Article de méthode

Analyse de la ségrégation chromosomique, de l'acétone d'histone et de la morphologie de la broche dans les ovocytes

DOI :

10.3791/55242

⸱

11 mai 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Health, Animal Science and Food Safety, University of Milan, 2IRCCS. Istituto Ortopedico Galeazzi, 3PRC, CNRS, IFCE, Université de Tours, INRA, 4PAO, INRA, 5Clinique des Animaux de Compagnie et des Équidés, Université de Liège, 6University of Agricultural Sciences and Veterinary Medicine, Cluj-Napoca, Romania

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce manuscrit décrit une approche expérimentale pour caractériser morphologiquement et biochimiquement les ovocytes à cheval. Plus précisément, le présent travail illustre comment recueillir des ovocytes à cheval immatures et matures par captage d'ovules guidé par ultrasons (OPU) et comment étudier la ségrégation des chromosomes, la morphologie de la broche, l'acétylation des histones mondiales et l'expression de l'ARNm.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le domaine de la procréation assistée a été développé pour traiter la stérilité chez les femmes, les animaux de compagnie et les espèces en voie de disparition. Dans le cheval, la reproduction assistée permet également la production d'embryons de haut niveau sans interrompre leur carrière sportive et contribue à une augmentation du nombre de poulains chez les juments de haute valeur génétique. Le présent manuscrit décrit les procédures utilisées pour la collecte d'ovocytes immatures et matures à partir d'ovaires à cheval utilisant un prélèvement d'ovule (OPU). Ces ovocytes ont ensuite été utilisés pour étudier l'incidence de l'aneuploïdie en adaptant un protocole préalablement développé chez la souris. Plus précisément, les chromosomes et les centromères des ovocytes de la métaphase II (MII) ont été marqués par fluorescence et comptés sur des plans focaux séquentiels après un balayage par microscope laser confocal. Cette analyse a révélé une incidence plus élevée dans le taux d'aneuploïdie lorsque des ovocytes immatures ont été recueillis à partir des follicules et ont été mûris in vitro par rapport àIn vivo. L'immunocoloration pour la tubuline et la forme acétylée d'histone quatre à des résidus spécifiques de lysine a également révélé des différences dans la morphologie de la broche méiotique et dans le schéma global de l'acétylation des histones. Enfin, l'expression d'ARNm codant pour les histone désacétylases (HDAC) et les acétyl-transferases (HAT) a été étudiée par transcription inverse et PCR quantitative (q-PCR). Aucune différence dans l'expression relative des transcrits n'a été observée entre les ovocytes matures in vitro et in vivo . En accord avec un silence général de l'activité de transcription pendant la maturation des ovocytes, l'analyse de la quantité de transcription totale ne peut révéler la stabilité ou la dégradation de l'ARNm. Par conséquent, ces résultats indiquent que d'autres réglementations translationnelles et post-traductionnelles pourraient être affectées.

Dans l'ensemble, la présente étude décrit une approche expérimentale pour caractériser morphologiquement et biochimiquement l'ovocyte du cheval, un ceLl est extrêmement difficile à étudier en raison de la faible disponibilité des échantillons. Cependant, il peut élargir nos connaissances sur la biologie de la reproduction et la stérilité dans les espèces monovulatrices.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Une vaste gamme de techniques de reproduction assistée a été développée pour traiter l'infertilité chez les femmes, les animaux de compagnie et les espèces en voie de disparition. L'une des procédures les plus courantes dans les milieux cliniques est la récupération des ovocytes de la métaphase II (MII) des follicules ovariens par aspiration transvaginale guidée par ultrasons, prélèvement d'ovule (OPU) 1 . Ces ovocytes sont ensuite fécondés in vitro (FIV), l'embryon (s) résultant (s) implanté (e) dans un utérus receveur. Les ovocytes de stade MII (matures) sont récupérés suite à l'administration de gonadotrophines ....

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Protocole

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Toutes les procédures ont été approuvées par le Comité de soins et d'utilisations des animaux CEEA Val de Loire numéro 19 et ont été réalisées conformément aux Principes directeurs pour la prise en charge et l'utilisation des animaux de laboratoire.

1. Collection d'ovocytes et maturation in vitro

  1. Prise d'ovule
    1. Évaluation quotidienne par échographie du diamètre des follicules ovariens dans une cohorte de juments adultes. À l'émergence d'un follicule ≥33 mm (follicule dominant), injecter la jument avec 1 500 UI de gonadotrophine chorionique humaine (hCG) dans la partie su....

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Résultats

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les résultats originaux de ces expériences ont été décrits en profondeur précédemment 7 et sont présentés ici comme un exemple de résultats qui peuvent être obtenus en utilisant les protocoles décrits.

Taux de maturation

Sur les 32 COC récupérés par OPU à partir des follicules dominants, 28 (88%) étaient au stade MII. Quatorze des 58 COC collect.......

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Même si la MIV a été réalisée chez les chevaux depuis plus de 20 ans 16 , nous ne savons pas encore si l'ovocyte peut être l'origine de l'aneuploïdie embryonnaire, comme cela a été proposé pour l'homme 17 . La raison en est probablement que la préparation de spreads d'ovocytes pour le comptage des chromosomes entraîne une perte d'échantillon considérable. Dans cet esprit, une enquête sur les méthodes utilisées pour enquêter sur les erreurs dans la s.......

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs n'ont rien à dévoiler.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs souhaitent remercier Fabrice Vincent pour le support avec la microscopie confocale à laser (LSCM) , et Philippe Barrière et Thierry Blard pour l'analyse quotidienne des ultrasons et l'injection de hCG. Ce travail a été soutenu en partie par le projet «Ex Ovo Omnia» de Regione Sardegna and Regione Lombardia (Subvention n ° 26096200 à AML); La bourse "L'Oreal Italie par le Donne et la Scienza 2012" (contrat 2012 à FF), FP7-PEOPLE-2011- CIG, Agence de recherche et de recherche (REA) "Pro-Ovum" (Subvention n ° 303640 à VL); Et par l'École postdoctorale d'agriculture et de médecine vétérinaire, cofinancée par le Fonds socia....

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
sonde à ultrasonsAlokaUST-5820-7,5
gonadotrophine chorionique humainecentravetCHO0041 500 unité/animal IV
détomidinecentravetMED0109 - 15 µ ; g/kg IV
butylscopolamine bromurecentravetEST0010,2 mg/kg IV
stéréomicroscopeNIKONSMZ-2B
butorphanolcentravetDOL00310µ ; g/kg IV
benzyl-pénicillinecentravetDEP203 IM15 000 UI/animal
TCM199Sigma-AldrichM3769 10X1Lpoudre pour tampon à l’hepes TCM199
Hepes sel de sodiumSigma-AldrichH3784-100G
albumine sérique bovineSigma-AldrichA8806
héparine  ;Sigma-AldrichH3149-10KU
NaHCO3-buffered TCM199Sigma-AldrichM2154-500MLliquide pour IVM facteur
croissance épidermiqueSigma-AldrichE4127
sérum de veau nouveau-néSigma-AldrichN4762-500ML
4-well dishesNUNCLON
incubateurHeraeusBB6060
monastrolSigma-AldrichM8515
hyaluronidaseSigma-AldrichH3506
pronaseSigma-AldrichP5147
paraformaldéhydeSigma-AldrichP6148
alcool polyvinyliqueSigma-Aldrich341584
triton-X 100Sigma-AldrichT8787
sérum d’âne normalSigma-AldrichD9663
lapin anti-Aurora B phospho-Thr232BioLegend636102
âne conjugué TRITC anti-lapin IgGVector Laboratories711-025-152
Vecta-ShieldVector LaboratoriesH-1000
YOPRO1Thermofisher ScientificY3603
microscope confocal à balayage laserLSM 780 MicroscopeZeiss
LSM 700Zeiss
ImageJ softwarersb.info. nih.gov/ij/download.htmlressource
souris anti-alpha-tubulineSigma-AldrichT8203
lapin anti-acH4K16Upstate Biotechnologie07-329
AlexaFluor 488-coniugated donkey anti-souris IgGLife TechnologiesA21202
4',6-diamidino-2-phenylindoleSigma-AldrichD8417DAPI
centrifuge Eppendorf5417R
RNALaterInvitrogenAM7020
Luciferase RNAPromegaL4561
PicoPure Kit d’isolement de l’ARNApplied Biosystems12204-01
hexamères aléatoiresThermofisher ScientificN8080127
souris Moloney leucémie virus transcriptase inverseThermofisher Scientific28025013
SYBR green supermixBioRad1708880
amorces spécifiquesSigma-Aldrichdes amorces spécifiques ont été conçues à l’aide du logiciel Primer3Plus (ressource gratuite)
thermocycleurBioRadMyiQ
souris monoclonale anti-CENPAAbcamab13939
monoclonale anti-Aurora BAbcamab3609
de moyen 144444 confocal à balayage laser gratuite souris

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Dellenbach, P. Transvaginal, sonographically controlled ovarian follicle puncture for egg retrieval. Lancet. 1 (8392), 1467(1984).
  2. Humaidan, P. Ovarian hyperstimulation syndrome: review and new classification criteria for reporting....

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Réimpressions et autorisations

Demander l’autorisation de réutiliser le texte ou les figures de cet article JoVE

Demander une autorisation

Mots-clés

Maturation ovocytaireMicroscopie confocaleImmunomarquageAnalyse par qPCRCollecte d ovocytesMaturation in vitro

Articles connexes