Cette étude décrit des méthodes pour la co-expression médiée par T7 de plusieurs gènes à partir d'un seul plasmide dans Escherichia coli en utilisant le système de plasmide pMGX.
Article de méthode
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Cette étude décrit des méthodes pour la co-expression médiée par T7 de plusieurs gènes à partir d'un seul plasmide dans Escherichia coli en utilisant le système de plasmide pMGX.
La co-expression de protéines multiples est de plus en plus essentielle pour la biologie synthétique, l'étude des complexes protéines-protéines, et la caractérisation et l'atténuation des voies de biosynthèse. Dans ce manuscrit, on décrit l'utilisation d'un système hautement efficace pour la construction d'opérons synthétiques multigènes sous le contrôle d'une ARN polymérase T7 inducible. Ce système permet d'exprimer plusieurs gènes simultanément à partir d'un plasmide. Ici, un ensemble de quatre vecteurs apparentés, pMGX-A, pMGX-hisA, pMGX-K et pMGX-hisK, avec le marqueur sélectionnable par résistance à l'ampicilline ou à la kanamycine (A et K) et possédant ou n'ayant pas d'hexahistidine N-terminale Tag (son) est divulgué. Des protocoles détaillés pour la construction d'opérons synthétiques utilisant ce système vectoriel sont fournis avec les données correspondantes, montrant qu'un système à base de pMGX contenant cinq gènes peut être facilement construit et utilisé pour produire les cinq protéines codées dans Escherichia coli . Ce systèmeEm et le protocole permet aux chercheurs d'exprimer systématiquement des modules et des chemins multi-composants complexes dans E. coli .
La co-expression de multiples protéines est de plus en plus essentielle, en particulier dans les applications de biologie synthétique, où plusieurs modules fonctionnels doivent être exprimés 1 ; Dans l'étude des complexes protéine-protéine, où l'expression et la fonction nécessitent souvent une co-expression 2 , 3 ; Et dans la caractérisation et l'exploitation des voies de biosynthèse, où chaque gène dans la voie doit être exprimé 4 , 5 , 6 , 7
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1. Obtention de gènes d'intérêt
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Dans cette étude, l'objectif était de coexprimer cinq protéines à partir d'un seul plasmide. Les fragments de gènes synthétiques optimisés à cinq codons codant pour les marqueurs hexahistidine N- ou C-terminaux ont été achetés dans le commerce. Les gènes synthétiques ont été amplifiés par PCR et clonés individuellement dans un vecteur brut de PCR et séquencés. Pour générer le plasmide polycistronique, les cinq gènes d'intérêt ont d'abord été clonés dans un plasmide pMGX a.......
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La co-expression de multiples gènes est de plus en plus essentielle, en particulier dans la caractérisation et la reconstitution des voies métaboliques multigène complexes 3 , 4 , 5 . Le système pMGX fait une co-expression multigène dans la routine E. coli 6 , 7 , 8 et accessible à divers chercheurs. Dans cette étude, on a mon.......
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Les auteurs n'ont rien à dévoiler.
Ce travail a été appuyé par le Conseil de recherches en sciences naturelles et en génie du Canada.
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| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| enzymes | |||
| Phosphatase alcaline, intestinale de veau (CIP) | New England Biolabs | M0290S | |
| AvrII | New England Biolabs | R0174S | |
| EcoRI | New England Biolabs | R0101S | |
| NdeI | New England Biolabs | R0111S | |
| XbaI | Nouveau Angleterre Biolabs | R0145S | |
| Herculase II Fusion ADN polymérase | Agilent Technologies | 600677 | |
| T4 ADN Ligase | New England Biolabs | M0202S | |
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Comments |
| >Reagents | |||
| 1 kb Échelle d’ADN | New England Biolabs | N3232L | |
| 4-20 % Mini-PROTEAN TGX Gels protéiques sans coloration | Bio-Rad | 456-8095 | |
| 50x TAE | Fisher Thermo Scientific | BP1332-4 | |
| Agar | Fisher Thermo Scientific | BP1423-500 | |
| Agarose | Fisher Thermo Scientific | BP160-500 | |
| Ampiciline | Sigma-Alrich | A9518-5G | |
| BL21 (DE3) Cellules | comeptentes Cellule comeptente préparée en maison | ||
| B-PER Réactif d’extraction de protéines bactériennes | Fisher Thermo Scientific | PI78243 | |
| dNTP mix | Agilent Technologies | ||
| d’extraction de gel de polyméraseOmega | D2500-02 | E.Z.N.A Gel Extraction, fourni par VWR Cat 3 : CA101318-972 | |
| Glycine | Fisher Thermo Scientific | BP381-1 | |
| His Tag Anticorps [HRP], mAb, souris | GenScript | A00612 | |
| Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrat | EMD Millipore | WBKLS0100 | |
| IPTG | Sigma-Alrich | 15502-10G | |
| LB | Fisher Thermo Scientific | BP1426-500 | |
| Méthanol | Fisher Thermo Scientific | A411-20 | |
| Lait écrémé instantané pasteurisé en poudre | Épicerie | lait d’épicerie sans nom est adéquat | |
| Membrane de nitrocellulose | Amersham Protran (GE Healthcare Life Sciences) | 10600007 | Membrane PT 0.45 µ ; m 200 mm x 4 m, fourni par VWR Cat # : CA10061-086 |
| Kit d’isolement de l’ADN plasmidique | Omega | D6943-02 | E.Z.N.A MiniKit d’ADN plasmidique I, fourni par VWR Cat # : CA101318-898 |
| pMGX | Boddy Lab | Demande du laboratoire Boddy Contact cboddy@uottawa.ca | |
| Amorces | d’ADN | Concevez les amorces selon les besoins pour le gène souhaité | |
| Synthetic Gene Life | Technologies | Concevoir et optimiser selon les besoins | |
| Papier Filtre Transfert Épais | Bio-Rad | 1703932 | |
| Base Tris | BioShop | TRS001.1 | |
| Tween-20 | Sigma-Alrich | P9416-50ML | |
| XL1-Blue Cellules | Cellule comeptente préparée en interne | ||
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Comments |
| Equipment | |||
| BioSpectrometer | Eppendorf | RK-83600-07 | |
| Boîte de gel - PAGE | Bio-Rad | 1658005 | Mini-PROTEIN Tetra Vertical Electrophoresis Cell |
| Gel Imager | Alpha Innotech | AlphaImager EC | |
| Incubateur-four | Fisher Thermo Scientific | 11-690-650D | |
| Isotemp Incubateur-agitateur | Fisher Thermo Scientific | SHKE6000-7 | MaxQ 6000 |
| Rasoirs Personna | Fisher Thermo Scientific | S04615 | |
| Bloc d’alimentation | Bio-Rad | S65533Q | FB300 |
| Transilluminateur | VWR International | M-10E,6W | |
| Thermocylcer | Eppendorf | Z316091 | Mastercycler Personal, fourni par Sigma |
| UV Face-Shield | 18-999-4542 | ||
| Waterbath | Fisher Thermo Scientific | 15-460-2SQ | |
| Western Transfer Apparatus | Bio-Rad | 1703935 | Mini-Trans Blot Cell |
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