Nous présentons une méthode pour l'isolement et la culture du canal de Wolff de la souris (WD). Nous démontrons également une procédure détaillée pour l'ensemble de l'immunocoloration mont de culture / WDs fraîchement isolés avec des anticorps marqués par fluorescence. Ensemble, ces techniques permettent l'étude du développement WD, enroulement, et la différenciation.
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Article de méthode
Organ Culture et Mont entiers immunofluorescence de souris Conduits Wolffian
Dans cet article
Résumé
Résumé
morphogenèse Tubal est une exigence fondamentale pour le développement de la plupart des organes de mammifères, y compris le système reproducteur masculin. L'épididyme, une partie intégrante de l'appareil reproducteur masculin, est responsable de la conservation de sperme, la maturation et le transport. L'épididyme adulte est un tube très enroulé qui se développe à partir d'un précurseur embryonnaire simple et droite connu comme canal de Wolff (WD). lovage correcte de l'épididyme est essentiel pour la fertilité masculine, comme le sperme dans les testicules sont incapables de féconder un ovocyte. Cependant, le mécanisme responsable du développement de l'épididyme et lovage reste incertaine, en partie à cause du manque de culture d'organes et d'imagerie méthodes entières. Dans cette étude, nous décrivons un système de culture in vitro et le protocole entier immunofluorescence mount pour mieux visualiser le processus de WD lovage et le développement, qui peut également être appliquée à l' étude d' autres organes tubulaires.
Introduction
Le système reproducteur mâle se compose essentiellement de testiculaire, le site pour le développement et la différenciation des cellules germinales et un système ductal complexe qui est nécessaire pour la maturation, le transport et le stockage du sperme. Épididyme est un organe tubulaire qui relie testis avec déférent et principalement impliquée dans le développement post-testiculaire et la maturation des cellules germinales 1. L'épididyme fortement enroulées de souris adulte se développe à partir d' un simple tube et droite précurseur, canal de Wolff (WD) 1. La structure complexe et enroulée du épididyme est essentiel pour les spermat....
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Protocole
Les soins et les procédures expérimentales ont été menées en conformité avec les directives du soin et du Comité d'éthique animale de l'Université de Newcastle et confirmé à la Loi sur Nouvelle-Galles du Sud animal recherche, Pays de Galles règlement Animal Research New South, et le code australien pour les soins et utiliser des animaux à des fins scientifiques. Toutes les procédures menées sur des souris ont été approuvées par le soin et Comité d'éthique animale de l'Université de Newcastle.
1. Time Mating
- Paire 6 - 8 semaines chez les souris femelles juste avant la fin du cycle de lumière du jour et mâle.
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Résultats
Au cours du développement, le WD subit des changements significatifs dans lequel un tube simple et droite se transforme en un conduit très complexe et enroulé. En utilisant des procédés décrits ci-dessus, WDs subissent une transformation similaire dans des conditions de culture. Ici , nous avons montré les résultats de WDs cultivés pendant 3 d (figure 3). Pour disséquer les mécanismes moléculaires impliqués dans la morphogenèse WD, le milieu de culture peut être complétée avec des inhibiteurs et des act.......
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Discussion
Le système de culture d'organe présente de nombreux avantages par rapport au système de culture cellulaire traditionnel. Ce système conserve les relations structurales originales et des interactions entre les différents types de cellules. Il imite dans des systèmes in vivo et donne des informations plus précises que les études de culture cellulaire , où le facteur de niche est absent. L'utilisation de systèmes de culture d'organes ont même des avantages par rapport à l'aide l'animal.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n'ont rien à dévoiler.
Remerciements
Nous tenons à remercier les membres du groupe d'oncologie gynécologique pour la lecture critique de ce manuscrit. Ce travail est en partie subventionnée par le Conseil australien de la recherche Conseil de recherches médicales de la Santé nationale et, et le cancer Institut NSW (PST). MK est un destinataire de l'Université de Newcastle Postgraduate Research Fellowship.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Des plaques à 24 puits | Corning, USA | 3524 | peuvent être achetées auprès d’autres vendeurs |
| Hank' s Balanced Salt Solution (HBSS) | GE Healthcare Life Sciences, USA | SH30031.02 | peut être acheté auprès d’autres fournisseurs |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium : Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12) | Sigma, USA | D8437 | Warm in 37 ° ; C bain-marie avant utilisation |
| Sérum fœtal bovin (FBS) | Interpath, ; Australie | SH30034.02 | 10 % FBS utilisé dans le milieu de culture |
| L-Glutamine | GE Healthcare Life Sciences, USA | SH30034.01 1 | % concentration utilisée |
| Pénicilline/Streptomycine | Gibco, USA | 15070-063 | 1 % concentration utilisée |
| Whatman Nuclepore Polycarbonate Track-Etch ; | Whatman, États-Unis | 110409 | Membrane (0,8 & micro ; m) |
| IWR1 | Sigma, États-Unis | 10161-5mg | 100 & micro ; Concentration M utilisé |
| Paraformaldéhyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences, USA | 15710 | 16 % stock, 4 % dans PBS pour utilisation. TOXIQUE - porter des gants et ne peut pas être jeté dans l’évier |
| Ethanol | Thermo Scientific Fisher, USA | 214-20L PL | Absolute, faire 25, 50 et 75 % avec de l’eau milliQ. |
| Tween-20 | Thermo Scientific Fisher, USA | 2509-500ml | Très visqueux, prudent lors de la distribution |
| Triton X-100 | Sigma, USA | T8787-50ml | Très visqueux, prudent lors de la distribution de |
| Di-Sodium Hydrogen Phosphate | Thermo Scientific Fisher, USA | 621-500mg | peut être acheté auprès d’autres vendeurs |
| Sodium Di-hydrogen Phosphate | Ajax Finechem, USA | 4745-500g | peut être acheté auprès d’autres fournisseurs |
| Chlorure de sodium | Thermo Scientific Fisher, USA | 465-500g | peut être acheté auprès d’autres fournisseurs |
| Cytokératine8/Troma I | Developmental Studies Hybridoma Bank, États-Unis (DHSB) | TROMA-I | 1:250 dans le tampon de blocage |
| actif &beta ; caténine ; | Technologie de signalisation cellulaire, ; USA | D13A1 | 1:200 dans le tampon de blocage |
| phospho-Histone 3 | Millipore, MA, USA | 06-570 | 1:200 dans le tampon de blocage |
| Alexa488 Chèvre anti-lapin IgG | Jackson ImmunoResearchLabs, ; États-Unis | 111-545-047 | 1:250 dans le tampon de blocage |
| Alexa594 IgG anti-rat de chèvre | Jackson ImmunoResearchLabs, ; USA | 112-585-072 | 1:250 in tampon bloquant |
| Glycerol | Thermo Fisher Scientific, USA | 242-500ml | peut être acheté auprès d’autres vendeurs |
| n-Propyl galate | Sigma, USA | 2370-2 | |
| -(4-amidinophenyl)-1H -indole-6-carboxamidine (DAPI) | Sigma, USA | D9564-10mg | Utiliser pour colorer les acides nucléiques (ADN) |
| Diméthyl sulfoxyde (DMSO) | Thermo Fisher Scientific, États-Unis | 2225-500ml | Feuilles de recouvrement de solvant |
| (24 x 50 mm) | Lomb Scientific | CS24501GP | - |
Références
- Joseph, A., Yao, H., Hinton, B. T. Development and morphogenesis of the Wolffian/epididymal duct, more twists and turns. Dev Biol. 325, 6-14 (2009).
- Murashima, A., Xu, B., Hinton, B. T. Understanding normal and abnormal develop....
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Réimpressions et autorisations
