Isolement rapide de BMPR-IB + Adipose-Derived cellules stromales pour utilisation dans un calvarial Defect Modèle de guérison

Résumé

Les cellules stromales dérivées du tissu adipeux peuvent être utiles pour concevoir de nouveaux tissus à partir des propres cellules d’un patient. Nous présentons un protocole pour l’isolement d’une sous-population de cellules stromales (ASC) humaines dérivées du tissu adipeux avec un potentiel ostéogénique accru, suivi de l’application des cellules dans un test de cicatrisation calvaire in vivo.

Résumé

Les cancers invasifs, les blessures graves et les infections peuvent provoquer des défauts osseux trop importants pour être reconstruits avec de l’os préexistant provenant du propre corps du patient. La capacité de cultiver de novo de l’os à l’aide des propres cellules d’un patient permettrait de combler les défauts osseux avec des tissus adéquats sans la morbidité de la récolte d’os natif. L’utilisation de cellules stromales dérivées du tissu adipeux (ASC) comme source d’ingénierie tissulaire suscite un intérêt, car celles-ci sont obtenues à partir d’une source abondante : le tissu adipeux du patient. Cependant, les ASC sont une population hétérogène et certaines sous-populations peuvent être plus efficaces dans cette application que d’autres. L’isolement de la population la plus ostéogénique d’ASC pourrait améliorer l’efficience et l’efficacité d’un processus d’ingénierie osseuse. Dans ce protocole, les ASC sont obtenues à partir de tissu adipeux sous-cutané d’un donneur humain. La sous-population d’ASC exprimant le marqueur BMPR-IB est isolée à l’aide de FACS. Ces cellules sont ensuite appliquées à un test de cicatrisation in vivo des défauts calvaires et présentent un potentiel de régénération ostéogénique amélioré par rapport aux cellules non triées.

Introduction

défauts osseux majeurs résultant d'une lésion, une infection ou un cancer invasif ont un impact significatif sur la récupération et la qualité de vie d'un patient. Il existe des techniques pour combler ces défauts avec l' os sain d'ailleurs dans son propre corps du patient, mais ce transfert porte sa propre morbidité et risque de complications ^{1, 2, 3.} En outre, certains défauts sont si importantes ou complexes que l'os donneur suffisante ne sont pas disponibles pour combler le défaut. Dispositifs prothétiques sont une option potentielle pour le remplissa....

Protocole

NOTE: Les échantillons ont été obtenus à partir de patients qui ont donné leur consentement éclairé. Tous les protocoles ont été examinés et approuvés par le comité d'examen institutionnel de l'Université de Stanford approprié. Lors de la manipulation des tissus et cellules humains, toujours adhérer à biosécurité de niveau 2 (NSB2) précautions, tel que spécifié par votre institution.

1. Préparation des réactifs

1. Préparer un tampon FACS: Ajouter 10 ml de FBS, 5 ml de Poloxamer 188 et 5 ml de Pen-Strep à 500 ml de solution saline tamponnée au phosphate stérile (PBS).
2. Préparer digérer mélange: Ajouter 0,375 g ....

Résultats

Micro CT scan effectué le jour de la chirurgie montrera clairement le défaut du crâne. A cette époque, il n'y aura pas d'interposition dans le défaut de 4 mm. On obtient des analyses ultérieures au cours du temps afin de quantifier la taille du défaut au fil du temps par rapport à la ligne de base. Défauts ensemencés avec BMPR-IB cellules + devraient démontrer plus fermeture rapide du défaut par rapport à BMPR-IB- et les cellules non triées (figure 5). En outre, .......

Discussion

Étapes critiques dans le Protocole

Lors de la récolte de ASCs, l'étape critique est la digestion adéquate de graisse avec de la collagénase. digestion inadéquate se traduira par un faible rendement de ASCs. Au cours de tri FACS de cellules BMPR-IB +, il est important de définir soigneusement la porte de positivité. Définition de portes trop lâche peut entraîner des populations triées qui ne sont pas pures. Lors de la création du défaut crânienne, il est essentiel pour percer le défaut dans .......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Filtre à cellules 100 microns	Falcon	352360
Scalpel à 15 lames	Miltex	4-515
Plaque à 24 puits	Corning	3524
Filtre à cellules 40 microns	Falcon	352340
Tubes à centrifuger coniques de 50 mL	Falcon	352098
6-0 Suture en nylon Ethilon, 18", aiguille P-3, etc.	Ethicon	1698G
Anti-BMPR-IB Anticorps primaire	R& D systems	FAB5051A
BioGel PI gants chirurgicaux	Mö ; lnlycke Soins de santé	ALA42675Z
Buprénorphine SR	ZooPharm
Castro-Viejo tourne-aiguille	Fine Science Tools	12565-14
CD1 souris nue	Charles River	086
Collagenase Type II	poudre Gibco	17101-015
DMEM medium	Gibco	10564-011
Perceuse : Couteau circulaire 4,0 mm	Xemax Surgical	CK40
Foret : Z500 Micromoteur sans balais	NSK	NSKZ500
FBS	Gicbo	10437-077
Fisherbrand Sous-tapis absorbants, 20 » x 24	"Fisher Scientific	14-206-62
Fisherbrand Tampon de gaze de coton stérile, 4 » x 4	Fisher Scientific	22-415-469
Coussin chauffant	Kent Scientific	DCT-20
Hyclone 199/EBSS medium	GE  ; Sciences de la vie	SH30253.01
Isothésie isoflurane	Henry Schein  ;
Micro pince avec dents	Roboz	RS-5150
Micro pince avec dents	Roboz	RS-5150
Film de paraffine (Parafilm)	Bemis	PM996
PBS	Gibco	10010-023
Pen-Strep	Gibco	15140-122
Échafaudages PLGA	Formulation exclusive
Poloxamer 188, 10 %	Sigma	P5556-100ML
Champ stérile polyliné, 18 » x 24"	Busse Hospital Disposables	696	Découper un trou rectangulaire de la taille appropriée
Polysaccharose Solution : Histopaque 1119	Sigma	11191
Povidone Iodine Prep Solution	Medline	MDS093944H
Puralube vaseline pommade ophtalmique, tube de 1/8 oz	Dechra Veterinary Products
Tampon de lyse RBC	Sigma	11814389001
Webcol tampons de préparation à l’alcool	Covidien	6818

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