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Article de méthode

Système d'expression multigène médié par l'ARN T7 à ADN polymère induible, pMGX

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⸱

DOI :

10.3791/55187

⸱

27 juin 2017

 ,  ,  , 
1Department of Chemistry and Biomolecular Sciences, University of Ottawa, 2School of Biosciences, The University of Nottingham Malaysia Campus

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Cette étude décrit des méthodes pour la co-expression médiée par T7 de plusieurs gènes à partir d'un seul plasmide dans Escherichia coli en utilisant le système de plasmide pMGX.

Résumé

La co-expression de protéines multiples est de plus en plus essentielle pour la biologie synthétique, l'étude des complexes protéines-protéines, et la caractérisation et l'atténuation des voies de biosynthèse. Dans ce manuscrit, on décrit l'utilisation d'un système hautement efficace pour la construction d'opérons synthétiques multigènes sous le contrôle d'une ARN polymérase T7 inducible. Ce système permet d'exprimer plusieurs gènes simultanément à partir d'un plasmide. Ici, un ensemble de quatre vecteurs apparentés, pMGX-A, pMGX-hisA, pMGX-K et pMGX-hisK, avec le marqueur sélectionnable par résistance à l'ampicilline ou à la kanamycine (A et K) et possédant ou n'ayant pas d'hexahistidine N-terminale Tag (son) est divulgué. Des protocoles détaillés pour la construction d'opérons synthétiques utilisant ce système vectoriel sont fournis avec les données correspondantes, montrant qu'un système à base de pMGX contenant cinq gènes peut être facilement construit et utilisé pour produire les cinq protéines codées dans Escherichia coli . Ce systèmeEm et le protocole permet aux chercheurs d'exprimer systématiquement des modules et des chemins multi-composants complexes dans E. coli .

Introduction

La co-expression de multiples protéines est de plus en plus essentielle, en particulier dans les applications de biologie synthétique, où plusieurs modules fonctionnels doivent être exprimés 1 ; Dans l'étude des complexes protéine-protéine, où l'expression et la fonction nécessitent souvent une co-expression 2 , 3 ; Et dans la caractérisation et l'exploitation des voies de biosynthèse, où chaque gène dans la voie doit être exprimé 4 , 5 , 6 , 7 , 8 . Un certain nombre de systèmes ont été développés pour la co-expression, en particulier dans l'organisme hôte Escherichia coli , le cheval de travail pour l'expression de protéines recombinantes en laboratoire 9 . Par exemple, de multiples plasmides avec différents marqueurs sélectionnables peuvent être utilisés pour exprimer des protéines individuelles en utilisant une multitude d'ex différents Vecteurs de pression 10 , 11 . Des systèmes plasmidiques simples pour une expression de protéines multiples ont utilisé soit des promoteurs multiples pour contrôler l'expression de chaque gène 10 , 12 ; Opérons synthétiques, où plusieurs gènes sont codés sur une seule transcription 2 , 13 ; Ou, dans certains cas, un seul gène codant pour un polypeptide qui est finalement transformé de façon protéolytique, donnant les protéines désirées d'intérêt 14 .

figure-introduction-1
Figure 1: flux de travail pMGX montrant la construction d'un vecteur polycistronique. Le système pMGX offre une stratégie flexible et facile à utiliser pour la construction d'opérons synthétiques sous le contrôle d'un promoteur T7 inducible.E.com/files/ftp_upload/55187/55187fig1large.jpg "target =" _ blank "> Cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Dans ce manuscrit, on décrit l'utilisation d'un système très efficace pour la construction d'opérons synthétiques multigène sous le contrôle d'une ARN polymérase T7 induite ( figure 1 ). Ce système permet d'exprimer plusieurs gènes simultanément à partir d'un plasmide. Il est basé sur un système plasmide, initialement appelé pKH22, qui a été utilisé avec succès pour un certain nombre d'applications différentes 6 , 7 , 8 . Ici, ce jeu de plasmide est développé pour inclure quatre vecteurs apparentés: pMGX-A, un vecteur d'expression dépourvu de marqueurs C ou N-terminaux et avec le marqueur de résistance à l'ampicilline; PMGX-hisA, un vecteur d'expression codant une étiquette d'hexahistidine N-terminal et avec le marqueur de résistance à l'ampicilline; PMGX-K, un vecteur d'expression lAvoir des marqueurs C ou N-terminaux et avec le marqueur de résistance à la kanamycine; Et pMGX-hisK, un vecteur d'expression codant une étiquette d'hexahistidine N-terminal et avec le marqueur de résistance à la kanamycine. Dans cette étude, le procédé de génération d'un vecteur polycistronique contenant cinq gènes utilisant le système pMGX, en particulier pMGX-A, est démontré avec la production réussie de chaque protéine individuelle dans Escherichia coli .

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Protocole

1. Obtention de gènes d'intérêt

  1. Concevoir des gènes synthétiques.
    1. Optimiser une séquence de gènes pour l'expression de E. coli .
    2. Supprimez tous les sites de restriction problématiques de la séquence (AvrII, NdeI, EcoRI et XbaI).
    3. Incorporer des sites de restriction pour le clonage; Un site 5'-NdeI et un site 3'-EcoRI sont recommandés. D'autres sites peuvent être utilisés, si nécessaire; Se référer à la région de multiclonation du plasmide sélectionné ( Figure S1 -S4 ). Si vous le souhaitez, incluez une étiquette de codage 5 'ou 3' pour la détection Western Blot.
    4. Commandez commercialement le gène conçu.
    5. L'un ou l'autre clone clone le gène en un vecteur émoussé en utilisant un kit de clonage brutal, conformément aux instructions du fabricant; Concevoir des amorces pour amplifier le gène (puis passer à l'étape 1.2.2); Ou ajouter des extrémités 5 'et 3' supplémentaires pour le clonage direct dans un plasmide pMGX et passer à l'étape 2. Ici, leLes résultats représentatifs proviennent du clonage brutal des gènes d'intérêt.
  2. Amplifier le gène souhaité (à partir d'un gène synthétique conçu et optimisé ou d'un ADN modèle contenant le gène désiré) 15 .
    1. Concevoir des amorces avec des sites de restriction pour le clonage; Un site 5'-NdeI et un site 3'-EcoRI sont recommandés. D'autres sites peuvent être utilisés, si nécessaire; Se référer à la région de multiclonation du plasmide sélectionné ( Figure S1 -S4 ). Si vous le souhaitez, incluez une étiquette de codage 5 'ou 3' pour la détection Western Blot.
    2. La PCR amplifie le gène désiré 15 .
    3. Analyser la PCR par électrophorèse sur gel d'agarose 16 .
    4. S'il existe une amplification non spécifique, nettoyer le gène amplifié par extraction au gel. Sinon, utilisez un kit de nettoyage enzymatique.
    5. Quantifier l'ADN en utilisant un spectrophotomètre en vérifiant l'absorbantE à 260 nm; Blanc avec tampon d'élution 17 .

2. Clonage de gènes d'intérêt dans un vecteur de système d'expression multigène, pMGX 18

  1. La restriction digère le gène obtenu d'intérêt et le vecteur désiré, pMGX, avec NdeI et EcoRI.
    REMARQUE: Si une grande quantité de plasmides recirculés est obtenue, la réaction NdeI doit se poursuivre pendant 1 h avant d'ajouter EcoRI.
    1. Utilisez une réaction de digestion de 40 μl contenant 0,5-1,5 μg d'ADN et 1 μL de chaque enzyme avec 4 μL du tampon 10x approprié.
    2. Pour un résumé NdeI et EcoRI, utilisez un tampon EcoRI et commencez par ajouter de l'endonucléase NdeI. Digest pendant 1 heure à 37 ° C. Ensuite, ajoutez l'endonucléase EcoRI, et permettez au produit digeste de continuer une heure supplémentaire. NdeI est sensible aux clivages proches de la fin de l'ADN, de sorte que la digestion initiale par EcoRI peut empêcher une digestion efficace par NdeI.
  2. ElectrOmettre la digestion de restriction sur gel d'agarose (pour un gène de 1 kb, utiliser un gel d'agarose à 0,7% à 110 V pendant 55 minutes, pour sélectionner le pourcentage de gel d'agarose pour différentes tailles de gènes, se référer à la référence 16 .
  3. Insertion d'accise et bandes de vecteurs en utilisant un scalpel propre ou une lame de rasoir et placez le segment de gel excisé dans un tube de 1,5 ml.
  4. Extraire l'ADN du gel d'agarose en utilisant un kit d'extraction de gel selon le protocole du fabricant.
  5. Relier le gène d'intérêt dans le vecteur pMGX en utilisant un rapport insert-vecteur 3: 1; Mettre en place une ligature négative de pMGX digérée sans l'insert.
    1. Mettre en place une réaction de ligature de 20 μl contenant 1 μl d'ADN ligase T4, 0,15-0,5 μg d'ADN vecteur (~ 5 μL) et une quantité appropriée d'insert basée sur un rapport insert-vecteur 3: 1 et la taille de Le gène étant inséré; Les backbones pMGX sont entre 5 311 et 5 504 pb. Inclure une réaction de contrôle négatif qui contient tout buT le gène étant inséré. Assurez-vous que la quantité d'ADN vectoriel est équivalente dans la ligature de contrôle négative et les réactions de ligature vectorielle plus de ligature.
  6. Les réactions de ligature de transformation dans des cellules de E. coli chimiquement compétentes XL1-Blue et des plasmides ligaturés pMGX- yfg1 (contenant le gène d'intérêt 1), pMGX- yfg2 (contenant le gène d'intérêt 2) ... pMGX- yfgn (contenant le gène d'intérêt n). Utiliser une technique aseptique (à l'intérieur d'une armoire à biosécurité ou sous une flamme).
    1. Décongeler 100 μl d'aliquotes de XL1-Blue E. coli chimiquement compétent sur de la glace pendant 5 min, puis ajouter 5 μL des réactions de ligature. Incuber pendant 30 minutes sur de la glace.
    2. Choc de chaleur les cellules pendant 45 s dans un bain d'eau maintenu à 42 ° C, puis ajouter 200 μL de LB froide. Incuber les sur glace pendant 2 min.
    3. Agiter les cellules à 37 ° C, 220 tr / min pendant 1 h, puis étaler la plaque 100 μL sur une plaque de LB-agar contenant un approMarqueur sélectionnable approprié (ampicilline ou kanamycine).
  7. Écran des clones pour les transformants positifs.
    1. Comparez le nombre de colonies sur les plaques de contrôle négatif et de ligature. Un rapport de comptage de colonie supérieur à 1: 2 est désiré. S'il y a un grand nombre de colonies sur la plaque témoin négative, revenez à l'étape 2.1 et passez en revue la note.
    2. Sélectionnez 4-8 colonies individuelles (selon le témoin négatif: rapport de ligature) de chaque réaction de ligature des différents gènes insérés pour le dépistage (1 n) et inoculez un LB de 4 mL et une culture de nuit appropriée d'antibiotiques / colonie individuelle. Cultiver des cultures pendant la nuit avec agitation à 37 ° C et 220 tr / min.
    3. Isoler l'ADN plasmidique en utilisant un kit d'isolation d'ADN plasmidique selon le protocole du fabricant.
    4. Mettre en place une réaction de digestion de 20 μL NdeI + EcoRI contenant 150-500 ng d'ADN et 1 μL de chaque enzyme avec 2 μL du tampon 10x approprié. Dans leEst un cas, ajoute NdeI et EcoRI en même temps que le gène d'intérêt sera entre les sites de restriction. Un contrôle négatif avec le vecteur pMGX vide est recommandé. Digérer pendant 2 h à 37 ° C dans un bain-marie.

3. Insertion du gène 2 dans le vecteur pMGX contenant le gène 1, pMGX- yfg1

  1. Restriction digest pMGX- yfg1 avec AvrII et traiter avec la phosphatase intestinale du veau (CIP).
    1. Utilisez une réaction de digestion de 40 μl contenant 0,5-1,5 μg d'ADN vectoriel (~ 5-10 μl d'ADN isolé) et 1 μL d'AvrII avec 4 μL du tampon 10x approprié. Digérer pendant 1,5 h à 37 ° C puis ajouter 1,5 μL de CIP. Laissez-le à 37 ° C pendant 30 minutes supplémentaires.
  2. Restriction digest pMGX- yfg2 avec AvrII et XbaI pour libérer le gène d'intérêt.
    1. Utilisez une réaction de digestion de 40 μl contenant 0,5-1,5 μg d'ADN et 1 μ; L de chaque enzyme avec 4 μL du tampon 10x approprié. Digest pendant 2 h à 37 ° C.
  3. La restriction d'électrophorèse digère un gel d'agarose (0,7%) approprié et accise les bandes d'insertion et de vecteur à l'aide d'un scalpel propre / lame de rasoir (voir les étapes 2.2-2.3).
  4. Extraire l'ADN en utilisant un kit d'extraction de gel selon le protocole du fabricant et quantifier l'ADN 17 .
  5. Le gène de ligature 2 en pMGX- yfg1 en utilisant un rapport insert-vecteur 3: 1. Configurez une ligature négative de pMGX- yfg1 digérée sans l'insert supplémentaire. Configurez comme ci-dessus à l'étape 2.5.
  6. Transforme 5 μL des réactions de ligature en cellules E. coli chimiquement compétentes XL1-Blue, plasmides ligaturés pMGX- yfg1,2 (contenant le gène d'intérêt 1 et 2) et le contrôle négatif de pMGX- yfg1 , comme on le voit à l'étape 2.6.
  7. Comparez le nombre de colonies sur les plaques de contrôle négatif et de ligature. Un rapport de comptage de colonie gUn compteur de 1: 2 est désiré. S'il y a un grand nombre de colonies sur la plaque témoin négative, revenez à l'étape 3.1 et révisez le traitement CIP.
  8. Sélectionnez 4-8 colonies individuelles (selon le témoin négatif: rapport de ligature) de la réaction de ligature et inocule 4 mL de LB plus l'antibiotique approprié par colonie individuelle et passez une nuit à 37 ° C et 220 tr / min.
  9. Isoler l'ADN plasmidique en utilisant un kit d'isolation d'ADN plasmidique selon le protocole du fabricant et quantifier l'ADN 17 .
  10. Taper l'insertion effective du second gène en effectuant un résumé de restriction de pMGX- yfg1,2 avec EcoRI.
    1. Utilisez une réaction de digestion de 20 μl contenant 150 à 500 ng d'ADN et 1 μl d'enzyme EcoRI avec 2 μL de tampon EcoRI 10x. Digest pendant 2 h à 37 ° C.
  11. Électrophorèse la digestion de restriction sur un pourcentage approprié de gel d'agarose; Recherchez un groupe qui correspondS à la taille du gène 2 (voir l'étape 2.2). Un gène peut s'insérer dans le vecteur dans l'orientation inverse non souhaitée.

4. Ajout d'un troisième gène dans le vecteur pMGX contenant les gènes 1 et 2, pMGX- yfg1,2

  1. Restriction digest pMGX- yfg1,2 avec AvrII et traiter avec CIP, comme indiqué à l'étape 3.1.
  2. Restriction digest pMGX- yfg3 avec AvrII et XbaI, comme on le voit à l'étape 3.2.
  3. Électrophorèse les digestion de restriction sur un pourcentage approprié de gel d'agarose et d'insertion et de bandes vectorielles à l'aide d'un scalpel propre / lame de rasoir; Se reporter aux étapes 2.2-2.3.
  4. Extraire l'ADN du gel d'agarose en utilisant un kit d'extraction de gel et quantifier l'ADN 17 .
  5. Le gène de ligature 3 en pMGX- yfg1,2 en utilisant un rapport d'insert-vecteur 3: 1 et a mis en place une ligation négative de pMGX- yfg1,2 digérée sans insertion supplémentaire, comme on le voit à l'étape 3.5.
  6. Transformer 5 μL des réactions de ligature en XLDes cellules de E. coli chimiquement compétentes de 1-Blue, le plasmide ligaturé pMGX- yfg1,2,3 (contenant les gènes d'intérêt 1, 2 et 3) et le contrôle négatif de pMGX- yfg1,2 , comme on le voit à l'étape 2.6.
  7. Comparez le nombre de colonies sur les plaques de contrôle négatif et de ligature. S'il y a un grand nombre de colonies sur la plaque témoin négative, revenez à l'étape 4.1 et révisez le traitement CIP.
  8. Sélectionnez 4-8 colonies individuelles (selon le témoin négatif: rapport de ligature) de la réaction de ligature et inocule 4 mL de LB plus l'antibiotique approprié par colonie individuelle; Croître de nuit à 37 ° C et 220 tr / min.
  9. Isoler l'ADN plasmidique en utilisant un kit d'isolation d'ADN plasmidique selon le protocole du fabricant.
  10. Taper l'insertion efficace du troisième gène en effectuant un résumé de restriction de pMGX- yfg1,2,3 avec EcoRI, comme on le voit à l'étape 3.10.
  11. Électrophorèse la digestion de restriction sur un pourcentage approprié de gel d'agarose; RegardezPour les bandes qui correspondent aux tailles du gène 2 et du gène 3 (voir l'étape 2.2). Remarque: le gène 3 peut être inséré dans le vecteur dans l'orientation inverse non souhaitée. Si les gènes 2 et 3 ont la même taille, un autre site de restriction de restriction approprié doit être sélectionné pour le dépistage.
    REMARQUE: Répétez le cas échéant pour chaque nouveau gène.

5. Produire des protéines d'intérêt à l'aide d'un système d'expression multigène et évaluer la production par Western Blot

  1. Transformer le clone positif contenant tous les gènes d'intérêt dans la production de protéines chimiquement compétente E. coli , tel que BL21- (λDE3).
    1. Décongeler des aliquotes de 100 μL de E. coli BL21- (λDE3) chimiquement compétent sur de la glace pendant 5 min, puis ajouter 1 μl de l'ADN plasmidique clone positif; Incuber pendant 30 minutes sur de la glace.
    2. Choc thermique des cellules pendant 45 s dans un bain d'eau maintenu à 42 ° C, puis ajouter 200 μL de LB froide. Incuber sur de la glace pendant 2 min.
    3. Agiter les cellules à 37 ° C et 220 tr / min pendant 1 h, puis étaler la plaque de 100 μL sur une plaque de LB-agar contenant le marqueur sélectionnable approprié (soit l'ampicilline soit la kanamycine).
  2. Exprimer la protéine par l'induction d'isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG).
    1. Sélectionnez une colonie isolée de la plaque de transformation B21- (λDE3) et inoculez 4 mL de LB plus l'antibiotique approprié; Croître toute la nuit, tremper à 37 ° C et 220 tr / min.
    2. Inoculer une LB de 100 ml plus la culture d'antibiotiques appropriée en utilisant 1 mL de culture pendant la nuit.
    3. Cultiver à 37 ° C avec agitation à 220 tr / min jusqu'à une DO 600 de 0,6.
    4. Induire la culture avec 100 μM d'IPTG et pousser pendant 15 h à 25 ° C et 220 tr / min.
    5. Retirer 1 mL de la culture et centrifuger à 13 000 xg pendant 1 min; Jeter le surnageant.
  3. Lyse les cellules en utilisant une solution de lyse selon les instructions du fabricantEt préformer une Western blot du lysat cellulaire soluble pour déterminer si toutes les protéines ont été produites avec succès 19 .

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Résultats

Dans cette étude, l'objectif était de coexprimer cinq protéines à partir d'un seul plasmide. Les fragments de gènes synthétiques optimisés à cinq codons codant pour les marqueurs hexahistidine N- ou C-terminaux ont été achetés dans le commerce. Les gènes synthétiques ont été amplifiés par PCR et clonés individuellement dans un vecteur brut de PCR et séquencés. Pour générer le plasmide polycistronique, les cinq gènes d'intérêt ont d'abord été clonés dans un plasmide pMGX a...

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Discussion

La co-expression de multiples gènes est de plus en plus essentielle, en particulier dans la caractérisation et la reconstitution des voies métaboliques multigène complexes 3 , 4 , 5 . Le système pMGX fait une co-expression multigène dans la routine E. coli 6 , 7 , 8 et accessible à divers chercheurs. Dans cette étude, on a mon...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n'ont rien à dévoiler.

Remerciements

Ce travail a été appuyé par le Conseil de recherches en sciences naturelles et en génie du Canada.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
enzymes
Phosphatase alcaline, intestinale de veau (CIP)New England BiolabsM0290S
AvrIINew England BiolabsR0174S
EcoRINew England BiolabsR0101S
NdeINew England BiolabsR0111S
XbaINouveau Angleterre BiolabsR0145S
Herculase II Fusion ADN polyméraseAgilent Technologies600677
T4 ADN LigaseNew England BiolabsM0202S
NomEntrepriseNuméro de catalogueComments
>Reagents
1 kb Échelle d’ADNNew England BiolabsN3232L
4-20 % Mini-PROTEAN TGX Gels protéiques sans colorationBio-Rad456-8095
50x TAEFisher Thermo ScientificBP1332-4
AgarFisher Thermo ScientificBP1423-500
AgaroseFisher Thermo ScientificBP160-500
AmpicilineSigma-AlrichA9518-5G
BL21 (DE3) Cellulescomeptentes Cellule comeptente préparée en maison
B-PER Réactif d’extraction de protéines bactériennesFisher Thermo ScientificPI78243
dNTP mixAgilent Technologies
d’extraction de gel de polyméraseOmegaD2500-02E.Z.N.A Gel Extraction, fourni par VWR Cat 3 : CA101318-972
GlycineFisher Thermo ScientificBP381-1
His Tag Anticorps [HRP], mAb, sourisGenScriptA00612
Immobilon Western Chemiluminescent HRP SubstratEMD MilliporeWBKLS0100
IPTGSigma-Alrich15502-10G
LBFisher Thermo ScientificBP1426-500
MéthanolFisher Thermo ScientificA411-20
Lait écrémé instantané pasteurisé en poudreÉpicerielait d’épicerie sans nom est adéquat
Membrane de nitrocelluloseAmersham Protran (GE Healthcare Life Sciences)10600007Membrane PT 0.45 µ ; m 200 mm x 4 m, fourni par VWR Cat # : CA10061-086
Kit d’isolement de l’ADN plasmidiqueOmegaD6943-02E.Z.N.A MiniKit d’ADN plasmidique I, fourni par VWR Cat # : CA101318-898
pMGXBoddy LabDemande du laboratoire Boddy Contact cboddy@uottawa.ca
Amorcesd’ADNConcevez les amorces selon les besoins pour le gène souhaité
Synthetic Gene LifeTechnologiesConcevoir et optimiser selon les besoins
Papier Filtre Transfert ÉpaisBio-Rad1703932
Base TrisBioShopTRS001.1
Tween-20Sigma-AlrichP9416-50ML
XL1-Blue CellulesCellule comeptente préparée en interne
Nom Entreprise Numéro de catalogueComments
Equipment
BioSpectrometerEppendorfRK-83600-07
Boîte de gel - PAGEBio-Rad1658005Mini-PROTEIN Tetra Vertical Electrophoresis Cell
Gel ImagerAlpha InnotechAlphaImager EC
Incubateur-fourFisher Thermo Scientific11-690-650D
Isotemp Incubateur-agitateurFisher Thermo ScientificSHKE6000-7MaxQ 6000
Rasoirs PersonnaFisher Thermo ScientificS04615
Bloc d’alimentationBio-RadS65533QFB300
TransilluminateurVWR InternationalM-10E,6W
ThermocylcerEppendorfZ316091Mastercycler Personal, fourni par Sigma
UV Face-Shield18-999-4542
WaterbathFisher Thermo Scientific15-460-2SQ
Western Transfer ApparatusBio-Rad1703935Mini-Trans Blot Cell
chimiquement Fourni avec le kit locale Le Technologies intégrées chimiquement compétentes

Références

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Réimpressions et autorisations

Étiquettes

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