Organ Culture et Mont entiers immunofluorescence de souris Conduits Wolffian

Résumé

Nous présentons une méthode pour l'isolement et la culture du canal de Wolff de la souris (WD). Nous démontrons également une procédure détaillée pour l'ensemble de l'immunocoloration mont de culture / WDs fraîchement isolés avec des anticorps marqués par fluorescence. Ensemble, ces techniques permettent l'étude du développement WD, enroulement, et la différenciation.

Résumé

morphogenèse Tubal est une exigence fondamentale pour le développement de la plupart des organes de mammifères, y compris le système reproducteur masculin. L'épididyme, une partie intégrante de l'appareil reproducteur masculin, est responsable de la conservation de sperme, la maturation et le transport. L'épididyme adulte est un tube très enroulé qui se développe à partir d'un précurseur embryonnaire simple et droite connu comme canal de Wolff (WD). lovage correcte de l'épididyme est essentiel pour la fertilité masculine, comme le sperme dans les testicules sont incapables de féconder un ovocyte. Cependant, le mécanisme responsable du développement de l'épididyme et lovage reste incertaine, en partie à cause du manque de culture d'organes et d'imagerie méthodes entières. Dans cette étude, nous décrivons un système de culture in vitro et le protocole entier immunofluorescence mount pour mieux visualiser le processus de WD lovage et le développement, qui peut également être appliquée à l' étude d' autres organes tubulaires.

Introduction

Le système reproducteur mâle se compose essentiellement de testiculaire, le site pour le développement et la différenciation des cellules germinales et un système ductal complexe qui est nécessaire pour la maturation, le transport et le stockage du sperme. Épididyme est un organe tubulaire qui relie testis avec déférent et principalement impliquée dans le développement post-testiculaire et la maturation des cellules germinales ^1. L'épididyme fortement enroulées de souris adulte se développe à partir d' un simple tube et droite précurseur, canal de Wolff (WD) ^1. La structure complexe et enroulée du épididyme est essentiel pour les spermatozoïdes d'acquérir la capacité de fertiliser les cellules germinales femelles ^2. Comment un tel organe essentiel pour la fertilité masculine se développe et se retrouve dans la forme ne sont pas bien compris. Diverses voies de signalisation ont été révélés être impliqués dans le développement de WD telles que la voie de signalisation Wnt ^3,4 et la voie ⁵ de signalisation des androgènes. Nos travaux récents ont mis en place l'exigence de balbrée signalisation Wnt pour WD lovage au cours du développement prénatal ^4. Toutefois, d'autres études sont nécessaires pour comprendre les mécanismes impliqués dans postnatale lovage épididymaire, la différenciation cellulaire, et la communication de cellule à cellule dans l'épithélium de l'épididyme et avec des cellules interstitielles.

Modèles de souris génétiquement modifiées ont été révélés être un outil puissant pour l' identification / validation des mécanismes moléculaires sous - jacents du développement et de la maladie de divers systèmes d'organes ^6. En dépit de son utilisation intensive, il y a des limites importantes de modèles de souris génétiquement modifiés, y compris le phénotype unpredicted de mutants de souris ciblés en ce qui concerne la fonction présumée du gène, et aucun phénotype mutants nuls dans certains modèles, l'influence des facteurs génétiques et environnementaux, de main-d'œuvre et temps processus de développement des modèles de souris. Par conséquent, l'interprétation de la signification des résultats seulement de génétiquement modifiésmodèles de souris fiés est pas toujours simple ^6. Ces limitations peuvent être surmontées en utilisant dans le système de culture d'organe in vitro qui nous donne la souplesse nécessaire pour manipuler les multiples voies de signalisation en temps réel dans des conditions de culture contrôlées. Système de culture d'organes joue un rôle dans la compréhension de la physiologie et de la pathologie des organes entiers ^7. En outre, l' imagerie d'organes entiers colorés avec des anticorps fluorophores marqués nous permet de visualiser les marqueurs d'intérêt dans un contexte tridimensionnel, tel qu'il existe in vivo, fournissant ainsi une meilleure compréhension de la forme de l'organe, la structure et la fonction ^8.

Ici, nous avons décrit les méthodes d'isolement des souris crêtes gonadiques embryonnaires, la culture in vitro et toute la montagne immunofluorescence imagerie de WDs, qui peuvent être appliquées pour répondre à une variété de questions relatives à la morphogenèse des organes tubulaires tels que WDS. Dans ce protocole, nousisolées souris embryonnaires crêtes urogénitales de 15,5 jours après le coït (dpc) barrages enceintes et les cultivées pendant 3 jours, suivi par immunocoloration pour un marqueur des cellules épithéliales (cytokératine 8, CK8), un marqueur de prolifération cellulaire (phospho-histone 3, PH3) et active βcatenin.

Protocole

Les soins et les procédures expérimentales ont été menées en conformité avec les directives du soin et du Comité d'éthique animale de l'Université de Newcastle et confirmé à la Loi sur Nouvelle-Galles du Sud animal recherche, Pays de Galles règlement Animal Research New South, et le code australien pour les soins et utiliser des animaux à des fins scientifiques. Toutes les procédures menées sur des souris ont été approuvées par le soin et Comité d'éthique animale de l'Université de Newcastle.

1. Time Mating

1. Paire 6 - 8 semaines chez les souris femelles juste avant la fin du cycle de lumière du jour et mâle.
2. Vérifiez les femelles pour la présence de bouchons vaginaux tôt le matin (ou avant 08h00), tous les jours. Jour de la prise est considérée comme 0,5 dpc.
3. Transférer la femelle avec bouchon vaginal dans une nouvelle cage (sans mâle) et l'étiquette de la date de prise.

2. Isolement de souris embryonnaires gonadiques Ridges

1. Isoler embryon de sourisic crêtes gonadiques de 15,5 dpc les femmes enceintes comme décrit dans ^9, avec quelques modifications , comme décrit ci - dessous.
2. Effectuer la dissection avant midi que le temps des femmes enceintes sont considérées comme d'entrer dans le lendemain de la grossesse, l'après-midi.
3. Sacrifiez 15,5 dpc femmes enceintes à l'aide de la dislocation cervicale (ou selon le protocole approuvé par le Comité d'éthique animale institutionnelle).
4. Gardez la souris sur le dos sur du papier de soie absorbant et pulvériser la face ventrale de l'abdomen avec 70% d'éthanol.
5. Soulever la peau abdominale inférieure (face ventrale) avec une pince et faire une incision latérale en utilisant des ciseaux chirurgicaux, allant de l'ouverture urogénitale à la fin de la cage thoracique. Tirez la peau vers la tête de l'animal afin d'exposer l'abdomen.
6. Couper les muscles abdominaux avec des ciseaux chirurgicaux pour exposer la cavité péritonéale. Prenez l'utérus gravide avec une pince juste au-dessus du col et faire une coupe. Maintenant soulevez l'utérus en se tenant to la vessie et découper le ligament large de l'utérus, suivi par des coupures au niveau des jonctions utéro pour détacher l'utérus de la fixation péritonéale.
7. Transférer l'utérus dans un tube de 50 ml contenant de la glace froide HBSS (solution saline équilibrée de Hank). Laver l'utérus gravide doucement avec glacée HBSS pour éliminer l'excès de sang.
8. Gardez l'utérus dans une boîte de Pétri contenant de la glace-froid HBSS et garder sur la glace. Couper la paroi utérine et enlever les embryons. Garder les embryons dans une boîte de Petri frais avec HBSS sur la glace.
9. Prenez un mouchoir en papier propre et stérile et le mettre sur une nouvelle boîte de Pétri. Vaporiser éthanol à 70% sur le papier de soie. Gardez l' embryon sur ce papier de soie sur le côté latéral et le couper du bas - ventre à l' aide d' une lame stérile dans la direction indiquée par la ligne pointillée sur la figure 1.
10. Fixer l'embryon sur une base éponge stérile en épinglant la colonne vertébrale.
11. Placez-le sous le stéréomicroscope disséquant et découpez soigneusement le long de la ligne médiane ventrale. Retirer le foie et les intestins. Le système urogénital de la souris (rein, uretère, testiculaires, WD et déférent) doit maintenant être visible.
12. Découpez le testicule et WD, et de garder dans une boîte de Petri frais avec HBSS, sur la glace. Pour retirer le WD et testiculaire, couper les canaux déférents à proximité de son attachement à l'urètre et couper la fixation de la partie inférieure de WD de gubernaculum.
13. Réunir les testicules et WDs à partir des embryons d'un même groupe (cela peut varier selon le plan expérimental).

3. Culture Embryonnaire gonadique Ridges (Figure 2)

1. Préparer le milieu pour cultiver les crêtes génitales d'embryons en complétant DMEM / F12 avec 10% de FBS (sérum bovin fœtal), 1% de pénicilline / streptomycine et 1% de L-glutamine. Réchauffez les médias à 37 ° C dans un bain d'eau.
2. Ajouter 300 ul de milieu par puits d'une plaque de culture cellulaire à 24 puits.
3. Prenez une boîte de Pétri fraîche et mettre une petite goutte de HBSS stérile sur elle. Mettez une membrane piste de polycarbonate de gravure (0,881; m) sur cette goutte de HBSS avec sa surface brillante face à la HBSS.
4. Utiliser une pince propre mis deux WDs et gonades sur la membrane (sur sa surface rugueuse, orientée vers le haut) et retirer le montant maximum de HBSS en utilisant des lingettes stériles / papier absorbant. Ne pas toucher le tissu avec du papier absorbant; sinon, il risque d'endommager le tissu.
5. Veiller à ce que ni les WDs ni les gonades se touchent. Sinon, ils vont coller ensemble pendant une incubation ultérieure.
6. Transférer la membrane avec les tissus dans le puits d'une plaque à 24 puits contenant 300 pi de milieu de culture et de leur culture à l'interface air-milieu. Trop de milieu de culture sur membranes se traduit par une croissance kystique WDS.
7. Incuber la plaque à 37 ° C incubateur en présence de 5% de CO _2.
8. Changer le milieu de culture tous les jours. Pour modifier le milieu avec la pipette, éliminer le milieu du puits d'abord, puis ajouter 300 ul du milieu frais préchauffée.
   Remarque:Pour étudier l'effet de différentes voies de signalisation sur la morphogenèse WD, activateurs et / ou des inhibiteurs chimiques aux concentrations requises peuvent être ajoutés au milieu de culture.
9. Culture des tissus pour 3 d. Dans 3 d, WDs spiralées recueillies à partir d' un embryon dpc 15.5 se transforment en tubes très alambiquées (figure 3B). L'ajout de l'inhibiteur de Wnt, IWR1, se traduit par une inhibition de WD enroulant (figure 3C).
10. Pour la récolte de ces tissus prennent une boîte de Pétri avec du PBS glacé. Transférer la membrane avec gonades cultivé et WD dans la boîte de Pétri. La membrane flottera sur le PBS. Appuyez sur la membrane pour le couler dans du PBS et prendre la gonade et WD.
11. Fixer les tissus avec 4% de paraformaldehyde (PFA) O / N à 4 ° C ou pendant 1 h à température ambiante. Si nécessaire, prendre des images lumineuses des WDs sur le terrain avant la fixation.

4. Whole immunofluorescence Mont

1. Laver les tissus fixés 3x avec du PBS-T (PBS + 1%Triton X-100) avec basculement lent, 10 minutes chacun, à la température ambiante.
2. Déshydrater les tissus dans une série graduée d'éthanol (25%, 50%, 75% et 100%), 10 minutes à chaque fois à 4 ° C, avec une bascule lente (~ 30 min). A ce stade, les tissus peuvent être stockés à 4 ° C dans 75% d'éthanol.
   1. Pour changer l'éthanol, garder les tissus intacts pendant 2 min et laisser les tissus se calment. Retirez autant surnageant que possible, puis ajouter la prochaine concentration plus élevée d'éthanol. Pour éviter tout dommage aux tissus, la pointe de la pipette ne doit pas toucher les tissus à tout moment.
3. À la suite de la déshydratation, réhydrater les tissus dans une série graduée d'éthanol (100%, 75%, 50% et 25%), 10 minutes à chaque fois à 4 ° C avec balancement lent.
4. Laver les tissus avec du PBS-T (PBS + 0,1% de Triton X-100), 4x, 20 minutes à chaque fois, à température ambiante, sous légère bascule (~ 30 min).
5. Bloquer les tissus pendant 1 h à température ambiante avec un tampon de blocage (PBS + 1% BSA + 0,2% de lait en poudre écrémé en poudre + 0,3% de Triton X-100).
6. after bloquant, transférer les tissus à une solution d'anticorps primaire (dilué dans un tampon de blocage) et incuber O / N à 4 ° C avec doux balancement (~ 30 rpm). Les dilutions des anticorps primaires utilisés sont décrits dans le tableau des matériaux.
7. Le lendemain, lavez les tissus avec du PBS-MT (PBS + 2% de lait écrémé en poudre sèche + 0,5% de Tween-20), 4x, 30 minutes chacun, à la température ambiante, avec doux balancement (~ 30 rpm).
8. Après cette étape de lavage, ajouter un anticorps secondaire à une dilution de 1: 250 (cette étape a besoin d'optimisation pour les anticorps individuels) dans un tampon de blocage et incuber pendant 1 h à température ambiante, avec doux balancement.
9. A partir de maintenant garder partir des tissus recouverts d'une feuille d'aluminium pour empêcher l'exposition à la lumière que les anticorps secondaires sont marqués avec des fluorophores sensibles à la lumière.
10. Laver les tissus 3x avec du PBS-T (PBS + 0,1% de Tween-20), 30 min chacun, avec doux balancement.
11. Préparer des lames pour le montage des tissus colorés.
    1. Pour cela, couper les lamelles de verreen fines lamelles à l'aide d'un stylo à diamant et coller deux bandes l'une sur l'autre sur la lame de verre en utilisant le vernis à ongles. Faire deux lieux tissus frontières et entre ces deux limites.
    2. Ajouter DAPI contenant un milieu de montage et mis sur une lamelle. Appliquer le vernis à ongles dans les coins de la lamelle pour le fixer à la diapositive.
       Remarque: Les tissus sont maintenant prêts pour l'imagerie. Conservez ces diapositives à -20 ° C.

Résultats

Au cours du développement, le WD subit des changements significatifs dans lequel un tube simple et droite se transforme en un conduit très complexe et enroulé. En utilisant des procédés décrits ci-dessus, WDs subissent une transformation similaire dans des conditions de culture. Ici , nous avons montré les résultats de WDs cultivés pendant 3 d (figure 3). Pour disséquer les mécanismes moléculaires impliqués dans la morphogenèse WD, le milieu de culture peut être complétée avec des inhibiteurs et des act...

Discussion

Le système de culture d'organe présente de nombreux avantages par rapport au système de culture cellulaire traditionnel. Ce système conserve les relations structurales originales et des interactions entre les différents types de cellules. Il imite dans des systèmes in vivo et donne des informations plus précises que les études de culture cellulaire , où le facteur de niche est absent. L'utilisation de systèmes de culture d'organes ont même des avantages par rapport à l'aide l'animal...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Des plaques à 24 puits	Corning, USA	3524	peuvent être achetées auprès d’autres vendeurs
Hank' s Balanced Salt Solution (HBSS)	GE Healthcare Life Sciences, USA	SH30031.02	peut être acheté auprès d’autres fournisseurs
Dulbecco’s Modified Eagle Medium : Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12)	Sigma, USA	D8437	Warm in 37 ° ; C bain-marie avant utilisation
Sérum fœtal bovin (FBS)	Interpath,  ; Australie	SH30034.02	10 % FBS utilisé dans le milieu de culture
L-Glutamine	GE Healthcare Life Sciences, USA	SH30034.01 1	% concentration utilisée
Pénicilline/Streptomycine	Gibco, USA	15070-063	1 % concentration utilisée
Whatman Nuclepore Polycarbonate Track-Etch  ;	Whatman, États-Unis	110409	Membrane (0,8 & micro ; m)
IWR1	Sigma, États-Unis	10161-5mg	100 & micro ; Concentration M utilisé
Paraformaldéhyde (PFA)	Electron Microscopy Sciences, USA	15710	16 % stock, 4 % dans PBS pour utilisation. TOXIQUE - porter des gants et ne peut pas être jeté dans l’évier
Ethanol	Thermo Scientific Fisher, USA	214-20L PL	Absolute, faire 25, 50 et 75 % avec de l’eau milliQ.
Tween-20	Thermo Scientific Fisher, USA	2509-500ml	Très visqueux, prudent lors de la distribution
Triton X-100	Sigma, USA	T8787-50ml	Très visqueux, prudent lors de la distribution de
Di-Sodium Hydrogen Phosphate	Thermo Scientific Fisher, USA	621-500mg	peut être acheté auprès d’autres vendeurs
Sodium Di-hydrogen Phosphate	Ajax Finechem, USA	4745-500g	peut être acheté auprès d’autres fournisseurs
Chlorure de sodium	Thermo Scientific Fisher, USA	465-500g	peut être acheté auprès d’autres fournisseurs
Cytokératine8/Troma I	Developmental Studies Hybridoma Bank, États-Unis (DHSB)	TROMA-I	1:250 dans le tampon de blocage
actif &beta ; caténine  ;	Technologie de signalisation cellulaire,  ; USA	D13A1	1:200 dans le tampon de blocage
phospho-Histone 3	Millipore, MA, USA	06-570	1:200 dans le tampon de blocage
Alexa488 Chèvre anti-lapin IgG	Jackson ImmunoResearchLabs,  ; États-Unis	111-545-047	1:250 dans le tampon de blocage
Alexa594 IgG anti-rat de chèvre	Jackson ImmunoResearchLabs,  ; USA	112-585-072	1:250 in tampon bloquant
Glycerol	Thermo Fisher Scientific, USA	242-500ml	peut être acheté auprès d’autres vendeurs
n-Propyl galate	Sigma, USA	2370-2
-(4-amidinophenyl)-1H -indole-6-carboxamidine (DAPI)	Sigma, USA	D9564-10mg	Utiliser pour colorer les acides nucléiques (ADN)
Diméthyl sulfoxyde (DMSO)	Thermo Fisher Scientific, États-Unis	2225-500ml	Feuilles de recouvrement de solvant
(24 x 50 mm)	Lomb Scientific	CS24501GP	-