Article de méthode

Résoudre les complexes protéiques purifiés par affinité de Blue native PAGE et le profilage de corrélation des protéines

DOI :

10.3791/55498

⸱

1 avril 2017

 ,  ,  , 
1Proteomic Mass Spectrometry, Wellcome Trust Sanger Institute

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ici, nous présentons des protocoles pour la purification par affinité des complexes de protéines et leur séparation par PAGE native bleu, suivie par le profilage de corrélation de la protéine en utilisant le marqueur libre spectrométrie de masse quantitative. Cette méthode est utile pour résoudre interactomes dans des complexes protéiques distincts.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La plupart des protéines agissent en association avec d’autres ; il est donc crucial de caractériser ces unités fonctionnelles afin de bien comprendre les processus biologiques. La purification d’affinité couplée à la spectrométrie de masse (AP-MS) est devenue la méthode de choix pour identifier les interactions protéine-protéine. Cependant, les études AP-MS conventionnelles fournissent des informations sur les interactions protéiques, mais l’information organisationnelle est perdue. Pour résoudre ce problème, nous avons développé une stratégie pour démêler les assemblages fonctionnels distincts dans lesquels une protéine pourrait être impliquée, en résolvant les complexes protéiques purifiés par affinité avant leur caractérisation par spectrométrie de masse. Les complexes protéiques isolés par purification par affinité d’une protéine d’appât à l’aide d’une étiquette d’épitope et d’une élution compétitive sont séparés par électrophorèse native bleue. La comparaison des profils de migration des protéines par le biais du profilage de corrélation à l’aide de la spectrométrie de masse quantitative permet d’attribuer des protéines en interaction à des entités moléculaires distinctes. Cette méthode est capable de résoudre des complexes protéiques de poids moléculaires proches qui pourraient ne pas être résolus par les techniques chromatographiques traditionnelles telles que la filtration sur gel. Avec un peu plus de travail que l’AP-geLC-MS/MS conventionnel, nous démontrons que cette stratégie peut dans de nombreux cas être adéquate pour obtenir des informations topologiques complexes protéiques en même temps que l’identification des interactions protéiques.

Introduction

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Dans les cellules, la plupart des protéines remplissent leurs fonctions par des interactions transitoires protéine-protéine ou par la formation d'assemblages de protéines stables. La caractérisation des interactions protéine est cruciale pour la compréhension des processus cellulaires pleinement. La purification par affinité en combinaison avec la spectrométrie de masse (AP-MS) est l'une des stratégies les plus couramment appliqués pour identifier les interactions entre protéines natives. Des améliorations significatives dans les capacités des instruments obtenus au cours de la dernière décennie ont fait de cette approche extrêmement puissante. Il est important de noter que les interactions identifiées par des expériences AP-MS comprennent un mélange d'associations directes et indirectes entre les appâts et proies. De plus, souvent des protéines participent à plusieurs complexes différents dans le même contexte cellulaire, ce qui pourrait avoir des rôles biologiques différents, et donc les interacteurs qui sont identifiés par AP-MS peuvent représenter un mélange d'assemblages protéiques distincts ou des entités fonctionnelles. Il est impossible de tirerces informations topologiques a priori à partir des listes monodimensionnels de protéines produites par de simples expériences AP-MS. Cependant, la technique peut être davantage exploité pour définir l'architecture des complexes de protéines en le combinant avec une ou plusieurs méthodes pour résoudre ces assemblées.

Afin de résoudre la topologie des interactions des protéines identifiées par AP-MS, plusieurs stratégies ont été appliquées. Une approche consiste à effectuer des expériences itératives AP-MS en utilisant les identifiés dans proies série d'expériences précédentes comme appâts 1. Bien que très instructif, c'est une tâche intensive de la main-d'œuvre à la fois expérimentale et analytique. La réticulation des protéines en combinaison avec la spectrométrie de masse est de plus en plus utilisée pour dériver des informations topologiques sur les complexes protéiques 2, 3, 4, 5. Cependant, computatiol'analyse finale des peptides réticulés reste une tâche difficile et est donc le goulot d'étranglement dans le flux de travail. L'avènement des réactifs de reticulation MS-clivables devrait faciliter la cartographie des résidus d'acides aminés qui sont à proximité immédiate dans des protéines interagissant 6, 7. Une autre alternative consiste à combiner une purification par affinité avec des techniques de séparation antérieur orthogonaux 8, 9. Fractionnement chromatographique par filtration sur gel ou échange d'ions, ou un fractionnement en gradient de saccharose ont également été utilisés récemment en combinaison avec la spectrométrie de masse quantitative pour décrire les complexes multiprotéiques à un niveau de l' échelle du système, sans passer par l'étape d'isolement complexe 10, 11, 12, 13. électrophorèse bleu gel de polyacrylamide natif (BN-PAGE) a été largement appliquée àétudier les interactions des protéines natives, généralement celles impliquant des complexes de protéines de la membrane mitochondriale 14. Cette technique de séparation a également été récemment utilisé en combinaison avec une quantification de protéine sans marquage et le profilage de corrélation, non seulement sur des complexes mitochondriaux 15, 16, 17, mais aussi pour démêler les autres complexes de protéines à partir de cellules entières 18, 19. Nous avons supposé que la combinaison de purification d'affinité avec les approches de fractionnement natives ultérieures et MS quantitative devrait fournir une stratégie utile pour résoudre des assemblages de protéines multiples contenant une protéine particulière.

Nous décrivons ici un procédé qui combine purification d'affinité basée epitope générique par électrophorèse sur gel de Polyacrylamide natif bleu des complexes isolés, suivie par sp de masse quantitativeectrometry et de protéines de profilage de corrélation, pour résoudre les multiples ensembles d'une protéine peut être impliquée. Nous utilisons des cellules souches embryonnaires de souris où une protéine d'intérêt fusionné à un marqueur d'épitope est exprimé à partir du locus endogène pour atteindre près de l'abondance physiologique et assurer natif efficace isolement complexe. Cette approche se défait les multiples interactions d' une protéine exerce, de les résoudre en ensembles distincts en fonction de leurs profils de corrélation, tout en ne nécessitant pas plus de travail que GELC-MS 20 classique.

Protocole

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1. Isolement des complexes protéiques autochtones par FLAG purification d'affinité

  1. Les préparatifs
    1. Mettre en place un bain d'eau à 37 ° C pour la décongélation du culot cellulaire.
    2. Refroidir une microcentrifugeuse à 4 ° C.
    3. Placez plusieurs microtubes de différentes tailles (1,5 ml, 15 ml) et un homogénéisateur dans la glace.
    4. Préparer 10 ml de tampon de lyse (de Tris-HCl pH 8 50 mM, NaCl 150 mM, 0,1% de Nonidet P-40, 1 mM EDTA) et la maintenir dans la glace. Juste avant l'utilisation de la mémoire tampon, ajouter 10 ul de DTT 1 M et un comprimé écrasé d'inhibiteurs de protéases sans EDTA.
  2. Préparation de billes d'anticorps lié,
    NOTE: Les billes revêtues d'anticorps peuvent être préparés jusqu'à une semaine à l'avance et conservé au réfrigérateur jusqu'à ce que nécessaire. La protéine G a une affinité plus élevée que la protéine A pour la plupart des espèces sous-types d'immunoglobulines, à l'exception des IgG de lapin, pour lequel la protéine A a une affinité plus élevée.
    1. Lavez 50 pi de billes magnétiques recouvertes G-Protein: Transfert 50 &# 956; L de la suspension de billes dans un tube de microcentrifugeuse, placer le tube dans l'aimant pour collecter les billes sur le côté du tube et enlever le liquide. Remettre en suspension les billes dans 0,5 ml de PBS-0,01% de Tween-20.
    2. Placer le tube dans l'aimant pour collecter les billes sur le côté du tube et enlever le liquide. Remettre en suspension les billes dans 40 pl de PBS-0,01% de Tween-20. Ajouter 10 ug (10 ul de 1 mg / ml de solution mère) de M2 ​​anticorps anti-FLAG. Incuber avec rotation pendant 20 min à température ambiante.
    3. Placer le tube dans l'aimant pour collecter les billes sur le côté du tube et enlever le liquide. Laver les billes avec 0,5 ml de PBS-0,01% de Tween-20.
    4. Pour la réticulation de l'anticorps aux billes, laver les billes deux fois avec 1 ml de 0,2 M pH 8,2 triéthanolamine. Ensuite, remettre en suspension les billes dans 1 ml de 20 mM DMP (dimethyl pimélimidate) dans 0,2 M, pH 8,2 triéthanolamine (solution DMP doit être préparé frais immédiatement avant utilisation). Incuber avec rotation à température ambiante pendant 30 min.
      5. Placer le tube dans l'aimant. Eliminer le surnageant et remettre en suspension les billes dans 0,5 ml de Tris-HCl pH 7,5 50 mM. Incuber avec rotation à température ambiante pendant 15 min.
  3. Laver les billes 3 fois avec 0,5 ml de PBS-0,1% de Tween-20. Laissez perles dans le dernier lavage jusqu'à ce que nécessaire.
  • purification d'affinité basée FLAG-
    REMARQUE: Prenez soin de ne pas laisser les perles sans tampon pendant une longue période de temps. Tous les tampons et les tubes doivent être conservés dans la glace en tout temps. Le protocole suivant est optimisée pour la purification de complexes protéiques à partir de 2-5 x 10 8 cellules (lysat de protéine de 10 à 20 mg) exprimant des taux endogènes d'une protéine marquée par FLAG 20.
    1. Décongeler le jusqu'à ce qu'il commence à fondre culot cellulaire dans un bain d'eau à 37 ° C. Prenez le tube du bain, faites-le tourner doucement jusqu'à ce que la pastille est complètement dégelé, et placer immédiatement le tube contenant la suspension cellulaire sur la glace.
    2. Ajouter 5 ml de tampon de lyse glacé(Contenant du DTT et des inhibiteurs de protéase) à la suspension de cellules et agiter pour mélanger. Incuber dans la glace pendant 10 min.
    3. Transférer le lysat à un homogénéisateur Dounce froid. Lyse à 20-30 coups à l'aide du pilon serré (jusqu'à ce qu'il n'y a pas de viscosité notable). Transférer le broyat à microtubes froid.
    4. Centrifuger à 18 000 xg pendant 15 min à 4 ° C.
    5. Transférer le lysat autorisé à un tube froid propre. Laisser 50 pi de lysat derrière. Prendre une partie aliquote de 35 ul de lysat pour mesurer la concentration de protéine et de contrôler la purification.
    6. Retirer le PBS-0,1% de Tween-20 à partir des billes. Remettre en suspension les perles avec 1 ml de lysat et mélanger avec le reste du lysat. Incuber le mélange dans une roue tournante à 4 ° C pendant 1-2 h.
    7. Recueillir les billes sur le côté du tube avec l'aimant. Recueillir une aliquote de 30 pi de surnageant et jeter le reste du surnageant. Remettre en suspension les billes dans 0,5 ml de tampon IPP150 (de Tris-HCl pH 8 10 mM, 150 mM de NaCl, 1 mM d'EDTA, 0,1% de NP-40) par pipetage 4-6 fois. Transfert à un tube froid 1,5 ml.
    8. Répéter les lavages avec 0,5 ml de IPP150 deux fois tampon.
    9. Laver perles trois fois avec 0,5 ml de tampon d'élution FLAG native (20 mM de Tris pH Bis-7, 20 mM de NaCl, 0,02% de Nonidet P-40, 1 mM d'EDTA, 200 mM d'acide ε-aminocaproïque). Avec le dernier lavage, transférer les perles à un nouveau tube froid. Retirez soigneusement tampon.
    10. Remettre en suspension les billes dans 100 ul de 200 pg / ml de peptide FLAG 3x dans du tampon d'élution native. Incuber à 4 ° C pendant 10 min avec une rotation douce.
    11. Recueillir les perles avec l'aimant et transférer le surnageant dans un nouveau tube froid.
    12. Répétez les étapes 1.3.10-1.3.11 deux fois. Piscine tous les éluats.
    13. On concentre l'éluat jusqu'à 25 ul dans une unité de filtre centrifuge (10 kDa limite nominale du poids moléculaire seuil de coupure, PES) par centrifugation à 10 000 xg à 4 ° C. Transférer le éluat concentré dans un nouveau tube froid et ajouter 50% Glycerol pour une concentration finale de 5%. L'éluat concentré peut être conservé à 4 ° C pendant la nuit si nécessaire.

    • 2. Bleu natif PAGE

    1. Les préparatifs
      1. Préparer 1 L de 1x natif PAGE Anode Tampon, natif 1x bleu foncé PAGE Cathode Tampon et 1x natif PAGE Light Blue Cathode tampon.
      2. Retirez le peigne d'un gel natif préfabrication 3-12% PAGE et laver les puits deux fois avec natif 1x PAGE bleu foncé Cathode tampon. Remplir les puits avec natif 1x PAGE bleu foncé Cathode tampon. Mettre en place le gel dans le réservoir en cours d'exécution, mais ne pas ajouter Dark Blue Cathode tampon à la chambre cathodique (à l'intérieur).
    2. course électrophorétique
      1. Préparer l'échantillon: A 25 ul concentrées ajouter éluat volume approprié de tampon de charge d'échantillon 4x natif et de 0,5% d'additif de l'échantillon G-250 à des concentrations finales de 1x et 0,005%, respectivement.
      2. Charger l'échantillon et les marqueurs de poids moléculaire natif de laisser un puits vide betweeles n. Charge de 10 à 20 ul de tampon de charge d'échantillon natif 1x dans tous les puits vides.
      3. Remplir la cathode (intérieur) chambre avec 200 ml de tampon bleu foncé natif 1x PAGE Cathode avec soin afin de ne pas perturber les échantillons. Remplir la chambre d'anode (à l'extérieur) avec 550 ml de natif 1x PAGE Anode tampon.
      4. Exécuter le gel à 150 V pendant 30 min. Arrêtez la course, retirez le tampon bleu foncé Cathode avec une pipette sérologique et le remplacer par 1x bleu clair Cathode tampon. Continuer la course pendant 60 minutes. Le gel peut être exécuté à la température ambiante ou à 4 ° C; la température peut avoir un effet sur la structure complexe protéique.
    3. coloration de gel
      1. Ouvrir la cassette de gel et jeter l'une des plaques de la cassette. Le gel reste attachée à l'autre plaque de cassette. Transférer le gel dans un bac ou un récipient contenant suffisamment de solution de fixation (40% de methanol, 2% d'acide acétique) pour couvrir le gel et incuber pendant 30 min sous agitation douce.
      2. Retirez le solut fixatifions et ajouter suffisamment d'eau pour couvrir le gel. Le gel peut être analysé pour référence ultérieure.

    3. Analyse de spectrométrie de masse

    Remarque: Toutes les étapes suivantes doivent être effectuées dans une hotte à flux laminaire, si possible, pour assurer la propreté des échantillons. Toutes les solutions doivent être préparées avec de l'eau de qualité HPLC. Discuter de ce protocole avec le laboratoire de spectrométrie de masse qui procédera à l'analyse.

    1. Les préparatifs
      1. Placer un fond conique plaque de 96 puits au-dessus d'une autre plaque à 96 puits pour recueillir les déchets. Pierce le fond des puits de la plaque à fond conique de 96 puits avec une aiguille 21 G.
      2. Laver les puits de la plaque à 96 puits percé.
        1. Ajouter 200 ul de 50% d'acétonitrile-0,25% d'acide formique dans les puits de la plaque percée. Incuber la pile de plaques dans un agitateur pendant 10 minutes.
        2. Centrifuger à 500 g pendant 1 min de sorte que le liquide coule à travers les trous dans la plaque de collecte des déchets. Jeter le wliquide aste.
        3. Répétez les étapes 3.1.2.1-3.1.2.2 deux fois.
        4. Remplir les puits de la percée plaque à 96 puits avec 150 pi de bicarbonate d'ammonium 50 mM (fraîchement préparé).
      3. Laver les puits d'une filtration centrifuge plaque à 96 puits.
        1. Placer une plaque à 96 puits normale sous la plaque de filtration centrifuge pour recueillir les déchets. Ajouter 200 ul de 50% d'acétonitrile-0,25% d'acide formique à chaque puits de la plaque de filtration centrifuge.
        2. Centrifuger la pile de plaques à 200 x g pendant 1 min. Jeter les déchets.
        3. Répétez les étapes 3.1.3.1-3.1.3.2 deux fois.
    2. excision du gel et en gel digestion
      REMARQUE: Alors que exciser le gel, d'identifier et de faire une note de la tranche de gel aligné sur chacune des normes de protéines. Les étalons de protéine peuvent être utilisées pour estimer des poids moléculaires approximatifs pour toutes les tranches de gel.
      1. Placer le gel avec la plaque de verre sur une surface propre. Trancher la voie contienting l'échantillon en 48 tranches identiques (1,5 mm x 5 mm). Couper chaque tranche en 2-3 morceaux plus petits (à l'exception des cinq dernières tranches en haut du gel) et placer séquentiellement chaque tranche dans un puits de la percée et on lave la plaque à 96 puits.
      2. Ajouter 50 ul d'acétonitrile à chaque puits. Incuber la plaque à secousses pendant 30 à 60 min. Éliminer le liquide par centrifugation comme dans l'étape 3.1.2.2.
      3. Ajouter 200 pi de 2 mM PTCE dans du bicarbonate d'ammonium 50 mM à chaque puits. Incuber la plaque avec agitation par secousses pendant 30 min à température ambiante. Éliminer le liquide par centrifugation comme dans l'étape 3.1.2.2.
      4. Ajouter 200 ul de 4 mM d'iodoacétamide 50 mM dans du bicarbonate d'ammonium à chaque puits. Incuber la plaque avec agitation par secousses pendant 30 min à 37 ° C dans l'obscurité. Éliminer le liquide par centrifugation comme dans l'étape 3.1.2.2.
      5. Ajouter 150 pi de bicarbonate d'ammonium 50 mM, plus 50 ul d'acétonitrile et incuber la plaque avec agitation par secousses pendant 30 min à température ambiante. Répétez cette étape de lavage as de fois que nécessaire jusqu'à ce que toute la couleur bleue est retiré des morceaux de gel.
      6. Déshydrater les morceaux de gel par addition de 200 ul d'acétonitrile pur et incuber sous agitation à température ambiante pendant 20 min jusqu'à ce que les morceaux de gel sont de couleur blanche et opaque. Retirer l'acétonitrile.
      7. Ajouter 150 ul de 0,001 mg / ml de trypsine (qualité séquençage) dans du bicarbonate d'ammonium 50 mM froid à chaque puits. Incuber la plaque sous agitation à 37 ° C pendant 2 h. Après 1 h, vérifier que les morceaux de gel sont recouvertes de liquide; si ce n'est pas le cas, ajouter un autre 50-100 ul de 50 mM de bicarbonate d'ammonium. Après 2 h à 37 ° C, continuer pendant la nuit à la digestion à 25 ° C.
      8. Placer une plaque de fond conique propre sous la plaque contenant un gel, en assurant une orientation correcte des plaques. Collecter le liquide contenant les peptides par centrifugation à 200 g pendant 1 min.
      9. Placer la plaque contenant des peptides dans un évaporateur centrifuge et évaporer le liquide tout en effectuant til prochaine étape.
      10. Ajouter 150 ul de 50% d'acétonitrile-0,25% d'acide formique pour les morceaux de gel. Incuber avec agitation par secousses à 37 ° C pendant 30 min.
      11. Recueillir le liquide dans la plaque partiellement séchée de l'étape 3.2.9 par centrifugation à 200 g pendant 1 min. Continuer la plaque d'évaporation contenant de peptides tout en effectuant l'étape suivante.
      12. Répétez les étapes 3.2.10-3.2.11.
      13. Ajouter 200 ul d'acétonitrile pur dans chaque puits de la plaque contenant les morceaux de gel. Incuber avec agitation à la température ambiante pendant 15 min.
      14. Recueillir le liquide dans la plaque contenant les peptides par centrifugation à 200 g pendant 1 min.
      15. Assurez-vous que la concentration finale d'acétonitrile dans tous les puits est supérieure à 55%. Si nécessaire, ajoutez l'acétonitrile pur supplémentaire.
      16. Transférer les solutions de peptide à la plaque de filtration centrifuge lavé. Placer une plaque de fond conique propre en dessous pour recueillir les peptides. Centrifuger la pile de plaques à 200 x g pendant 1 min.
      17. EVAPORmangé le liquide dans la plaque de fond conique jusqu'à ce que les puits sont complètement secs. La plaque peut être recouvert d'un couvercle en silicone et stocké à -20 ° C à ce stade.
      18. Re-peptides dissoudre dans 32 pi de 0,5% d'acide formique avec une agitation vigoureuse pendant 15 min. Ajouter 8 ul de 400 mM de bicarbonate d'ammonium et incuber avec agitation vigoureuse pendant 15 min. Centrifuger la plaque à 200 g pendant 1 min. Couvrir avec un couvercle de silicone et de stocker la plaque à -20 ° C jusqu'à l'analyse par spectrométrie de masse.
    3. Spectrométrie de masse
      REMARQUE: Analyser les peptides sur un spectromètre de masse à haute résolution en utilisant des méthodes compatibles avec protéomiques de fusil de chasse. acquisition dépendante des données est la plus couramment utilisée LC-MS tandem mis en place pour ce type d'analyse et doit être optimisé pour l'identification des peptides efficaces, ce qui réduit le séquençage redondant et la sélection des candidats sur le bruit de fond. Les spectres de masse dans la première étape de balayage d'analyse de masse (MS1) doit être enregistrée dans le mode de profil. Il est recommandéed pour sélectionner de préférence des ions doublement et triplement chargés d'une deuxième analyse de masse de l'étape (MS2). Une plage de masse m / z 400-1,600 est adapté pour identifier la plupart des peptides entre 8-30 acides aminés gamme. Ici, un protocole d'analyse à l'aide d'un spectromètre de masse Orbitrap est fourni.
      1. Injecter 20 ul d'échantillon par analyse à l'aide de l'échantillonneur automatique d'un système nanoLC-MS / MS. Dessaler et concentrer les peptides sur une colonne phase inverse C18 (100 um id, 2 cm).
      2. peptides séparés sur une colonne C18 analytique (75 pm d'identification, 15 cm) en utilisant un 30 min gradient linéaire de 4-28% d'acétonitrile / 0,1% d'acide formique à 300 nL / min.
      3. Analyse des peptides dans un spectromètre de masse avec un procédé d'acquisition dépendant de 10 données de haut avec les paramètres suivants: Plage de m / z 380-1,600, résolution 30 000 à m / z 400, la largeur d'isolement de 2 Th, exclusion dynamique de ± 10 ppm pendant 45 s , cible de commande automatique de gain à 1 x 10 6 à MS 5000 et MS / MS, le temps d'injection maximum de 150 ms pour la SP et100 ms pour MS / MS.

    4. Analyse des données

    1. L'identification des protéines et la quantification en utilisant MaxQuant
      1. Utiliser le logiciel MaxQuant librement disponible pour identifier et quantifier les protéines dans chaque fraction de gel à partir de la spectrométrie de masse des données brutes.
        REMARQUE: MaxQuant fonctionne sur des données générées par des approches protéomiques fusil d'acquisition dépendant des données. Les données MS des fractions de gel natif bleu doivent être analysées dans le lot d'expériences séparées et non en tant que fractions d'une expérience combinant toutes les tranches de gel. Cochez la case de valeur iBAQ pour effectuer des calculs de stœchiométrie. Des protocoles détaillés pour la recherche de base de données et la quantification des protéines en utilisant MaxQuant sont décrits dans 21, 22.
    2. analyse du profil des protéines en utilisant Persée
      1. Utilisez le logiciel Persée librement disponible pour afficher les profils de migration des protéines identifiées et de les comparer à l'aideanalyses statistiques.
        REMARQUE: Documentation générale sur la façon d'utiliser Persée est disponible à http://www.coxdocs.org/doku.php?id=perseus:user:tutorials. Un ensemble de données de l'échantillon est disponible en tant que données supplémentaires.
      2. Télécharger le fichier proteingroups.txt renvoyé par l'analyse MaxQuant contenant les identifications des protéines et des valeurs de quantification pour toutes les fractions de gel. Remplir les valeurs d'intensité dans la surface principale (figure 1). Une matrice apparaîtra contenant toutes les identifications de protéines en rangées, avec des fractions de gel sous forme de colonnes.
      3. Supprimer des entrées correspondant à inverser résultats, les protéines identifiées uniquement par le site et les contaminants potentiels en sélectionnant les lignes de filtre basé sur colonne catégorique dans les rangées de filtres menu déroulant (Figure 2).
      4. Normaliser les intensités des fractions de chaque protéine à travers le profil contre l'intensité de la protéine totale en sélectionnant Diviser dans le menu déroulant Normaliser, puis Sum (Figure 3). Une nouvelle mAtrix apparaît.
      5. Afficher les diagrammes des profils de migration de toutes les protéines en sélectionnant le profil Tracer dans le menu déroulant de visualisation (Figure 4).
      6. Sélectionnez les lignes de filtre basé sur des valeurs valides dans les lignes de filtrage menu déroulant. Entrez 1 dans le nombre de valeurs valides requises.
      7. Effectuer la classification hiérarchique des protéines identifiées dans toutes les fractions de gel natif bleu en sélectionnant dans le regroupement hiérarchique menu déroulant Clustering / PCA. Décocher la case d'arbre de colonnes (Figure 5). Les grappes sont visualisées dans une carte de chaleur dans l'onglet Clustering à côté de la matrice (figure 6).
      8. Localisez le groupe contenant la protéine appât dans le dendrogramme. D'autres composants de l'amas représentent des protéines co-migrant avec l'appât et sont donc possibles protéines interagissant / sous-unités du même complexe.

    figure-protocol-1 r /> Figure 1. Capture d' écran de la fenêtre de téléchargement de données Persée. La figure montre les étapes de chargement d'identification des protéines et des données de quantification dans Persée. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

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    Figure 2. Capture d' écran de la fenêtre Persée pour le filtrage des entrées correspondant à des contaminants, inverse coups sûrs et protéines identifiées par site. Sélection de lignes de filtre par colonne catégorique ouvre une nouvelle fenêtre pour sélectionner les types d'entrées de protéines à éliminer de l'ensemble de données. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

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    Figure 3. Capture d' écran de la fenêtre de normalisation Persée. Sélection Diviser dans le menu ouvre une nouvelle normalisation fenêtre, avec différentes options. Sélection Sum divise la valeur d'intensité d'une protéine dans chaque fraction par l'intensité totale de cette protéine dans l'ensemble des fractions. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

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    Figure 4. Capture d' écran de Persée montrant les diagrammes des profils de migration. Les protéines peuvent être sélectionnées dans la matrice ci-dessous les profils pour mettre en évidence leur profil correspondant. La barre d'outils peut être utilisé pour éditer et exporter les profils. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.


    Figure 5. Capture de la fenêtre de regroupement hiérarchique Persée. La figure montre les paramètres de classification hiérarchique des protéines à l'aide de Manhattan (L1) métrique de distance. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

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    Figure 6. Capture d' écran de Persée montrant dendrogramme et l' intensité des protéines heatmap. Le flux de travail sur le côté droit du panneau principal indique chaque étape entrepris et la matrice résultante, et peut être utilisé pour annuler toute étape. Le flux de travail peut également se ramifier à partir de toute matrice intermédiaire. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

    1. Calcul de la stoechiométrie par rapport
      1. Sélectionner les sous-unités d'un complexe de protéines en fonction de leur co-agrégation avec la protéine appât et délimiter le pic de profil (s) où ils apparaissent.
      2. Utiliser les valeurs retournées par analyse iBAQ MaxQuant pour chaque sous-unité dans chaque fraction séparément et normaliser par la valeur de iBAQ d'appât correspondant à cette fraction.
      3. Tracer les iBAQs normalisées pour les sous-unités protéiques complexes et appâts pour les fractions du pic sélectionné et appliquer une régression linéaire. Calculer la quantité relative de sous-unité complexe à l'appât en comparant l'évolution de leurs valeurs iBAQ normalisées.
    2. Estimation de la taille complexe protéique
      1. Utiliser les standards de protéines pour calculer des poids moléculaires prédits pour les aligner des tranches de gel natif bleu de la voie de l'échantillon. De ceux - ci, générer un modèle de régression linéaire en traçant des tranches de gel dans l'axe des x et des poids moléculaires dans la axe des y.
        2. Utiliser le modèle pour estimer la plage de poids moléculaire observée du complexe protéique (s) sur la base de la tranche native bleu (s) à partir de laquelle elles ont été identifiées.

    Résultats

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    Le flux de travail de la purification d' affinité de protéine native bleu profil de corrélation par la stratégie de spectrométrie de masse (ABC-MS) est représentée à la figure 7. des complexes de protéines natives autour d'une protéine d'intérêt sont isolés par purification par affinité en utilisant des anticorps contre un marqueur épitopique (dans ce cas FLAG) et une élution compétitive. Les complexes sont résolus par BN-PAGE, et toute voie de gel est excisé en 48 sections, et préparées pour fusil de chasse LC-MS / MS. Des informations quantitatives MS est utilisée pour générer un profil de migration pour chaque protéine identifiée dans la séparation native bleu. Les protéines qui interagissent pour former un complexe affichage distincts profils de migration des pics similaires avec superposables. Quand une protéine d'intérêt participe à plus d'un assemblage, des pics multiples sont observés dans son profil de migration, étant donné les sous-ensembles se trouvent dans le pouvoir de résolution du gel natif bleu. Une comparaison systématique des migles profils de rations peuvent être obtenues par corrélation de la protéine en utilisant le profilage classification hiérarchique. Le dendrogramme et les intensités des pics pour toutes les fractions sont visualisées dans une carte de chaleur, ce qui facilite l'identification de protéines interagissant qui appartiennent à des complexes protéiques distincts (Figure 8).

    Nous avons utilisé cette stratégie pour analyser les partenaires d' interaction de MTA2, une sous - unité de base de la chromatine NuRD remodelage 20 complexe. Comme le montre la figure 9, le profil de migration des deux pics MTA2 affiche d'intensités distinctes entre 700 kDa et 1,2 MDa, avec le pic de masse inférieure affichant une plus grande abondance. D' autres sous - unités de noyau de NuRD, y compris MTA1 / 3, HDAC1 / 2 et Mbd3, ont montré motif de séparation identique, bien que les pics pour certaines des sous - unités, à savoir Chd4, Gatad2a / b et Rbbp4 / 7, ont la distribution de l' abondance inverse (Figure 9A, B). En revanche, le profil de CDK2ap1, un facteur de régulation qui recrute le complexe NuRD de promoteurs de gènes Wnt 23, affiche uniquement le pic de masse plus élevée (figure 9C), et ainsi fait Sall4, un répresseur transcriptionnel qui a également été montré pour se lier NuRD 20, 24, 25. Ainsi, le fractionnement d'affinité des protéines associées à MTA2 purifiées par natif bleu PAGE a été en mesure de résoudre deux formes différentes du complexe NuRD.

    ABC-MS permet également l'identification de nouveaux interacteurs tout en les attribuant à des entités de protéines particulières. Grâce à l' examen des protéines des grappes et des intensités des fractions représentées dans un thermo-plan , nous avons détecté une forte corrélation entre les sous - unités NuRD et WDR5, une sous - unité régulatrice du complexe méthyltransférase MLL 26, avec WDR5 présentant deux pics de migration qui coïncident avec les deux NuRD pEaks (figure 8), ce qui suggère une nouvelle interaction entre WDR5 et NuRD. Nous avons confirmé cette interaction par co-immunoprécipitation et co-migration en chromatographie d'exclusion de taille 20.

    Le choix du calcul de la distance métrique dans la classification hiérarchique influencera la forme des grappes et donc les corrélations. Nous vous recommandons de tester les différents paramètres pour obtenir la meilleure adéquation avec la connaissance de l'interaction existante de la protéine ou complexe d'intérêt. En général , nous avons obtenu de meilleurs résultats avec la mesure de distance de Manhattan (L1) 20. Corrélation de Pearson ou métriques de distance euclidiennes ont également été rapportés pour identifier des complexes basés sur des techniques de fractionnement alternatif 10, 11, 12.

    le quantative données MS obtenues à partir des fractions natives bleues peuvent également être utilisés pour déterminer la stoechiométrie des complexes protéiques. La valeur iBAQ (quantification absolue en fonction de l' intensité) fournit une mesure de l' abondance relative des protéines identifiées 27, 28. Les valeurs iBAQ pour les membres complexes de protéines dans toutes les fractions à l'intérieur d'un pic de profil de migration sont normalisées par rapport à celle de la protéine d'appât pour obtenir des quantités relatives. Les iBAQs normalisés à travers un pic de profil pour un élément complexe protéique donné doit suivre une courbe horizontale, et les valeurs de tendance sont le reflet de la stoechiométrie des protéines en interaction par rapport à la protéine appât. Pour une représentation plus détaillée des calculs stoechiométriques, voir 20.

    figure-results-1
    Figure 7: flux de travail schématique résumant l'ABC-MS stratégie. Ce chiffre est modifié de 20. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

    figure-results-2
    Figure 8. Classification hiérarchique des profils de migration BN-PAGE de interacteurs MTA2. protéines associées MTA2-ont été regroupés en fonction de la similitude de leurs profils de migration. Seul un sous-ensemble de la carte de chaleur contenant le complexe est représenté NuRD (ci-joint dans la zone bleue). La boîte jaune met en évidence la forte corrélation de WDR5 avec le complexe NuRD. Les poids moléculaires ont été annotées estimées à partir des distances de migration des standards protéiques dirigés dans le même gel. Cette recherche a été publiée dans Proteomics moléculaire et cellulaire 20 la Société américaine de biochimie et de Mo Biologie léculaire. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

    figure-results-3
    Figure 9. Profil de migration BN-PAGE de sous - unités et des protéines associées NuRD. A) les sous - unités MTA2 et NuRD présents à un motif d'intensité similaire. B) les sous - unités MTA2 et NuRD avec le motif d'intensité inverse. C) MTA2 et Cdk2ap1, qui est présent seulement dans le poids moléculaire plus élevé entité NuRD. Les poids moléculaires ont été annotées estimés à partir du profil de migration des standards de protéines. Cette recherche a été publiée dans Molecular and Cellular Proteomics 20 la Société américaine de biochimie et de biologie moléculaire._blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

    figure-results-4
    Données supplémentaires: ensemble de données échantillon. fichier proteingroups.txt MaxQuant dérivés contenant des identifications de protéines et des valeurs de quantification d'une expérience ABC-MS. Cette recherche a été publiée dans Molecular and Cellular Proteomics 20 la Société américaine de biochimie et de biologie moléculaire. S'il vous plaît cliquer ici pour télécharger ce fichier.

    Discussion

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    Nous décrivons ici l'utilisation de la purification par affinité suivie par électrophorèse sur gel natif bleu en combinaison avec la spectrométrie de masse quantitative pour résoudre des complexes de protéines. Cette approche offre une méthode pour démêler les listes d'interaction des protéines unidimensionnels dans des assemblages de protéines fonctionnelles.

    Nous démontrons la méthode basée sur l'utilisation des protéines marquées épitope. Toutefois, si une lignée cellulaire exprimant une protéine étiquetée n'est pas disponible, une alternative pourrait être d'utiliser des anticorps contre la protéine d'intérêt, à condition qu'il y est un peptide disponible pour obtenir une élution compétitive native. La quantité de matière première et de la quantité de perles pourrait devoir être modifiée en fonction du niveau d'expression de la protéine cible. Nous effectuons généralement ce protocole avec 2-5 x 10 8 cellules matériau de départ, ce qui est suffisant même pour des protéines ayant des niveaux bas d'expression. La composition du tampon de lyse doit être choisie de manière empirique pour obtenirprès de compléter solubilisation de l'appât. Cela peut être difficile pour certains types de protéines, en particulier chromatine de liaison ou des protéines membranaires. D' autres options comprennent l' augmentation de la quantité de sel, à condition que le complexe de protéine à l'étude est stable à teneur élevée en sel, ou en utilisant la sonication et / ou un traitement à la nuclease pour des protéines de liaison de la chromatine 20, 29. Dans le cas de protéines membranaires, de détergent ou de commutation à DDM digitonine 30 peut être souhaitable. Dans le cas des protéines de liaison d' ADN, il est utile d'inclure une nuclease telle que la Benzonase au cours de l'étape de purification 20. L'élimination complète des acides nucléiques assure que les interactions entre les protéines détectées se produisent et ne sont pas médiées par ADN.

    Un élément essentiel à considérer lors de l'utilisation de cette approche est la stabilité du complexe sous enquête. La procédure est longue et peut impliquer preserving la protéine complexe pendant la nuit. Nous avons obtenu un bon succès avec deux complexes de remodelage de la chromatine (D. Bode et M. Pardo, données non présentées), mais cela doit être évaluée. L'étape de purification par affinité peut être réduite si nécessaire.

    Des techniques alternatives qui permettent le fractionnement natif, comme la chromatographie d'exclusion stérique, ont été largement utilisés depuis plus de 50 ans pour caractériser des complexes de protéines. Nous et d' autres ont montré que la résolution native est bleu PAGE supérieure à celle obtenue par chromatographie d'exclusion de taille 20, 31, 32, 33. Un autre avantage de bleu natif PAGE est qu'il ne nécessite pas de systèmes de chromatographie, qui sont coûteux, mais utilise plutôt protéines équipement électrophorétique qui est très répandu dans les laboratoires. En termes de mains sur le temps, cette méthode ne comporte pas plus de travail que le GELC-MS / MS traditionnel unPPROCHE ou le fractionnement par chromatographie en phase hors ligne. Cependant, comme la plupart des techniques de fractionnement font, il a une limite à leur résolution. Complexes qui sont très homogènes ou à proximité de la masse et la forme peuvent être au-delà de la résolution offerte par native bleu PAGE, et par conséquent le protocole tel que rapporté ici pourrait ne pas réussir universellement dans la résolution de complexes distincts avec des sous-unités partagées. Il est encourageant, nous avons réussi à séparer deux complexes tétramères très similaires partageant trois sous-unités (M. Pardo, manuscrit en préparation).

    Étant donné que la spectrométrie de masse est devenue de plus en plus sensibles à des quantités, même infimes de interacteurs et des contaminants non spécifiques peuvent être détectés dans les échantillons AP-MS. L'approche présentée ici pourrait aider à la discrimination interacteurs réelle de la contamination de fond dans la purification d'affinité en focalisant l'attention sur les protéines avec des pics de migration qui coïncident avec les pics de migration d'appât à poids moléculaire plus élevé que celui deles protéines monomères.

    Plusieurs groupes ont utilisé des techniques de fractionnement de protéines suivie par le profilage de corrélation pour délimiter des complexes de protéines à l' échelle cellulaire sans la nécessité d' un isolement préalable 10, 11, 12, 34. Toutefois, cela peut entraîner l'échec de détecter les interactions sous-stoechiométriques. L'incorporation d'une étape d'enrichissement par la purification d'affinité peut aider à surmonter cela. L'approche décrite ici devrait être généralement utile pour explorer la topologie des complexes de protéines et dévoilez les multiples complexes d'une protéine donnée participe à l'intérieur du même contexte cellulaire. La stratégie est simple et prête à des laboratoires qui peuvent ne pas disposer d'un équipement de fractionnement chromatographique coûteux à résoudre des complexes de protéines.

    Déclarations de divulgation

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    Les auteurs n’ont rien à divulguer.

    Remerciements

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    Ce travail a été financé par le Wellcome Trust (WT098051).

    Matériaux

    Liste des matériaux utilisés dans cet article
    NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
    Protéine G DynabeadsLife Technologies10003D
    Anticorps FLAG M2Sigma-AldrichF1804
    Tween-20, qualité protéique, solution à 10 %Millipore655206
    Diméthyl pimelimidateSigma-Aldrich80490
    0,2 M Tampon de triéthanolamine, pH 8,2Sigma-AldrichT0449
    3x FLAG peptideSigma-AldrichF4799
    Vivaspin 5K NMWCO, PESSartoriusVS0112
    NativePAGE 3-12 % Bis-Tris gelLife TechnologiesBN1001
    20x NativePAGE Running BufferLife TechnologiesBN2001
    20x NativePAGE Cathode AdditiveLife TechnologiesBN2002
    4x Tampon de chargement d’échantillon NativePAGELife TechnologiesBN2003
    NativeMARKLife TechnologiesLC0725
    NativePAGE 5 % G-250 échantillon additif  ;Life TechnologiesBN2004
    Nunc à fond conique à 96 puits, polypropylèneThermo249944
    Multiscreen HTS Système de filtration à 96 puitsThermoMSDVN6550
    Nunc à 96 puits naturelThermo276002
    TCEP (chlorhydrate de Tris(2-carboxyéthyl)phosphine)Sigma-Aldrich646547
    IodoacétamideSigma-AldrichI1149
    Acétonitrile, grade HPLCFisher ScientificA/0627/17
    Trypsine, grade de séquençageRoche11418475001
    MaxQuant (logiciel)N.A.N.A.http://www.biochem.mpg.de/5111795/maxquant
    Perseus (logiciel)N.A.N.A.http://www.biochem.mpg.de/5111810/perseus

    Références

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    Mots-clés

    Protein Complex ResolutionAffinity PurificationMass Spectrometry AnalysisNative Gel ElectrophoresisCompetitive ElutionProtein Migration ProfilingHierarchical ClusteringSubcomplex Identification

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