryons avec une complexité moins génomique et morphologique que les vertébrés à comprendre les voies de signalisation de la transduction et GRNS régissant les mécanismes de développement fondamentaux .. De nombreux laboratoires utilisent des tests similaires au début du développement de l'oursin à disséquer le voies impliquées dans d' autres événements de spécification du destin cellulaire de signalisation (par exemple<...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Nous tenons à remercier le Dr Robert Angerer pour sa lecture et son édition attentives du manuscrit. Le NIH R15HD088272-01 ainsi que le Bureau de la recherche et du développement et le Département des sciences biologiques de l’Université d’État du Mississippi ont fourni un soutien à ce projet au RCR.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Morpholino bloquant la traduction et/ou morpholino bloquant l’épissageGene Tools LLCPersonnaliséPlus d’informations sur www.gene-tools.com
GlycérolInvitrogen15514-011
FITC (isothiocyanate de fluorescéine de dextran)Invitrogen, Life TechnologiesD1821Make 25 mg/mL solution mère
de paraformaldéhyde 16 % EMGrade Electron Microscopie Sciences15710
MOPSSigma AldrichM1254-250G
Tween-20Sigma Aldrich23336-0010
FormamideSigma Aldrich47671-1L-F
Levure ARNtInvitrogen15401-029
Sérum de chèvre normalSigma AldrichG9023-10mL
Anticorps anti-digoxigénine conjugué à la phosphatase alcalineRoche11 093 274 910
Chlorhydrate de tétramisole (lévamisole)Sigma AldrichL9756-5G
Tris Base UltraPureResearch Products Internationall Corp56-40-6
Chlorure de sodiumFisher ScientificBP358-10
Chlorure de magnésiumSigma Aldrich7786-30-3
BCIP (5-Bromo-4-Chloro-3-indolyl-phosphateRoche11 383 221 001
4 Chlorure de nitro-bleu de tétrazolium (NBT)Roche11 383 213 001
Diméthyl FormamideSigma AldrichD4551-500mL
Chlorure de potassiumSigma AldrichP9541-5KG
Bicarbonate de sodiumSigma AldrichS5761-500G
Sulfate de magnésiumSigma AldrichM7506-2KG
Chlorure de calciumSigma AldrichC1016-500G

Références

  1. Erwin, D. H., Davidson, E. H. The evolution of hierarchical gene regulatory networks. Nature reviews. Genetics. 10, 141-148 (2009).
  2. Peter, I. S., Davidson, E. H. Evolution of gene regulatory networks controlling body plan development. Cell. 144, 970-985 (2011).
  3. Borggrefe, T., et al. The Notch intracellular domain integrates signals from Wnt, Hedgehog, TGFbeta/BMP and hypoxia pathways. Biochimica et biophysica acta. 1863, 303-313 (2016).
  4. Range, R. C., Angerer, R. C., Angerer, L. M. Integration of canonical and noncanonical Wnt signaling pathways patterns the neuroectoderm along the anterior-posterior axis of sea urchin embryos. PLoS Biol. 11, e1001467(2013).
  5. Cleary, M. A., van Osch, G. J., Brama, P. A., Hellingman, C. A., Narcisi, R. FGF, TGFbeta and Wnt crosstalk: embryonic to in vitro cartilage development from mesenchymal stem cells. Journal of tissue engineering and regenerative medicine. 9, 332-342 (2015).
  6. Lapraz, F., et al. RTK and TGF-beta signaling pathways genes in the sea urchin genome. Dev Biol. 300, 132-152 (2006).
  7. Pires-daSilva, A., Sommer, R. J. The evolution of signalling pathways in animal development. Nature reviews. Genetics. 4, 39-49 (2003).
  8. Sethi, A. J., Wikramanayake, R. M., Angerer, R. C., Range, R. C., Angerer, L. M. Sequential signaling crosstalk regulates endomesoderm segregation in sea urchin embryos. Science. 335, 590-593 (2012).
  9. Range, R. Specification and positioning of the anterior neuroectoderm in deuterostome embryos. Genesis. 52, 222-234 (2014).
  10. Petersen, C. P., Reddien, P. W. Wnt signaling and the polarity of the primary body axis. Cell. 139, 1056-1068 (2009).
  11. Lapraz, F., Haillot, E., Lepage, T. A deuterostome origin of the Spemann organiser suggested by Nodal and ADMPs functions in Echinoderms. Nature communications. 6, 8434(2015).
  12. Kikuchi, A., Yamamoto, H., Sato, A. Selective activation mechanisms of Wnt signaling pathways. Trends in cell biology. 19, 119-129 (2009).
  13. Hogan, B. L. Bone morphogenetic proteins: multifunctional regulators of vertebrate development. Genes Dev. 10, 1580-1594 (1996).
  14. Houart, C., et al. Establishment of the telencephalon during gastrulation by local antagonism of Wnt signaling. Neuron. 35, 255-265 (2002).
  15. Bertrand, S., Escriva, H. Evolutionary crossroads in developmental biology: amphioxus. Development. 138, 4819-4830 (2011).
  16. Rottinger, E., Lowe, C. J. Evolutionary crossroads in developmental biology: hemichordates. Development. 139, 2463-2475 (2012).
  17. Genome Sequencing Sea Urchin, C., et al. The genome of the sea urchin Strongylocentrotus purpuratus. Science. 314, 941-952 (2006).
  18. Ben-Tabou de-Leon, S., Su, Y. H., Lin, K. T., Li, E., Davidson, E. H. Gene regulatory control in the sea urchin aboral ectoderm: spatial initiation, signaling inputs, and cell fate lockdown. Dev Biol. 374, 245-254 (2013).
  19. Saudemont, A., et al. Ancestral regulatory circuits governing ectoderm patterning downstream of Nodal and BMP2/4 revealed by gene regulatory network analysis in an echinoderm. PLoS Genet. 6, e1001259(2010).
  20. Cameron, R. A., Samanta, M., Yuan, A., He, D., Davidson, E. SpBase: the sea urchin genome database and web site. Nucleic Acids Res. 37, D750-D754 (2009).
  21. Stepicheva, N. A., Song, J. L. High throughput microinjections of sea urchin zygotes. Journal of visualized experiments : JoVE. , e50841(2014).
  22. Cheers, M. S., Ettensohn, C. A. Rapid microinjection of fertilized eggs. Methods in cell biology. 74, 287-310 (2004).
  23. Arenas-Mena, C., Cameron, A. R., Davidson, E. H. Spatial expression of Hox cluster genes in the ontogeny of a sea urchin. Development. , 4631-4643 (2000).
  24. Sethi, A. J., Angerer, R. C., Angerer, L. M. Multicolor labeling in developmental gene regulatory network analysis. Methods in molecular biology. , 249-262 (2014).
  25. Wikramanayake, A. H., Huang, L., Klein, W. H. beta-Catenin is essential for patterning the maternally specified animal-vegetal axis in the sea urchin embryo. Proc Natl Acad Sci U S A. 95, 9343(1998).
  26. Yaguchi, S., Yaguchi, J., Angerer, R. C., Angerer, L. M. A Wnt-FoxQ2-nodal pathway links primary and secondary axis specification in sea urchin embryos. Dev Cell. 14, 97-107 (2008).
  27. Molina, M. D., de Croze, N., Haillot, E., Lepage, T. Nodal: master and commander of the dorsal-ventral and left-right axes in the sea urchin embryo. Curr Opin Genet Dev. 23, 445-453 (2013).
  28. Range, R. C., Glenn, T. D., Miranda, E., McClay, D. R. LvNumb works synergistically with Notch signaling to specify non-skeletal mesoderm cells in the sea urchin embryo. Development. 135, 2445-2454 (2008).
  29. Range, R., et al. Cis-regulatory analysis of nodal and maternal control of dorsal-ventral axis formation by Univin, a TGF-beta related to Vg1. Development. 134, 3649-3664 (2007).
  30. Warner, J. F., Miranda, E. L., McClay, D. R. Contribution of hedgehog signaling to the establishment of left-right asymmetry in the sea urchin. Dev Biol. 411, 314-324 (2016).
  31. Rottinger, E., et al. FGF signals guide migration of mesenchymal cells, control skeletal morphogenesis [corrected] and regulate gastrulation during sea urchin development. Development. 135, 353-365 (2008).
  32. Warner, J. F., McCarthy, A. M., Morris, R. L., McClay, D. R. Hedgehog signaling requires motile cilia in the sea urchin. Mol Biol Evol. 31, 18-22 (2014).
  33. Technau, U., Steele, R. E. Evolutionary crossroads in developmental biology. Cnidaria. Development. 138, 1447-1458 (2011).
  34. Yaguchi, J., Takeda, N., Inaba, K., Yaguchi, S. Cooperative Wnt-Nodal Signals Regulate the Patterning of Anterior Neuroectoderm. PLoS Genet. 12, e1006001(2016).
  35. Duboc, V., Rottinger, E., Besnardeau, L., Lepage, T. Nodal and BMP2/4 signaling organizes the oral-aboral axis of the sea urchin embryo. Dev Cell. 6, 397-410 (2004).
  36. Bradham, C. A., et al. Chordin is required for neural but not axial development in sea urchin embryos. Dev Biol. 328, 221-233 (2009).
  37. Su, Y. H. Gene regulatory networks for ectoderm specification in sea urchin embryos. Biochimica et biophysica acta. 1789, 261-267 (2009).
  38. Lin, C. Y., Su, Y. H. Genome editing in sea urchin embryos by using a CRISPR/Cas9 system. Dev Biol. 409, 420-428 (2016).

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Sp cification du destin cellulairevoies de signalisation axialer seaux de r gulation g niqueanalyse de la transduction du signalbiologie du d veloppement volutiftude des axes embryonnairesmod les d organismes simplesinteractions de signalisation complexes
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