flexibilité conformationnelle joue un rôle essentiel dans la fonction des protéines. Nous décrivons ici l'utilisation de la spectrométrie de masse à ionisation par électronébulisation couplée à l'échange hydrogène-deutérium résolue dans le temps pour sonder les changements structurels rapides qui favorisent la fonction des protéines ordonné et désordonné.
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Article de méthode
Résolue en temps d'échange hydrogène Ionisation ElectroSpray-deuterium spectrométrie de masse pour l'étude de la structure des protéines et dynamique
Dans cet article
Résumé
Résumé
protéines intrinsèquement désordonnées (PDI) ont longtemps été un défi pour les biologistes structurels en raison de leur manque d'éléments de structure secondaire stable. Hydrogène-deutérium Exchange (HDX) mesurée à des échelles de temps rapide est particulièrement bien adapté pour détecter des structures et des réseaux de liaison hydrogène qui sont brièvement peuplées, permettant la caractérisation de conformères transitoires ensembles natifs. Le couplage de HDX à la spectrométrie de masse offre plusieurs avantages clés, notamment une sensibilité élevée, une faible consommation d'échantillon et aucune restriction sur la taille des protéines. Cette technique a beaucoup progressé au cours des dernières décennies, y compris la possibilité de surveiller HDX temps d'étiquetage à l'échelle de temps de milliseconde. De plus, en intégrant le flux de travail HDX sur une plate-forme microfluidique logeant un microréacteur de protéase acide, nous sommes en mesure de localiser les propriétés dynamiques au niveau du peptide. Dans cette étude, en temps résolu spectrométrie de masse électrospray (Trési-MS) couplé à HDX was utilisé pour fournir une image détaillée de la structure résiduelle de la protéine tau, ainsi que les changements conformationnels induits sur hyperphosphorylation.
Introduction
Au cours des dernières décennies, des progrès importants ont été réalisés dans le développement de techniques analytiques conçues pour mesurer la structure des protéines et de la dynamique 1, 2, 3, 4. Alors que la cristallographie aux rayons X reste le principal outil pour la détermination de la structure des protéines, des concentrations élevées de protéines sont nécessaires est nécessaire et l'optimisation approfondie pour produire des cristaux de qualité de diffraction. Les protéines qui sont difficiles à cristalliser, telles que des....
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Protocole
REMARQUE: S'il vous plaît consulter toutes les fiches de sécurité des matières pertinentes (FS) avant utilisation. Fumées produites par ablation au laser de poly (méthacrylate de méthyle) (PMMA) peuvent être toxiques. Assurez-vous que le graveur laser est relié à un système de ventilation du travail. Utilisez toutes les pratiques de sécurité appropriées lors de la construction du dispositif microfluidique, y compris l'utilisation des contrôles techniques (hotte, collecteur de déchets) et de l'équipement de protection individuelle (lunettes de sécurité, masque, gants, blouse, pantalon pleine longueur, des chaussures fermées). Il est d'une importance ca....
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Résultats
des profils de digestion de la protéine tau-phospho native et étaient similaires, ce qui donne une couverture de séquence de 77,1 et 71,7%, respectivement. Les valeurs d'absorption de deutérium de chaque peptide a été déterminée en ajustant les distributions isotopiques observées avec les distributions théoriques générés en utilisant un logiciel développé FORTRAN en interne. Les meilleures distributions de montage sont représentés (figure 3a) ainsi que les valeurs d&.......
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Discussion
Bien que les méthodes de biologie structurale telles que cristallographie et RMN rayons X sont avantageux car ils fournissent des structures extrêmement détaillées des protéines, ces images sont souvent statiques. La caractérisation des espèces transitoires et les domaines faiblement structurés continue d'être difficile à atteindre quand on l'étudie par ces méthodes conventionnelles. Par conséquent, afin de mieux comprendre dynamiques sur ces types de systèmes, il est important de travailler à des échelles de te.......
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Déclarations de divulgation
Nous n’avons rien à divulguer.
Remerciements
Nous remercions le Dr Markus Zweckstetter d’avoir fourni le fichier de coordonnées pdb pour l’ensemble tau 'natif' prédit à partir de ses travaux de RMN, avec les outils d’analyse fournis par le Dr Adnan Sljoka. Ces travaux ont été financés par le programme de subventions ENGAGE du Conseil de recherches en sciences naturelles et en génie du Canada (CRSNG).
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Poly(méthacrylate de méthyle) ou PMMA | Plastiques professionnels | SACR.250CCP | 8,9 cm x 3,8 cm x 0,6 cm |
| Verre de silice fondue capillaire | Polymicro Technologies | 106815-0018 | ID : 75 µ ; m, OD : 150 & micro ; m |
| Capillaires métalliques | McMaster-Carr | 28 ga &ndash ; 89875K97 30 ga ; - 89875K99 | |
| Tube en éthylène-propylène fluoré (FEP) | IDEX | 1477 1548 | ID : 0.007 », OD : 1/16 » ID : 0.020 », OD : 1/16 » |
| Coupe-tube polymère standard | IDEX | A-327 | pour 1/16 » et 1/8 » Tube OD |
| Micro Statique Mélange Té | IDEX | M-540 | pour 1/16" Tube OD |
| ou | |||
| té en acier inoxydable, 0,25 ; alésage | millimétrique Valco Instruments Co., Inc. (VICI) | ZT1C | pour 1/16" Tube OD PEEK |
| Tee pour 1/16" Tube OD | IDEX | P-727 | |
| 10-32 Femelle à Femelle Luer | IDEX | P-659 | |
| 10-32 PEEK Écrou à deux ailes | Embout IDEX | F-300 | |
| pour 1/16" OD Tubing | IDEX | F-142 | |
| Série 100 Outil rotatif | Dremel | F013010001 | |
| Disques à tronçonner Jobmate | 1/64" d’épaisseur | Stereomaster | |
| Digital Zoom Microscope | Fisher Scientific | 12-563-411 | |
| Fer à souder | Mastercraft | 58-6301-2 | |
| VersaLaser Universel | |||
| Seringues | Hamilton | 81220 | 500 ; et micro ; |
| Pompes à seringue | Appareil Harvard | 70-4501 | |
| Nom | >Entreprise | Numéro de catalogue | Comments |
| Reagents | |||
| NHS-Activated | Agarose Fisher Scientific | 26196 | |
| Pepsine de la muqueuse gastrique porcine | Sigma-Aldrich | P6887-250MG | |
| Oxyde de deutérium | Sigma-Aldrich | 151882-10X0.6ML | |
| Acide acétique | Sigma-Aldrich | 695092-100ML | |
| Eau de qualité HPLC | Fisher Scientific | W5-4 | |
| Acétate d’ammonium | Sigma-Aldrich | A7330-500G | |
| Phosphate de sodium | Fisher Scientific | S369-500 | |
| Chlorure de sodium | Fisher Scientific | S671-3 | |
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Comments |
| Software/Online Tools | |||
| Calculateur | |||
| Version 6.49 | Outil MS open source | ||
| dinger | Version 1.5.0.4 | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Instruments | |||
| QStar Elite Hybrid Q-TOF Mass Spectrometer | AB SCIEX |
Références
- Sapienza, P. J., Lee, A. L. Using NMR to study fast dynamics in proteins: methods and applications. Curr. Opin. Pharmacol. 10, 723-730 (2010).
- Neira, J. L. NMR as a tool to identify and characterize protein folding intermediates. Arch. Biochem. B....
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Réimpressions et autorisations
