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Reconstitution de nucléosomes avec histones soeurs Différentiellement Isotope marqués

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DOI :

10.3791/55349

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26 mars 2017

1Department of Structural Biology, Leibniz Institute of Molecular Pharmacology (FMP-Berlin)

Dans cet article

Résumé

Ce protocole décrit la reconstitution de nucléosomes contenant différentiellement histones sœurs marqués d'un isotope. Dans le même temps, les nucléosomes asymétriquement modifications post-traductionnelles peuvent être générés après l'utilisation d'une copie préalablement modifiée de l'histone. Ces préparations peuvent être facilement utilisés pour étudier les mécanismes de modification de diaphonie, simultanément sur les deux histones sœurs, en utilisant la spectroscopie de RMN à haute résolution.

Résumé

nucléosomes asymétriquement modifiés contiennent les deux copies d'une histone (histones sœurs) décorées avec des ensembles distincts de modifications post-traductionnelles (PTM). Ils sont nouvellement espèces identifiées par des moyens inconnus d'établissement et implications fonctionnelles. les méthodes d'analyse actuelles sont insuffisantes pour détecter l'apparition spécifique de copie de PTM sur les histones sœurs nucléosomales. Ce protocole présente une méthode biochimique pour la reconstitution in vitro de nucléosomes contenant différentiellement histones sœurs marqués d'un isotope. Le complexe généré peut être aussi asymétriquement modifié, après avoir inclus une piscine histone préalablement modifiée pendant le repliement de Subcomplexes histones. Ces préparations nucléosome asymétriques peuvent être facilement mis à réagir avec des enzymes de modification des histones pour étudier les mécanismes de diaphonie modification imposée par le PTM asymétriquement pré-incorporé en utilisant la spectroscopie de résonance magnétique nucléaire (RMN). En particulier, les réactions de modification deEn temps réel peut être mis en correspondance de manière indépendante sur les deux sœurs histones en effectuant différents types d'expériences de RMN de corrélation, adaptée pour le type d'isotope concerné. Cette méthodologie fournit les moyens d'étudier les mécanismes de diaphonie qui contribuent à la formation et la propagation des modèles PTM asymétriques sur les complexes nucléosomales.

Introduction

ADN eucaryote est étroitement emballés dans les noyaux des cellules en chromatine. Le bloc de construction fondamental de la chromatine est la particule de noyau nucléosome qui contient ~ 147 pb d'ADN enroulé autour d'un complexe octamérique composé de deux copies de chacun des quatre histones (H3, H4, H2A, H2B). protéines histones abritent une pléthore de modifications post-traductionnelles (PTM). Ces substitutions covalentes induisent des altérations de la structure de la chromatine, directement en affectant la physico - chimie du système et , indirectement , en recrutant des activités de remodelage de la chromatine 1, 2, 3. Par ces moyens, PTM histones contrôlent la chromatine accessibilité et, par conséquent, réguler toutes les fonctions cellulaires à base d' ADN 4.

PTM sont installés par des systèmes enzymatiques histones modifiant principalement sur les segments N-terminaux non structurées (queues) de histo noyau nucléosome incorporénda. En raison des nombreux sites de modification sur la séquence relativement courte des queues d'histones, PTM influencent mutuellement en induisant ou en bloquant les réactions de modification ultérieure, un effet connu comme modification diaphonie 5. En raison de l'architecture symétrique globale du nucléosome, des réactions de modification et les mécanismes de diaphonie ont été pensés pour produire de manière similaire sur les deux copies de chaque histone nucléosomale (histones soeurs). Ce concept a été récemment contesté et par la suite infirmée. En particulier, les dosages enzymatiques in vitro sur histones H3 libre queue peptides et sur nucléosomes ont démontré qu'un ensemble de kinases H3 introduit la phosphorylation de manière asymétrique 6. En outre, l' analyse LC-MS / MS à base d'affinité , la purification a révélé l'existence de nucléosomes asymétriquement H3 méthylée dans plusieurs types de cellules eucaryotes 7. Ainsi, nucléosomes asymétriquement modifiés constituent des espèces nouvelles, etoutils sont nécessaires pour découvrir les mécanismes qui contrôlent leur formation et d'analyser les effets de diaphonie que cette asymétrie pourrait exercer.

Communément, Western blot (WB) et la spectrométrie de masse (MS) analyse ont été utilisées pour détecter PTM histones. En dépit de son application facile, WB souffre de problèmes de spécificité / réactivité croisée. En plus de cela, il est incapable d'exécuter simultanément l' analyse multi-PTM et la quantification directe des réactions de modification 8. D'autre part, l' analyse MS emploie une instrumentation sophistiquée qui nécessite une formation de haut niveau, mais fournit une haute spécificité ainsi que la cartographie simultanée et la quantification de plusieurs PTM 9.   Cependant, les deux méthodes sont perturbateurs et les complexes sont dissociés nucléosomales avant l'analyse, ce qui donne naissance à un mélange d'histones et / ou des peptides dérivés de l'histone. Cette manipulation supprime la possibilité de faire la distinction indépendanteréactions de modification qui se produisent sur chacun des deux histones sœurs et à faire rapport de l'état de modification spécifique de copie des histones nucléosomales.

Résonance magnétique (RMN) nucléaire évolué comme une méthode alternative pour cartographier les réactions PTM. La RMN est non perturbatrice et permet ainsi le suivi des événements PTM d'une manière en temps réel dans des mélanges reconstitués, et même dans des cellules intactes 10, 11. Le développement des routines pour l' acquisition rapide de données, ainsi que pour la cartographie à haute résolution sur la base 2D méthodes de corrélation hétéro-nucléaire d'échantillons marqués par des isotopes (15 N et / ou 13 C) 12 a permis l'application simultanée de différents types de PTM, par exemple comme la sérine / thréonine / phosphorylation de la tyrosine, la lysine acétylation / méthylation et l' arginine 13 méthylation. Selon le PTM sous enquête, 15 N- ou 13 C-étiquetage protocols peuvent être utilisés pour marquer le groupe fonctionnel de la protéine qui sert de rapporteur de modification. Par conséquent, la cartographie PTM peut être réalisée en suivant le déplacement de déplacement chimique caractéristique du groupe fonctionnel correspondant 'à détecter la modification de l'environnement chimique. Dans la plupart des cas, les deux groupes NH et chimiques CH peuvent être utilisés pour signaler l'évolution du PTM d'intérêt.

Le protocole actuel décrit la génération de nucléosomes contenant différentiellement histones sœurs marqués d'un isotope. Il combine la flexibilité de la spectroscopie RMN à la carte PTM utilisant à la fois 1 H- 15 N et 1 H- 13 C spectres de corrélation avec l'utilisation de protéines différentes étiquettes d'affinité pour la purification des complexes histone reconstitués sélectionnés. Notamment, le protocole utilise deux piscines différentes d'une histone particulière pour la reconstitution nucléosome. Ces piscines sont différentiellement marquée par un isotope (une avec 15 N, l'autre avec 13 C), et ils sont fondus à une polyhistidine et une étiquette d'affinité streptavidine, respectivement. Une affinité schéma de purification en tandem avec Ni-NTA et la chromatographie à base de streptavidine initialement utilisé par Voigt et al. 7 est utilisé pour purifier des espèces asymétrique de leurs homologues symétriques (figure 1A). Octamères d'histones asymétriques sont utilisées ultérieurement pour reconstituer des complexes nucléosomales équivalents (figure 1B), en utilisant la méthode de dialyse de sel norme 14. En outre, grâce à la même procédure et en ayant l'une des piscines d'histones pré-modifié, un PTM peut être incorporé de manière asymétrique sur les nucléosomes résultant. La réaction de ces substrats avec des enzymes de modification d' histone et la cartographie subséquente résonance magnétique nucléaire des événements de modification permettent la caractérisation des mécanismes de diaphonie à la fois en cis (préalablement modifié la copie histone) et en trans (unmodified copie histone) (figure 1C).

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Protocole

1. Reconstitution de nucléosomes avec Différentiellement Isotope marqué (et asymétriquement modifié) Soeur histones

NOTE: Le protocole actuel décrit la reconstitution de nucléosomes avec l' histone H3 différentielle marquée par un isotope. A cet effet, deux pools de l'histone H3 ont été utilisées; on était 15 N-étiquetés et contenait un 6xHis-tag à l'extrémité N-terminale et la seconde 13 C-étiqueté et contenait le peptide Strep (de WSHPQFEK) fusionnée à l'extrémité N-terminale. On a séparé les deux mots-clés de la séquence native H3 avec une Tobacco Etch Virus (TEV) site de reconnaissance de protéase. Pour préparer les nucléosomes supplémentaires asymétriquement modifiés, l'une des deux piscines H3 est inclus dans une forme préalablement modifiée. Modification préalable d'un pool d'histones peut être effectuée en faisant réagir l'histone marquée par un isotope d'intérêt avec l'enzyme histone modifiant respectivement en présence du nécessaire pour chaque type de cofacteurs de réaction / donneurs PTM 16. La mise en place efficace du PTM respectif peut être déterminée par spectroscopie RMN ou par spectrométrie de masse. Les quantités des histones / ADN utilisées ici sont des recommandations bruts afin d'obtenir une préparation de nucléosomes à une concentration approximative de 10 pm (mesurée par la concentration d'ADN à 260 nm) .Cet rendement final est suffisante pour enregistrer des spectres de RMN de bonne qualité relativement courts temps d'acquisition.

  1. Reconstitution d'un octamère d'histone avec différentiellement marquée par un isotope (et asymétriquement modifié) histone H3
    NOTE: Recombinant protéines histones peuvent être produites en quantités mg dans BL21 (DE3) pLysS 14. Pour obtenir des histones marqués par des isotopes, le même protocole d' expression / purification est suivi à l'exception de l' utilisation pour la croissance bactérienne d' un milieu minimal contenant 15 NH4CI et / ou 13C-glucose comme sources d'azote et de carbone, 15 N ou 13 C-étiquetage respectively. histones purifiées sont largement dialysées contre 5 mM β-mercaptoéthanol et stockées lyophilisées avant utilisation.
    1. Des aliquotes de dissoudre histone lyophilisées contenant environ 5 mg de chacun des histones dans 1 ml de tampon dépliage (7 M de guanidinium-HCl, 20 mM de Tris pH 7,5, 10 mM de DTT). Inclure les deux types de histone H3. Mélanger par pipetage et ne pas vortex. Gardez les tubes sur la glace pendant 30 minutes pour permettre déroulement complet.
    2. Déterminer la concentration exacte de chacun des histones en mesurant l'absorbance à 280 nm contre un tampon dépliage et à l'aide des coefficients d'extinction calculés avec l'outil ProtParam du portail ExPASy. 15
    3. Mélanger les principaux histones à des rapports équimolaires, en gardant à l'esprit d'inclure 50% chacune des deux piscines de l'histone H3. Commencer par utiliser la totalité du contenu de l'histone moins concentré et ajouter tous les autres en conséquence.
    4. Ajuster la concentration finale en protéine d'environ 1 mg / ml en utilisant un tampon dépliage.
    5. transfer du mélange à une membrane de dialyse 6 kDa coupure et dialysé contre 1 à 2 litres de tampon de repliement refroidi (10 mM de Tris pH 7,5, 2 M de NaCl, 1 mM d'EDTA, 2 mM DTT) à 4 ° C. Changer le tampon au moins une fois après la dialyse est poursuivie pendant au moins 3 h. Effectuer une dernière dialyse O / N à 4 ° C.
    6. Récupérer la matière dialysée et enlever les précipités par centrifugation dans une microcentrifugeuse pendant 5 min à 4 ° C sur la vitesse maximale (normalement pas de précipitation doit être observée). Déterminer la concentration octamère en mesurant l'absorbance à 280 nm. Dans les calculs, utiliser les coefficients d'extinction ajoutés des histones, en gardant à l'esprit de doubler chaque valeur.
    7. On concentre à un volume final de ~ 2 ml en utilisant une unité de filtre centrifuge 10 kDa coupure. Recalculer concentration octamère et la perte de l'estimation. A ce stade, une concentration comprise entre 50 octamère - 100 uM devrait être obtenue.
    8. Connecter la colonne de filtration sur gel (indiqué dans le tableau des matériaux) à unSystème FPLC et équilibrer avec 2 volumes de colonne (CV) de 0,22 um filtré et dégazé repliage tampon à un débit de 1 mL / min et une limite de pression de 0,5 MPa.
      NOTE: Le gel filtration terme doit être effectuée dans la chambre froide ou dans une armoire froide.
    9. Injecter le matériau concentré en utilisant un débit de 1 mL / min et de recueillir 1,0 - 1,5 ml fractions.
    10. Suivez le profil chromatographique et observer histone octamère élution à ~ 65 - 68 ml.
      NOTE: Un petit épaulement du pic d'élution et un pic à ~ 80 ml indique l'existence de libre tétramères H3-H4 et dimères H2A-H2B, respectivement.
    11. Exécuter 20 ul de chaque fraction collectée dans un gel SDS-PAGE à 18%.
      NOTE: Diluer les échantillons par un facteur d'au moins 2 avec de l' eau avant de les charger sur le gel pour réduire la concentration élevée en sel et donc, d' éviter les distorsions. Il en va de même pour les ultérieures analyses SDS-PAGE d'échantillons dans du tampon de repliement.
    12. Piscine fra pertinentections contenant des octamères pures jugées par la répartition égale des 4 histones sur le gel coloré et déterminer la concentration comme avant (étape 1.1.7).
    13. Connecter un ml de Ni-NTA colonne 1 (Table des Matières) à un système FPLC et équilibrer avec 10 CV de 0,22 um filtrée et dégazée repliage tampon à un débit de 1 mL / min.
      REMARQUE: La chromatographie Ni-NTA doit être exécutée dans la chambre froide ou en armoire froide.
    14. Passer octamère purifié par Ni-NTA en utilisant un débit de 1 mL / min.
    15. Recueillir accréditive et conserver les échantillons SDS-PAGE / analyse WB (20 pi et 4 pi, respectivement). Par la suite, laver la colonne avec 10 CV de repliement tampon ou jusqu'à ce qu'un signal de référence est atteint.
    16. Éluer avec 10 CV de tampon contenant 250 mM d'imidazole en utilisant un débit de 1 mL / min repliage. Conserver les échantillons pour SDS-PAGE / analyse WB (20 pi et 4 pi, respectivement).
    17. Équilibrer une colonne d'affinité 1 ml d'acstreptavidine ommerciaux (Table des matières) avec 10 CV tampon de repliement contenant 250 mM imidazole en utilisant une configuration de flux batch / gravité.
      REMARQUE: Cette étape chromatographique doit être effectuée dans la chambre froide.
    18. Passer Ni-NTA élution à travers la colonne d'affinité streptavidine commerciale.
    19. Recueillir l'écoulement à travers et conserver les échantillons SDS-PAGE / analyse WB (20 pi et 4 pi, respectivement). Par la suite, laver avec 10 CV de tampon de repliement.
    20. Eluer avec 10 CV de tampon contenant 2,5 mM desthiobiotine repliement. Conserver les échantillons pour l'analyse SDS-PAGE / WB (20 et 4 pi respectivement).
    21. Mesurer la concentration octamère, ajouter 10 fois moins protéase TEV et laisse la réaction continuer pendant une nuit à 4 ° C dans un tube de centrifugeuse en plastique standard.
      NOTE: La quantité nécessaire de TEV pour obtenir une digestion complète (suppression des étiquettes d'affinité) dépend de l'origine (construction) et sur l'activité (fraîchement préparé, TEV recombinant est plusactif par rapport à celui enregistré pendant des périodes prolongées à - 80 ° C). Essayez initialement en ajoutant 10 fois moins TEV par rapport à l'octamère (estimé que les concentrations de protéines) et ajuster en conséquence.
    22. Vérifiez la digestion efficace en exécutant 20 pi du mélange avant et après TEV addition sur un gel SDS-PAGE 18%. Si la digestion est incomplète, ajouter plus de TEV protéase et continuer l'incubation pour un autre 3-4 h.
    23. Dialyser échantillon contre un tampon de repliement en utilisant une membrane de dialyse de 50 kDa-coupure pour éliminer la protéase TEV et ajuster la composition du tampon.
    24. Concentrer l'octamère asymétrique purifié en utilisant une unité de 10 kDa de coupure centrifuge filtre (la même unité de filtration de l'étape 1.1.7 peut également être utilisé) à un volume de 1,0 à 2,0 ml. Mesurer la concentration finale. Soit utiliser peu de temps après pour la reconstitution nucléosome ou ajuster à 50% (v / v) de glycérol pour stocker à -20 ° C pendant de longues périodes. À ce stade, et attend au moins 70% de perte au cours des étapes précédentes, ee concentration de octamère devrait être de l'ordre de 20-50 uM.
  2. reconstitution nucléosomes
    1. Si octamère a été stockée dans 50% de glycerol, on dialyse pendant une nuit à 4 ° C contre le tampon de repliement avant de procéder à la reconstitution du nucléosome.
    2. Réglez l'ADN (contenant un nucléosome-positionnement séquence) concentration de sel à 2 M de NaCl en utilisant un M de NaCl solution mère 5.
      NOTE: L'ADN purifié soit isolé après purification d'un plasmide qui contient des copies multiples de la séquence désirée ou synthétisé par l' amplification par PCR devrait être stocké concentrée à ~ 50 um dans de l' eau ou un tampon Tris-EDTA standard.
    3. Mélanger octamère et l'ADN en utilisant le rapport optimal déterminé à partir d'un test à petite échelle. Utiliser un tampon de repliage pour ajuster le volume final de ~ 3,0 ml. Toujours ajouter l'octamère dernier pour éviter tout risque de mélange de l'octamère et l'ADN à <2 M concentrations en sel.
      1. Effectuer petit-sc initialrecompositions ale pour déterminer le octamère: rapport d'ADN qui conduit à des rendements de nucléosomes optimaux. Pour cela, assembler trois réactions de 0,9: 1,0, 1,0: 1,0 et 1,1: 1,0: ADN octamère ratios dans un volume compris entre 50-100 ul. En règle générale, utiliser une concentration d'ADN de 5 uM.
      2. Procéder à la reconstitution comme décrit ci-dessous (étapes 1.2.4-1.2.8) et à la fin, estimer la quantité de soluble et de bonne qualité nucléosome reconstitué en mesurant la concentration d'ADN à 260 nm et en exécutant un gel à 6% d'ADN natif PAGE , colorés avec du bromure d'éthidium, respectivement (figure 5A).
    4. Transférer le mélange à une membrane de dialyse 6 kDa-coupure et dialyser contre 1 L de repliement tampon pendant une nuit à 4 ° C.
    5. Réduire la concentration en sel du tampon de dialyse d'une manière progressive à partir de 2, à 0,85, 0,64 et 0,2 M de NaCl, respectivement. Gardez l'échantillon dans chaque tampon pendant au moins 3 h. Parfois précipité est formé après la dernière transition. Dans ce cas, continuer dialyse comme prévu et retirer précipité par centrifugation microfuge à la fin de l'étape suivante.
    6. Le transfert de la membrane de dialyse dans un bêcher de 1 litre de tampon d'essai (25 mM de NaH 2 PO 4 / Na 2 HPO 4 pH 6,8, 25 mM de NaCl, 2 mM de DTT) et continuer la dialyse O / N à 4 ° C.
    7. Prélever un échantillon, enlever tout précipité formé à l'étape 1.2.5 par centrifugation dans une microcentrifugeuse pendant 5 min à 4 ° C sur la vitesse maximale et concentré en utilisant une unité de filtre centrifuge 30 kDa-coupure à un volume final de 300 pi ~.
    8. Mesurer la concentration d'ADN à 260 nm, exécuter un gel de 18% de protéine SDS-PAGE (4 pi de l'échantillon) et un gel à 6% PAGE natif ADN (0,2 pi de l'échantillon) et de l'échantillon de conserver à 4 ° C pendant plusieurs semaines. La concentration finale devrait être de l'ordre de 10-20 uM.

2. Analyse RMN des réactions de modification sur les deux soeurs histones

NOTE: Cession de2D 1 H- 15 N spectres de corrélation de queues d'histones nucléosomales peut être trouvé à des références 16, 17, 18. En outre, les affectations de CH x groupes de lysines, sérines et threonines sur 2D spectres de corrélation 1 H- 13 C peut être trouvé à la référence 16.

  1. Configuration RMN et l' enregistrement des spectres de référence
    NOTE: Des essais enzymatiques ont été effectuées en utilisant 140 pi de l'échantillon nucléosome dans un tampon d'essai dans un tube de RMN 3 mm à 300 K. Les différents tubes RMN avec d' autres volumes d'échantillon peut également être utilisé. La température mentionnée ci - dessus est approprié pour obtenir une bonne qualité 1 H- 15 N spectres de corrélation de queues d'histones nucléosomales et de bonnes activités enzymatiques. 2D-SOFAST-HMQC 1 H- 15 N et 2D-HSQC 1 H- 13 C spectres ont été enregistrés respectivement avec une configuration tchapeau confère des temps d'acquisition similaires. Paramètres d'acquisition typiques sont 128 transitoires avec 1.024 (1 H) x 128 (15 N) de points complexes et 32 transitoires avec 1.024 (1 H) x 64 (13 C) des points complexes pour les deux types de spectres de corrélation différents. Pour les deux spectres 2D, le temps d'acquisition était de ~ 30 min.
    1. Régler 300 K lorsque la température de l'échantillon dans le spectromètre. Ajouter 10% de D 2 O (v / v) à l'échantillon à être utilisé pour le verrouillage de la fréquence du spectromètre.
    2. Placer l'échantillon dans le spectromètre et effectuer des opérations de base (verrouillage, réglage, dsépaisseur). En outre, de déterminer des longueurs d'impulsion optimales et les paramètres généraux d'acquisition.
    3. Enregistrement 1D et 2D 1 H- 15 N et 1 H- 13 spectres de référence C.
    4. spectres de référence des processus et veiller à ce que les signaux à utiliser pour cartographier les réactions de modification sont bien résolus et avoir de bonnes intensités.
    5. Récupérer l'échantillon et transférer it pour un tube de microcentrifugation.
  2. Mise en place de la réaction enzymatique, suivi par RMN et l' analyse quantitative
    1. Copier et organiser une série de 2D entrelacé 1 H- 15 N et 1 H- 13 C spectres. Visez un temps total d'acquisition de plusieurs heures et ajuster en conséquence dans un nouveau cycle sur la base des taux enzymatiques obtenus à partir de la première réaction.
    2. Ajouter à l'échantillon des cofacteurs nécessaires pour le type respectif de réaction de modification (ATP 1 mM / 2 mM de MgCl2 pour la phosphorylation, 1 mM de l' acétyl-CoA pour acétylation, 1 mM de SAM pour la méthylation, etc.).
    3. Ajouter l'enzyme d'intérêt, mélanger par pipetage, transférer l'échantillon dans le tube RMN et par la suite dans le spectromètre (effectuer rapidement ces opérations).
      NOTE: S'il n'y a pas de données sur l'activité enzymatique attendue, ajuster le substrat à l' enzyme rapport molaire à 10: 1. Effectuer un premier galop d'essai et d'ajuster en conséquence pourla course réelle.
    4. Effectuer un calage automatique rapide et utiliser le reste des paramètres à partir des spectres de référence.
    5. Initier la série des entrelacée 2D 1 H- 15 N et 1 H- 13 C Les spectres.
    6. Suivez la progression de la réaction en temps réel et arrêter l'acquisition lorsque la réaction atteint la fin ou à un niveau souhaité.
    7. Les spectres de processus comme précédemment avec les mêmes paramètres.
    8. Répétez l'ensemble exécution à l'aide d'un ordre d'acquisition différents pour les deux types de spectres de corrélation. Si dans la première expérience d' un 1 H- 15 N corrélation était la première fois dans la série, maintenant démarrer avec une C corrélation 1 H- 13. Par cela et ayant en même temps d'acquisition pour les deux spectres, il est possible de tracer et de comparer les réactions PTM sur les deux histones marqués par des isotopes différentiellement sur la même échelle de temps. En outre, il est possible de calculer les moyennes et les barres d'erreur de tracé.
      NOTE: Un thorough description des méthodes d'analyse du signal RMN et la quantification ultérieure des réactions enzymatiques peuvent être trouvés ici 19.
    9. Sélectionnez signaux RMN de chaque spectre RMN évolution temporelle qui signalent la progression de la réaction et de calculer leurs intensités de signal relatives à l'aide d'un logiciel de visualisation et d'analyse pour les spectres RMN. Pour ce faire, pour des signaux qui rendent compte non modifié, ainsi que l'état modifié. Extraire des niveaux de modification.
    10. Tracer les valeurs calculées de niveaux de modification en fonction du temps de réaction.

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Résultats

Espèces octamères correctement repliées sont isolées après une course du mélange de reconstitution à travers une colonne de filtration sur gel (Figure 2). La piscine reconstituée octamère contenant les trois types de octamères différents est soumis au régime tandem de purification par affinité. Des échantillons sont prélevés toutes les étapes et analysées par SDS-PAGE et ensuite BM. La vérification de l'exécution correcte du protocole qui aboutit à l'isolement d&...

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Discussion

Pour la reconstitution du nucléosome, le protocole actuel utilise une matrice d' ADN long de 165 pb contenant la séquence de 601 Widom de positionnement 20 nucléosome, mais une performance similaire est prévu à l' aide de différentes longueurs de matrices d'ADN. Le protocole a été conçu et utilisé en utilisant des types asymétriques de l'histone H3. Avec le même principe, la méthode peut être appliquée aussi pour les autres histones et peut en outre être utilisé pour reconstituer ...

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Déclarations de divulgation

L’auteur n’a rien à divulguer.

Remerciements

L'auteur remercie le Dr Philipp Selenko (FMP-Berlin) pour fournir l'espace et l'infrastructure humide laboratoire pour effectuer des expériences et Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) pour financer les travaux grâce à une subvention de recherche (LI 2402 / 2-1).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Guanidinium HClApplichemA14199Utilisez du Gu-HCl
Tris  ;Roth4855.2
DTTApplichemA1101
NaClVWR chemicals27810.364
EDTARoth8043.2
Na2H2PO4ApplichemA1046
NaH2PO<>4ApplichemA3902
ImidazoleApplichemA1073
d-DesthiobiotinSigmaD1411
Ni-NTA SuperflowQiagen1034557
Strep-Tactin SuperflowIBA2-1207-001
Anticorps his-probeSanta Cruzsc-8036
Strep-tactin conjugué HRPIBA2-1502-001
Hi-Load 16/600 Superdex 200 pgGE Healthcare28-9893-35
6 - 8 kDa membrane de dialyseSpectrumlabsspectra/por 1, 132650
50 kDa Membrane de dialyseSpectrumlabsspectra/por 7, 132129
10 kDa unité de filtration centrifugeMerck MilliporeUFC901024
30 kDa unitéMerck MilliporeUFC903024
Spectromètre RMN à état de solution  ;fréquence de fonctionnement d’au moins 500 MHz, équipé d’une cryosonde à triple résonance
Buffer nameComponent
Unfolding Buffer7 M Guanidinium HCl
20 mM Tris, pH 7,5
10 mM DTT
Refolding Buffer10 mM Tris, pH 7,5
2 M NaCl
1 mM EDTA
2 mM DTT
Tampon de dosage25 mM Na2H2PO4, pH 6,8
25 mM NaCl
2 mM DTT

Références

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  3. Musselman, C. A., Lalonde, M., Cote, J., Kutateladze, T. G. Perceiving the epigenetic landscape through histone readers. Nat. Struct. Mol. Biol. 19 (12), 1218-1227 (2012).
  4. Suganuma, T., Workman, J. L. Signals and Combinatorial Functions of Histone Modifications. Annu. Rev. Biochem. 80, 473-499 (2011).
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Reconstitution des nucl osomesHistones marqu es aux isotopesHistone H3Purification de prot inesMembrane de dialyseFiltration sur gelChromatographie d affinitSpectroscopie RMNModifications post traductionnelles

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