L'évaporation de réduction Culture Condition Augmente la reproductibilité de la formation multicellulaire Spheroid en plaques de microtitration

Résumé

La perte inégale de milieu à partir de plaques de microtitrage affecte la reproductibilité des multicellulaire formation sphéroïde tumorale uniforme. L'amélioration des conditions de culture pour réduire la perte moyenne significative permettra d'améliorer la reproductibilité de la formation sphéroïde et les résultats des essais à base de sphéroïde-en utilisant la technique de liquide overlay.

Résumé

Modèles de tumeur qui imitent étroitement dans des conditions in vivo sont de plus en plus populaire dans la découverte de médicaments et le développement pour le criblage de médicaments potentiels contre le cancer. Sphéroïdes de tumeur multicellulaires (MCTSes) imitent effectivement les conditions physiologiques des tumeurs solides, ce qui les rend excellents modèles in vitro pour l' optimisation du plomb et la validation de cibles. Sur les diverses techniques disponibles pour la culture SCTM, la méthode de liquide superposition sur agarose est l'une des méthodes les plus économiques pour la production SCTM. Cependant, le transfert fiable des cultures SCTM utilisant liquide overlay pour le criblage à haut débit peut être compromise par un certain nombre de limitations, y compris le revêtement de plaques de microtitrage (PM) avec agarose et la reproductibilité de la formation MCTS uniforme à travers les puits. Les députés sont nettement sujettes à des effets de bord qui résultent de l'évaporation excessive du milieu de l'extérieur de la plaque, ce qui empêche l'utilisation de la totalité de la plaque pour la droguetests. Ce manuscrit fournit des améliorations techniques détaillées à la technique de liquide overlay pour augmenter l'évolutivité et la reproductibilité de la formation uniforme SCTM. En outre, des détails sur un outil logiciel simple, semi-automatique, et universellement applicable pour l'évaluation des SCTM caractéristiques après le traitement médicamenteux est présenté.

Introduction

Les cellules cancéreuses dans les tumeurs sont disposées dans un plan physiologique, en 3 dimensions (3D) de structure complexe entouré par une matrice extracellulaire et les cellules qui interagissent. Que presque toutes les cellules dans les tissus se trouvent dans un environnement 3D, la nécessité d' une plus physiologiquement pertinente dans des modèles de tumeur in vitro qui imitent les caractéristiques de la tumeur a entraîné le développement de plusieurs techniques de culture 3D ^{1, 2, 3.} Ces modèles sont en train de devenir des outils de recherche fondamentale pour étudier le rôle du microenvironnement tumoral sur les métastases et la cellule de réponse à la thérapeutique en 3D ^2. En outre, par rapport aux cultures (2D) , la cellule 2 dimensions ^4, les modèles 3D permettent une meilleure compréhension des interactions tumeur-stroma, qui affectent les voies de signalisation cellulaires.

sphéroïdes de tumeur multicellulaires (MCTSes) de lignées de cellules cancéreuses sont fréquemment utilisés dans les cellules 3D cmodèles en raison de leur proximité par rapport aux tumeurs in vivo de ulture. Parmi les nombreuses techniques utilisées, la technique de liquide de recouvrement (LOT) de génération SCTM sur des plaques d'agarose revêtues a suscité un intérêt considérable pour l' optimisation de plomb et une cible de validation ^{5, 6, 7, 8, 9, 10, 11.} Cela est évident à partir des études récentes qui ont été en mesure d'exécuter avec succès des écrans pilotes de bibliothèques de composés dans les cultures SCTM utilisant LOT ^{6, 7.} Cependant, la variabilité de SCTM morphologie et la croissance du puits à bien en raison de la perte inégale induite par évaporation du milieu sont des obstacles communs qui accompagnent le LOT en utilisant des plaques de microtitrage (MP). Par conséquent, la formation de non-uniforme MCTSes compromet l'importance et la pertinencedes données provenant des essais pharmacologiques ^{8, 12, 13.} En plus des problèmes de reproductibilité, un autre problème pratique qui affecte des essais à haut débit à base de LOT est le revêtement des députés avec agarose lors de l'utilisation de liquide automatique des unités de distribution. Bien que l'unité de distribution peut être maintenu chauffé afin d' éviter la gélification de l' agarose, l'obstruction de la cassette et le tube de distribution est un problème potentiel pour les systèmes robotiques ^6.

Pour surmonter certains de ces défis, nous avons récemment mis au point quelques modifications dans le LOT pour MCTS culture ^8. Ces modifications sont principalement basées sur les moyens possibles pour empêcher la perte moyenne inégale des députés au moyen d'instruments qui se trouvent couramment dans les laboratoires de criblage à haut débit. Une procédure détaillée de la LOT modifiée pour la génération d'MCTSes de taille uniforme et reproductible à travers 3plaques 84 puits (WPS) est présenté ici. Le manuscrit présente également une routine semi-automatique pour l'évaluation de la taille SCTM, en particulier dans MCTSes, partiellement désintégrés traités avec le médicament qui ne possèdent pas une limite clairement définie pour la mesure de l'aire de section transversale.

Protocole

1. Préparation des plaques d'agarose revêtues

1. Peser 0,75 g de bas point de fusion d'agarose et l'ajouter à 100 ml de milieu 5A de McCoy (avec ou sans rouge de phénol) sans sérum. Chauffer la solution dans un four micro-ondes et agiter toutes les 1-2 minutes pour dissoudre complètement l'agarose. Autoclave la solution pour le stériliser.
2. Refroidir l'autoclave d'agarose à environ 70 ° C et filtrer à travers un 500 ml, 0,22 um filtre supérieur par filtration sous vide dans une zone d'écoulement laminaire. Aliquoter la solution d'agarose filtrée 0,75% (FAS) en petits volumes, sinon en utilisant la totalité de la solution à la fois. Conservez ce agarose solution aseptique prêt à l'emploi dans une chambre froide ou 4 ° C réfrigérateur jusqu'à 4 semaines.
3. Attacher un petit tube avec une plastique- ou d'une cassette de distribution à pointe métallique à un distributeur de réactif combiné et amorcer la cassette avec 70% d'éthanol (EtOH), puis avec une solution saline stérile tamponnée au phosphate (PBS) dans une zone d'écoulement.
4. Avant utilisation, chauffer une partie aliquote stockée de FAS i n micro-ondes pour le faire fondre. Premier la cassette de distribution avec une solution d'agarose et le manteau 384 puits, culture de tissu (TC) a traité des "spéciaux" microplaques avec 15 pi de FAS. Laisser l'agarose dans la plaque refroidir pendant 15-20 minutes avant l'ensemencement des cellules. Stocker les plaques d'agarose revêtues aseptique, enveloppé dans un sac en polyéthylène dans une chambre froide ou à 4 ° C et à l'abri de la lumière directe.
   REMARQUE: Éviter de chauffer répétée de la FAS 0,75% pour éviter un changement de la concentration d'agarose dans la solution mère. des plaques d'agarose revêtues peuvent être stockées pendant jusqu'à 2 semaines lors d'un stockage dans les conditions précitées. Le FAS ne nécessite pas de chauffage pendant le revêtement de plaques.
5. Nettoyer la cassette de distribution par amorçage avec 70-80 ° C de l'eau stérile pour éliminer tout agarose restant dans les conseils et tubes cassettes.

2. Culture cellulaire et MCTS Formation

1. cellules HCT116 de carcinome du côlon humain de la culture, comme décrit précédemmentlass = "xref"> 8.
2. Retirer le nombre requis d'agarose-enduit, 384 puits, TC-traités microplaques de la chambre froide et équilibrer leur température ambiante (RT) pendant 15 min.
3. Préparer le distributeur de réactif Combi pour l'ensemencement des cellules en amorçant une cassette tube de distribution standard avec 70% EtOH et PBS stérile. Réglez le volume d'ensemencement à la pi requise et la vitesse de distribution à moyenne en utilisant les boutons de réglage manuel sur le distributeur.
   REMARQUE: L'ensemble du processus d'ensemencement des cellules est réalisée dans des conditions stériles et dans une zone d'écoulement laminaire.
4. Dissocier les cellules adhérentes à partir du flacon de culture de tissu à l'aide d'une enzyme de dissociation de cellules recombinantes. Faire une suspension de stock de cellules dans un récipient stérile avec des cellules de semence , à une densité de 2,5 x 10 ⁴ cellules / ml par puits dans 50 ul de milieu de croissance complet. Lors de l'ensemencement plus d'un WP-384, mélanger les cellules à l'aide d'un agitateur magnétique, afin de les empêcher de se déposer au fond du bécher.
5. Laisser leplaques de se reposer pendant 30 min à température ambiante puis centrifuger pendant 15 min à 4 x g.
6. Pendant ce temps, prendre un couvercle environnemental évaporation de réduction et le remplir avec 8 ml de H ₂ O stérile ou 5% de diméthylsulfoxyde (DMSO) dans les petits côtés (gauche et droite) en utilisant une pipette de 5 ml (figure 1A). Tout d'abord, verser 4 ml de liquide de remplissage dans le creux de gauche en balayant la pointe de pipette lentement vers le haut et vers le bas. Répétez cette étape avec le creux du côté droit.
   REMARQUE: Assurez -vous que le liquide ajouté aux creux latéraux ne se confond pas au centre du couvercle, et laisser un espace pour l' échange de gaz (figure 1A). L' ajout d' une quantité en excès de H ₂ O conduit à l'infiltration de H ₂ O à l'extérieur du couvercle et par la suite dans les puits externes des plaques à 384 puits TC.
7. Remplir le réservoir de liquide de 384 puits plaque de TC avec H ₂ O stérile et remplacer les couvercles des plaques régulières avec les liquides remplis couvercles environnementaux (figure 2A).
8. Placer les plaques dans un incubateur rotatif à 37 ° C avec 95% d' humidité, 5% de CO ₂ et 20% de O _2, et laisser les cellules se rassemblent dans MCTSes pendant 4 jours. Évitez d'ouvrir la porte de l'incubateur pendant trop longtemps dans les jours suivants afin d'éviter que le niveau d'humidité de tomber brusquement.

3. Medium Exchange à l'aide d'un système robotique

1. Le jour 4 après la formation MCTS, ajouter 30 pi de milieu préchauffé par puits en utilisant un distributeur de microplaques laveur automatique. Autoriser les MCTSes à croître pendant 3 jours supplémentaires. Remplacez le support régulièrement tous les 3 jours, jusqu'à ce qu'ils atteignent la taille souhaitée pour l'expérimentation.
2. Aspirer un volume déterminé de milieu de chaque puits, régler de façon empirique z -hauteur du collecteur de lave - glace. Aspirer 30 pi de milieu par puits et le remplacer par 30 pi de milieu frais, préchauffé.
   REMARQUE: Réglez la vitesse de distribution et la vitesse à laquelle le collecteur de lave-glace se déplace vers le basdans des puits au taux le plus bas pour minimiser la turbulence dans les puits.

4. Haut-contenu Imagerie des SCTM et semi-automatisé d'analyse d'images

1. Image SCTM dans un système d'imagerie automatisée à haute teneur en utilisant un objectif d'air 4X (NA 16).
2. Réglez le temps d'exposition à 11 ms et le binning à 4 x 4. Réglez le nombre et l' espacement des z -stacks et binning de pixel comme souhaité pour l'expérience pour capturer l' ensemble d' un SCTM par puits.
3. Traiter les images par étapes, comme décrit dans le "readme", en utilisant une routine en interne écrite dans un langage de programmation.
   NOTE: Le code de .m et readme fichiers .txt sont disponibles sous forme de fichiers de code supplémentaires (figure 1B). Les mesures de routine de la région de SCTM, axes majeurs et mineurs, le périmètre et la solidité des images 2D.

Figure 1:La préparation de couvercles sur l'environnement et un organigramme de la routine semi-automatique. (A) Image d'un couvercle environnement évaporation réduisant rempli avec le bon ( à gauche) et l' excès ( à droite) quantité de liquide de remplissage (ici, 5% de DMSO). La flèche indique le creux du côté court pour l'ajout de liquide. L'astérisque montre l'écart au milieu du couvercle après l'addition du volume correct de DMSO. (B) Un flux de travail montrant les étapes impliquées dans l'analyse de l' image de routine semi-automatisé. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Résultats

La perte inégale de milieu, en particulier des puits périphériques, est un problème fréquemment rencontré dans les PM avec de petits volumes de culture. Sensiblement l' amélioration des conditions de culture, telles que les incubateurs avec température / systèmes d'humidification bien contrôlée et les députés de l' évaporation de réduction et les couvercles de la plaque, de réduire la perte significative de milieu dans les puits ^8. Pour mesurer l'évaporation relat...

Discussion

Revêtement 384 puits TC Plaques avec Filtré Agarose

La pratique standard dans LOT est d'utiliser un bas point de fusion d' agarose 1-1,5% pour enduire les plaques, ce qui nécessite l'agarose et / ou unité de distribution à garder chauffée pour empêcher la gélification de l'agarose ^6. La gélification de l'agarose est une préoccupation potentielle lors de la préparation de multiples plaques en utilisant des cassettes de distribution de liquide avec de petites ouvertures de...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Agarose	Sigma-Aldrich	A9414
McCOY’s 5A Medium	Sigma-Aldrich	M8403
rapide" Filtre Filtermax	TPP	99505	0.22 &mu ; m, 500 mL
Multidrop&trade ; Distributeur de réactifs combiné  ;	Thermo Fisher Scientific	5840300
Cassette de distribution de petits tubes  ;	Thermo Fisher Scientific	24073295	Pointe en métal
Plaque TC à 384 puits  ;	PerkinElmer	6057308	Type de plaque - CellCarrier
Cassette de distribution de tube standard	Thermo Fisher Scientific	24072670
MicroClime Environmental Lid	Labcyte	LLS-0310
DMSO	Sigma	D4540
Incubateur rotatif (SteriStore )	HighRes Biosolutions	23641	N° de série : D00384
Distributeur de lave-plaques de microplaques  ;	BioTek	Modèle non spécifié	: EL406  ;
Système d’imagerie à haut contenu (CellVoyager)	Yokogawa Electric Corporation	Modèle non spécifié	CV7000
Orange G	New England Biolabs	B7022S
TrypLE&trade ; Réactif de dissociation cellulaire recombinant express	Thermo Fisher Scientific	12604021	Sans rouge de phénol