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Article de méthode

Isolement rapide de BMPR-IB + Adipose-Derived cellules stromales pour utilisation dans un calvarial Defect Modèle de guérison

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DOI :

10.3791/55120

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24 février 2017

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1Hagey Laboratory for Pediatric Regenerative Medicine, Division of Plastic and Reconstructive Surgery, Department of Surgery, Stanford University School of Medicine

Dans cet article

Résumé

Les cellules stromales dérivées du tissu adipeux peuvent être utiles pour concevoir de nouveaux tissus à partir des propres cellules d’un patient. Nous présentons un protocole pour l’isolement d’une sous-population de cellules stromales (ASC) humaines dérivées du tissu adipeux avec un potentiel ostéogénique accru, suivi de l’application des cellules dans un test de cicatrisation calvaire in vivo.

Résumé

Les cancers invasifs, les blessures graves et les infections peuvent provoquer des défauts osseux trop importants pour être reconstruits avec de l’os préexistant provenant du propre corps du patient. La capacité de cultiver de novo de l’os à l’aide des propres cellules d’un patient permettrait de combler les défauts osseux avec des tissus adéquats sans la morbidité de la récolte d’os natif. L’utilisation de cellules stromales dérivées du tissu adipeux (ASC) comme source d’ingénierie tissulaire suscite un intérêt, car celles-ci sont obtenues à partir d’une source abondante : le tissu adipeux du patient. Cependant, les ASC sont une population hétérogène et certaines sous-populations peuvent être plus efficaces dans cette application que d’autres. L’isolement de la population la plus ostéogénique d’ASC pourrait améliorer l’efficience et l’efficacité d’un processus d’ingénierie osseuse. Dans ce protocole, les ASC sont obtenues à partir de tissu adipeux sous-cutané d’un donneur humain. La sous-population d’ASC exprimant le marqueur BMPR-IB est isolée à l’aide de FACS. Ces cellules sont ensuite appliquées à un test de cicatrisation in vivo des défauts calvaires et présentent un potentiel de régénération ostéogénique amélioré par rapport aux cellules non triées.

Introduction

défauts osseux majeurs résultant d'une lésion, une infection ou un cancer invasif ont un impact significatif sur la récupération et la qualité de vie d'un patient. Il existe des techniques pour combler ces défauts avec l' os sain d'ailleurs dans son propre corps du patient, mais ce transfert porte sa propre morbidité et risque de complications 1, 2, 3. En outre, certains défauts sont si importantes ou complexes que l'os donneur suffisante ne sont pas disponibles pour combler le défaut. Dispositifs prothétiques sont une option potentielle pour le remplissage de défauts osseux , mais ceux - ci sont associés à plusieurs inconvénients , notamment le risque d'infection, panne matérielle, et la réaction de corps étranger 4.

Pour ces raisons , il y a un grand intérêt dans la possibilité de l' ingénierie des substituts osseux biologiques en utilisant les propres cellules d'un patient 5. cellules stromales adipeuses (CSA)ont le potentiel pour cette application , car ils sont disponibles en abondance dans le propre tissu adipeux du patient et ils ont démontré la capacité de guérir les défauts osseux en générant un nouveau tissu osseux 6, 7. ASCs sont une population hétérogène de cellules , et plusieurs études ont montré que la sélection de marqueurs spécifiques de la surface cellulaire peut produire des populations de cellules ayant une activité améliorée ostéogénique 8, 9. La sélection ASCs avec le potentiel le plus élevé ostéogénique augmenterait la probabilité qu'un échafaudage tête de série avec ces cellules peut régénérer un grand défaut osseux.

Une protéine morphogénétique osseuse (BMP) de signalisation est essentielle pour la régulation de la différenciation osseuse et la formation 10 et le type de récepteur de BMP IB (BMPR-IB) est connu pour être important pour l' ostéogenèse dans ASCs 11. Récemment, nous avons montré que l'expression de BMPR-IB peut be utilisée pour sélectionner ASCs avec une activité accrue ostéogénique 12. Ici , nous démontrons un protocole pour l'isolement de l' ASC de la graisse humaine , suivie par un test de leur activité ostéogénique in vivo en utilisant un modèle calvarial de défaut BMPR-IB-exprimant.

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Protocole

NOTE: Les échantillons ont été obtenus à partir de patients qui ont donné leur consentement éclairé. Tous les protocoles ont été examinés et approuvés par le comité d'examen institutionnel de l'Université de Stanford approprié. Lors de la manipulation des tissus et cellules humains, toujours adhérer à biosécurité de niveau 2 (NSB2) précautions, tel que spécifié par votre institution.

1. Préparation des réactifs

  1. Préparer un tampon FACS: Ajouter 10 ml de FBS, 5 ml de Poloxamer 188 et 5 ml de Pen-Strep à 500 ml de solution saline tamponnée au phosphate stérile (PBS).
  2. Préparer digérer mélange: Ajouter 0,375 g C. hemolyticum collagénase de type II en poudre et 5 mL Poloxamer 188 à 500 ml stérile 199 moyennes / EBSS.
  3. Préparer un milieu standard: Ajouter 50 ml de FBS et 5 ml Pen-Strep à 500 mL de Dulbecco Modified Eagle Medium.

2. Récolte et isolement de ASCs

NOTE: Veiller à ce que les approbations institutionnelles adéquates sont en place pour l'utilisation de tissus humains et pour isoler hcellules souches Uman. Obtenir abdominale humaine, le flanc ou la cuisse graisse sous-cutanée d'un donneur sain subissant la liposuccion élective. Gardez la graisse dans une boîte d'aspiration en plastique.

  1. Ajouter du PBS stérile dans un rapport de 1: 1 à la matière grasse dans le récipient en plastique d'origine. (En cas de 500 ml de matières grasses, ajouter 500 ml de PBS). Mélanger par agitation douce pendant 30 s. Permettre à la couche aqueuse pour déposer au fond (figure 1), puis aspirer et éliminer la phase aqueuse avec une pipette de 10 ml en matière plastique fixée à l' aspiration.
  2. Décanter la graisse dans un grand récipient en plastique et ajouter digérer le mélange dans un rapport 1: 1. Fermer le récipient et nettoyer l'extérieur avec 70% d'éthanol. Sceller le bouchon avec un film de paraffine.
  3. Agiter ce récipient dans un agitateur orbital à 180 tours par minute à 37 ° C pendant 30 min.
  4. Neutraliser la digestion en ajoutant un milieu standard dans un rapport 1: 1. (En cas de mélange de matières grasses 1000 ml, ajouter 1 000 ml de milieu standard).
  5. Distribuer le mélange également dans un nombre pair de 250 ml en plastique de tubes à centrifuger conique et centrifuger le mélange à 300 xg pendant 20 min à 4 ° C
  6. Aspirer le surnageant et faire attention à laisser le culot intact. pellets Resuspendre dans 5 ml de milieu standard pour chaque tube conique.
  7. Filtrer la suspension à travers un filtre de 100 microns dans un 50 ml tube conique de centrifugeuse. Ensuite, centrifuger à 300 g pendant 15 min à 4 ° C.
  8. Aspirer le surnageant et resuspendre le culot dans un tampon de lyse RBC mL de la température ambiante 5. Laisser le mélange reposer pendant 5 min à température ambiante puis centrifuger à 300 g pendant 15 min à température ambiante (RT).
  9. Aspirer le surnageant et remettre le culot dans 15 ml de milieu standard. filtrer à nouveau à travers un filtre de 100 microns dans un tube à centrifuger conique de 50 ml.
  10. Dans un nouveau ml conique 50, ajouter 15 solution de polysucrose mL conçu pour la séparation basé sur la densité (voir la liste des réactifs). Puis, tenant le tube à un angle de 45 °, pipette soigneusement les cellules sur le côté dele tube de telle sorte que la suspension de cellules en douceur des couches au - dessus de la solution de polysaccharose (figure 2).
    Remarque: il est important de cellules de pipette sur la surface de la solution. Ne pas ajouter de solution polysucrose à une suspension de cellules car cela va créer un mélange irréversible. De même, ne pas introduire à la pipette les cellules dans le milieu de la solution de polysaccharose.
  11. Centrifugeuse ce mélange à 300 g pendant 10 min à température ambiante. Utiliser une faible accélération (2 - 3 sur 10) et régler la fonction de frein de la centrifugeuse à zéro pour cette étape.
    NOTE: Trois couches sont visibles: clair sur le fond, nuageux dans le milieu, et de couleur saumon sur le dessus. La couche intermédiaire contient les cellules d'intérêt.
  12. En utilisant une pipette de 10 ml retirer délicatement la couche médiane et transfert à un nouveau tube de 50 ml conique.
    NOTE: Il est préférable de transférer complètement la couche intermédiaire et dans le processus de prendre quelques-unes des couches supérieures et inférieures que de laisser derrière une partie de la couche intermédiaire.
  13. Compter les cellules en utilisant un hémocytomètre et de déterminer le nombre total de cellules vivantes.
    REMARQUE: On utilise typiquement le bleu trypan a ajouté au mélange de cellules à une concentration finale de 0,8% pour faciliter le comptage des cellules. cellules vivantes Viable ne prendra pas le colorant bleu et blanc apparaissent.

3. FACS de tri pour BMPR-IB cellules positives et Préparation de scellants contenant des cellules

  1. Centrifuger la suspension cellulaire à 300 xg pendant 5 min à 4 ° C. Remettre en suspension les cellules dans un tampon FACS à une concentration de 1 million de cellules par 100 pi (basé sur la numération cellulaire effectuée à l'étape 2.13).
  2. Transfert au moins 10 millions de cellules dans un tube de centrifugeuse en plastique étiqueté «BMPR-IB." Par ailleurs, le transfert d'un million de cellules dans 100 ul de tampon FACS à un tube de centrifugation en plastique séparée intitulée «non marqué». Ajouter 1 tampon FACS ml au tube "non marqué". Gardez le reste des cellules dans un tampon FACS sur la glace tandis que les FACS partie de l'exper de trimode de est fait. Marquez ces cellules "Unsorted." Utilisez-les comme témoins plus tard dans l'expérience.
  3. Ajouter une quantité appropriée d'un anticorps fluorescent BMPR-IB anti-humaine au tube "BMPR-IB" selon les instructions du fabricant. Pipeter le mélange monter et descendre doucement pour répartir l'anticorps.
    NOTE: Nous utilisons un humain BMPR-IB / ALK-6 Anticorps APC conjugué à une dilution de 1:10 (voir la liste des réactifs pour les détails). Cependant, les anticorps provenant de différents fabricants auront différentes concentrations recommandées.
  4. Couvrir le seau à glace d'une manière qui maintient la lumière. Laisser le mélange cellules / anticorps à reposer pendant 30 minutes (ou selon les instructions du fabricant de l'anticorps).
    REMARQUE: si l'anticorps anti-BMPR-IB est un anticorps non conjugué primaire qui nécessite un anticorps secondaire, effectuer une étape de coloration distincte sur la glace avec l'anticorps secondaire selon les instructions du fabricant.
  5. Centrifuger les tubes à300 g pendant 5 min à 4 ° C. Aspirer le surnageant, en faisant attention de ne pas aspirer le culot. Resuspendre les cellules sédimentées dans un tampon 1 FACS mL. centrifuger à nouveau les tubes à 300 xg pendant 5 min. Aspirer soigneusement le surnageant et remettre en suspension les cellules dans un tampon FACS à une concentration de 1 million de cellules par 1 ml.
  6. Filtrer le "BMPR-IB», «non marqué» et «cellules non triées" à travers 40 microns crépines cellulaires dans de nouveaux tubes FACS de verre étiquetés. Rincer les filtres avec 500 pi de tampon FACS pour assurer que les cellules ne soient pas laissés dans le filtre. Également ajouter 2 ml de milieu standard pour deux tubes de centrifugation en plastique séparés étiquetés «BMPR-IB-positif» et «BMPR-IB-négatif." Utiliser ces deux pour recueillir les cellules triées dans la machine FACS.
  7. Sur la machine FACS, en utilisant les cellules non colorées pour définir une grille négative pour le marqueur fluorescent.
  8. En utilisant une buse 100 microns, de tri BMPR-IB cellules positives et négatives dans les tubes respectifs concontenant un milieu standard. Gardez ces tubes réfrigérés à 4 ° C au cours de la sorte si la machine FACS a cette capacité.
    NOTE: S'il vous plaît se référer à l'article 13 JOVE par Sharon et al. pour un excellent protocole de tri FACS.
  9. L'utilisation d'un hémocytomètre, compter les cellules dans chaque tube. Centrifuger le "BMPR-IB-positif", "BMPR-IB-négative» et «tubes non triés» à 300 xg pendant 5 min à 4 ° C et aspirer le surnageant, en faisant attention à ne pas perturber le culot cellulaire. Puis remettre en suspension les cellules dans un milieu standard à une concentration de 1 million de cellules par 250 pi.
  10. Obtenir prédécoupée 4 mm PLGA (poly [acide lactique-co-glycolique]) échafauds revêtus d'hydroxyapatite. Placez chaque échafaudage dans un puits d'une plaque de 24 puits. Couvrir chaque échafaudage avec 50 pl de suspension cellulaire de l' un des trois groupes (i .e, 200.000 cellules.): Celebres, BMPR-IB-positif, et BMPR-IB-négatif (Figure 3).
    NOTE: S'il vous plaîtse référer à l'article 14 JOVE par Lo et al. pour plus de détails sur la construction d'échafaudages PLGA.
  11. Remplir partiellement les puits vides entourant avec un milieu standard (pour empêcher la dessiccation des échafauds), couvrent la plaque avec son couvercle et incuber dans un incubateur de culture de cellules à 37 ° C pendant 30 min.

4. Création de défauts calvarial et application des ACS contenant Échafaudages

NOTE: Veiller à ce que les approbations institutionnelles adéquates sont en place pour la création de défauts calvaria dans des souris vivantes. Ce protocole a été approuvé par le Comité institutionnel de protection et de l'utilisation des animaux de l'Université de Stanford.

  1. Anesthetize un CD-1 souris nude en utilisant soit le gaz isoflurane inhalée ou longue durée d'action cocktail anesthésique injecté.
    1. Pour utiliser le gaz seul, placer la souris dans une chambre d'anesthésie et démarrer le flux d'oxygène à 2 - 3 L / min avec une concentration d'isoflurane à 2%. Une fois que la souris est fully inconsciente, placez-le sur une tendance générale de recirculation de l'eau chaude avec un tampon absorbant et placer son museau dans un cône de nez anesthésie avec la même concentration d'oxygène et de l'isoflurane. Surveiller attentivement la fréquence respiratoire et ajuster la concentration d'isoflurane au besoin.
    2. Pour utiliser une longue durée d'action cocktail anesthésique injecté, anesthésier la souris dans une chambre d'anesthésie comme décrit ci-dessus, puis injecter le cocktail anesthésique. Retirez la souris de la chambre de l'anesthésie et observer son comportement.
      REMARQUE: La souris peut rapidement sortir de l'anesthésie mais en quelques minutes devrait être à nouveau totalement anesthésiées sous l'effet de l'anesthésique injecté. Transférer la souris pour une couverture de recirculation d'eau chaude recouvert d'un tampon absorbant.
      NOTE: Pour un cocktail anesthésique, nous recommandons un mélange contenant de la kétamine 10 mg / mL et de xylazine 1 mg / ml dans une solution saline normale, délivrée par voie intrapéritonéale. La dose standard de ce mélange est300 ul pour une souris de 30 g, ce qui équivaut à la Kétamine 100 mg / kg et de xylazine 10 mg / kg. Voir la section de discussion pour plus de détails concernant l'anesthésique injectable.
    3. Utilisez une manœuvre orteil de pincement pour déterminer la profondeur de l'anesthésie. Une souris anesthésiée adéquate ne se rétracte pas sa patte quand elle est légèrement pincé par le chirurgien.
    4. Appliquer une pommade oculaire pour éviter le dessèchement de la cornée.
    5. Administrer 1 mg / kg buprénorphine SR voie sous-cutanée.
      REMARQUE: Fournir une analgésie avant les résultats de la chirurgie dans le soulagement de la douleur supérieure.
    6. Au cours de la procédure, surveiller la fréquence respiratoire de la souris.
      NOTE: Une souris correctement anesthésiés sous isoflurane devrait avoir une fréquence respiratoire de 50 - 100 respirations / min. Une augmentation du rythme respiratoire indique que l'anesthésie est trop léger, tandis qu'un taux respiratoire diminué peut indiquer que l'anesthésie est trop profonde.
  2. Prep la peau de la face dorsale du crâne avec povidone-iodsolution ine suivie d'éthanol à 70% trois fois. Drapé avec des champs stériles, en laissant le site chirurgical exposé.
    NOTE: Porter des gants chirurgicaux stériles et maintenir une technique stérile pendant la procédure. Ne touchez des surfaces et des objets stériles tels que le champ stérile et les instruments autoclavés. Vous avez déjà un assistant ajuster l' éclairage, les paquets de suture ouverts, etc.
  3. 15 en utilisant un scalpel à lame, faire une incision médiane sagittal qui se prolonge sur la majeure partie de la boîte crânienne dorsale. En utilisant une pince fine à dents, retirer la peau sur le côté droit de l'incision pour exposer l'os pariétal droit.
  4. L'utilisation d'une perceuse avec un 4 mm bit trépan de forage diamanté autoclavé, percez un défaut à travers l'os pariétal. Ne pas prolonger le défaut osseux passé dans la couche dure-mère. (Figure 4)
  5. Placez un échafaudage dans le défaut, puis fermez l'incision de la peau avec l'exécution de suture en nylon.
  6. Surveiller la souris et de fournir la norme des soins postopératoires uneelon directives institutionnelles.
    1. Gardez la souris sur une serviette en papier propre à l'intérieur d'une cage propre alors qu'il récupère. Une moitié de la cage doit être placé sur une couverture de remise en circulation de l'eau chaude et la souris doit être initialement placé dans cette moitié.
    2. Ne laissez pas une souris sans surveillance jusqu'à ce qu'il ait repris connaissance suffisante pour déambuler. Ne retournez pas une souris qui a subi une intervention chirurgicale à une cage avec les autres souris jusqu'à ce qu'il soit complètement rétabli.
  7. Répéter les étapes ci-dessus avec une nouvelle souris pour chaque échafaudage qui doit être testé. Stériliser les instruments chirurgicaux entre les interventions chirurgicales utilisant un stérilisateur à billes chaud ou autre procédé approprié.
  8. Peu de temps après la procédure, puis à 2, 4, 6 et 8 semaines utiliser CT scan micro pour analyser le taux de fermeture de défaut calvarial.
    NOTE: Voir l'article de Levi et al. 6 pour une description de micro scanner de défauts calvaria.
  9. Lorsque l'expérience est complete, euthanasie les souris en les plaçant dans une chambre d'euthanasie propre et à partir d'un flux de gaz de dioxyde de carbone dans la chambre à un débit de 2 L / min. Après la respiration ont complètement cessé (après environ 10 min) effectuer la dislocation cervicale pour confirmer l'euthanasie.
  10. Eventuellement, après l'expérience est terminée, l'utilisation et tronçonnage coloration histologique pour évaluer la formation osseuse dans le défaut.
    NOTE: Voir l'article de McArdle et al. 12 pour les détails de la préparation de l' os spécimens pour l' histologie. Pour un examen des techniques histologiques et de coloration, voir un manuel histologique comme le manuel de pathologie chirurgicale 15.

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Résultats

Micro CT scan effectué le jour de la chirurgie montrera clairement le défaut du crâne. A cette époque, il n'y aura pas d'interposition dans le défaut de 4 mm. On obtient des analyses ultérieures au cours du temps afin de quantifier la taille du défaut au fil du temps par rapport à la ligne de base. Défauts ensemencés avec BMPR-IB cellules + devraient démontrer plus fermeture rapide du défaut par rapport à BMPR-IB- et les cellules non triées (figure 5). En outre, ...

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Discussion

Étapes critiques dans le Protocole

Lors de la récolte de ASCs, l'étape critique est la digestion adéquate de graisse avec de la collagénase. digestion inadéquate se traduira par un faible rendement de ASCs. Au cours de tri FACS de cellules BMPR-IB +, il est important de définir soigneusement la porte de positivité. Définition de portes trop lâche peut entraîner des populations triées qui ne sont pas pures. Lors de la création du défaut crânienne, il est essentiel pour percer le défaut dans ...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont aucune révélation à faire.

Remerciements

C.D.M. a été soutenu par la bourse de recherche des résidents de l’American College of Surgeons (ASC). M.S.H. a été soutenu par la subvention de formation clinique TG2-01159 du California Institute for Regenerative Medicine (CIRM). M.S.H., H.P.L. et M.T.L. ont été soutenus par l’American Society of Maxillofacial Surgeons (ASMS) et la Maxillofacial Surgeons Foundation (MSF). H.P.L. a été soutenu par une subvention R01 du NIH GM087609 et un don d’Ingrid Lai et Bill Shu en l’honneur d’Anthony Shu. H.P.L. et M.T.L. ont été soutenus par le Hagey Laboratory for Pediatric Regenerative Medicine et la Fondation Oak. M.T.L. a été soutenu par les subventions U01 HL099776, R01 DE021683-01 et RC2 DE020771. D.C.W. a été soutenu par la subvention NIH 1K08DE024269, le Hagey Laboratory for Pediatric Regenerative Medicine et le Faculty Scholar Award de l’Institut de recherche en santé infantile de l’Université Stanford.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Filtre à cellules 100 micronsFalcon352360
Scalpel à 15 lamesMiltex4-515
Plaque à 24 puitsCorning3524
Filtre à cellules 40 micronsFalcon352340
Tubes à centrifuger coniques de 50 mLFalcon352098
6-0 Suture en nylon Ethilon, 18", aiguille P-3, etc.Ethicon1698G
Anti-BMPR-IB Anticorps primaireR& D systemsFAB5051A
BioGel PI gants chirurgicauxMö ; lnlycke Soins de santéALA42675Z
Buprénorphine SRZooPharm
Castro-Viejo tourne-aiguilleFine Science Tools12565-14
CD1 souris nueCharles River086
Collagenase Type IIpoudre Gibco17101-015
DMEM mediumGibco10564-011
Perceuse : Couteau circulaire 4,0 mmXemax SurgicalCK40
Foret : Z500 Micromoteur sans balaisNSKNSKZ500
FBSGicbo10437-077
Fisherbrand Sous-tapis absorbants, 20 » x 24"Fisher Scientific14-206-62
Fisherbrand Tampon de gaze de coton stérile, 4 » x 4Fisher Scientific22-415-469
Coussin chauffantKent ScientificDCT-20
Hyclone 199/EBSS mediumGE  ; Sciences de la vieSH30253.01
Isothésie isofluraneHenry Schein  ;
Micro pince avec dentsRobozRS-5150
Micro pince avec dentsRobozRS-5150
Film de paraffine (Parafilm)BemisPM996
PBSGibco10010-023
Pen-StrepGibco15140-122
Échafaudages PLGAFormulation exclusive
Poloxamer 188, 10 %SigmaP5556-100ML
Champ stérile polyliné, 18 » x 24"Busse Hospital Disposables696Découper un trou rectangulaire de la taille appropriée
Polysaccharose Solution : Histopaque 1119Sigma11191
Povidone Iodine Prep SolutionMedlineMDS093944H
Puralube vaseline pommade ophtalmique, tube de 1/8 ozDechra Veterinary Products
Tampon de lyse RBCSigma11814389001
Webcol tampons de préparation à l’alcoolCovidien6818
"050033

Références

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Réimpressions et autorisations

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