Un modèle de souris transmissible transitoirement IL-8 pour le<em&gt; In vivo</em&gt; Suivi à long terme des réponses inflammatoires

Résumé

La méthode décrite ici permet la visualisation de l'activation de l'inflammation dépendante du promoteur de l'IL-8 dans les poumons de la souris par une imagerie bioluminescente non invasive (BLI). Le même animal peut être soumis à BLI à plusieurs reprises pendant jusqu'à deux mois à partir du moment de la livraison de la construction de journaliste de luciférase.

Résumé

L'inflammation des voies respiratoires est souvent associée à des infections bactériennes et représente un déterminant majeur de la maladie pulmonaire. La détermination in vivo des capacités pro-inflammatoires de divers facteurs est difficile et nécessite des procédures terminales, telles que le lavage broncho-alvéolaire et l'élimination des poumons pour une analyse in situ , empêchant une visualisation longitudinale dans la même souris. Ici, l'inflammation pulmonaire est induite par l'instillation intratrachéale du surnageant de culture de Pseudomonas aeruginosa (SN) chez des souris transitoires transitoires exprimant le gène rapporteur de la luciférase sous le contrôle d'un promoteur bovin IL-8 hétérologue. L'expression de la luciférase dans le poumon est contrôlée par une analyse de l'image bioluminescente in vivo (BLI) sur un intervalle de temps de 2,5 à 48 heures après l'instillation. La procédure peut être répétée plusieurs fois en 2 à 3 mois, permettant ainsi l'évaluation de la réponse inflammatoire chez les mêmes souris avecLa nécessité de mettre fin aux animaux. Cette approche permet de surveiller les facteurs pro et anti-inflammatoires agissant dans le poumon en temps réel et semble approprié pour les études fonctionnelles et pharmacologiques.

Introduction

Les maladies pulmonaires chroniques, comme l'asthme, la maladie pulmonaire obstructive chronique (MPOC), la fibrose kystique (FC) et la broncheectasie, se caractérisent par une inflammation des voies aériennes. L'inflammation des voies respiratoires se caractérise par un œdème, une infiltration cellulaire, une activation des lymphocytes T et des mastocytes, une augmentation des sécrétions des voies aériennes et un dépôt excessif de collagène. Les FC sont un trouble multisystémique et sa principale cause de mortalité et de morbidité est l'infection bactérienne pulmonaire par une augmentation de l'exacerbation pulmonaire. Le déclin de la fonction pulmonaire prédit un résultat nettement plus faible ^{1 , 2 , 3 , 4} .

L'état d'inflammation des voies respiratoires est habituellement observé grâce à l'évaluation des marqueurs immunologiques recrutés pendant le processus inflammatoire dans des matières dérivées des voies aériennes inférieure et supérieure, telles que les expectorations, qui fournissent des rés variablesUlts. Des bronchoscopies sont également effectuées ⁵ . Les modèles murins sont des outils précieux pour étudier la pathogenèse et l'évolution des maladies caractérisées par une inflammation des voies respiratoires et pour lesquelles des traitements ou des traitements efficaces n'ont pas encore été identifiés. Des modèles animaux d'infection pulmonaire et d'inflammation ont été utilisés pour étudier l'asthme et les interactions hôte-pathogène, y compris le rôle des produits chimiques qui simulent des conditions humaines ( p. Ex., Exposition à la fumée de cigarette, LPS, élastase, ovalbumine, poly I: C, etc. Ainsi que des combinaisons de ce qui précède) ⁶ . La mesure des paramètres liés à l'inflammation nécessite le sacrifice des animaux, car des approches invasives sont nécessaires pour mesurer des facteurs tels que la charge bactérienne, les cytokines dans les poumons et le liquide de lavage broncho-alvéolaire (BAL) collecté. En outre, des examens histologiques sont souvent nécessaires. La possibilité d'obtenir des informations sur la cinétique de réponse inflammatoire nécessite l'utilisation de numDes souris erreuses. Par conséquent, une technique qui permettrait d'obtenir de telles informations sans avoir à sacrifier les animaux est précieuse sur les bases techniques, éthiques, économiques et opérationnelles.

L'IL-8 est un acteur essentiel dans le processus d'inflammation, en recrutant des leucocytes sur le tissu enflammé. Il représente une lecture moléculaire pour l'étude de l'activation des voies inflammatoires. MIP-2 et KC peuvent être des homologues fonctionnels de l'IL-8 humaine chez la souris. Les souris n'expriment qu'un seul récepteur potentiel d'IL-8, un homologue de CXCR2 ^{7 , 8} humain, mais ils sont capables de moduler un promoteur de gène IL-8 hétérologue qui conduit un gène rapporteur. Un modèle murin d'inflammation pulmonaire a récemment été développé après l'observation selon laquelle un promoteur de promoteur IL-8 bovin / révélateur luciférase peut être transactivé chez la souris. Cette fonctionnalité permet l'utilisation de l'imagerie bioluminescente (BLI) pour surveiller la réponse inflammatoire en vivant unNimaux ⁹ .

Ce modèle a été adapté pour étudier l'inflammation déclenchée par les exoproduits bactériens ( p. Ex. LPS ou produits libérés par des souches bactériennes) ou TNFalpha ^{10 , 11} . Le processus de découverte de médicaments se concentre sur le développement et l'optimisation de molécules anti-inflammatoires anciennes et nouvelles qui peuvent traiter les maladies pulmonaires, telles que les FC, l'asthme et la MPOC. Ces nouvelles entités chimiques doivent être testées rapidement et commodément dans des modèles animaux qui peuvent être liés à des phénotypes cliniques spécifiques afin de faciliter la conception d'essais cliniques intelligents.

Protocole

Toutes les expériences animales décrites ont été approuvées par le comité intramural d'aide animale pour l'expérimentation animale par le Centre interministériel du service de recherche expérimentale à l'Université de Vérone et se conforment à la directive européenne 2010/63 UE, italien D.Lgs 26/2014 et la révision "Guide pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire", Washington, DC: National Academy Press, 1996. Ce protocole et cette expérimentation ont été approuvés par les National Institutes of Health (n 273/15). Les animaux avaient un accès gratuit à l'eau de robinet ramifiée normale et ont été acclimatés pendant au moins 5 jours aux conditions locales de vivarium (température ambiante: 20 à 24 ° C; humidité relative: 40 à 70%; cycle lumière-sombre: 12 h ) Avant tout traitement.

1. Livraison de gène in vivo

1. Utiliser un capot à écoulement laminaire pour préparer les complexes de réactifs d'administration in vivo / acide nucléique.
2. Définir le protocole expérimental aNd paramètres suivant les instructions in vivo du fabricant.
   1. Utilisez un volume d'injection total de 200 μl de complexes par souris.
   2. Commencer par 40 μg d'ADN en suspension dans de l'eau exempte d'endotoxines; La gamme d'optimisation peut atteindre 60 μg.
      NOTE: La concentration finale d'acide nucléique dans le volume d'injection ne doit pas dépasser 0,5 μg / μL, selon les instructions du fabricant.
   3. Utiliser un rapport N / P de 6 à 8 (0,12 - 0,16 μL de réactif d'administration par μg d'acide nucléique). Calculez le volume correspondant du réactif de livraison.
      NOTE: Les complexes doivent être cationiques pour une entrée efficace des cellules. Le rapport N / P est défini comme le nombre de résidus d'azote (N) sur le réactif d'administration in vivo par phosphate d'acide nucléique (P) et représente la mesure de l'équilibre ionique dans les complexes.
3. Diluer la quantité calculée (voir étape 1.2.1) d'acide nucléique dans 5% de glucose (concentré finalRation) en utilisant une solution stock de glucose à 10% (fournie) et de l'eau stérile. Assurez-vous que le volume de dilution est la moitié du volume d'injection final. Vortex doucement ou mélangez par pipettage vers le haut et vers le bas.
4. Diluer la quantité calculée (voir étape 1.2.3) du réactif de livraison dans la moitié du volume d'injection de 5% de glucose (concentration finale) en utilisant la solution stock de glucose à 10% (fournie) et l'eau stérile. Vortex doucement et tournez à 13 000 xg pendant 15 s.
5. Ajouter les réactifs d'administration dilués ci-dessus à l'acide nucléique dilué tout à la fois. Mélangez-les par vortexage doux et faites tourner à 13 000 xg pendant 15 s.
6. Incuber le mélange de l'étape 1.5 pendant 15 minutes à température ambiante.
   REMARQUE: à partir de ce moment, les complexes sont stables pendant 4 h à température ambiante et jusqu'à 7 jours lorsqu'ils sont conservés à 4 ° C.
7. Effectuer des injections de veine de queue en utilisant des complexes équilibrés à température ambiante. Placez la queue de la souris dans de l'eau chaude (50 - 53 ° C) pendant 30 s pour permettre la dilatation de la veine.
   1. Placez la souris à l'intérieur du dispositif de retenue. Insérez une aiguille de calibre 27 à 30 dans la veine de queue à un angle de 20 à 30 ° et injectez lentement 200 μL. À la fin, retirer l'aiguille et appliquer une pression sur le site d'injection.
      REMARQUE: Un léger renflement dans la queue lors de l'injection indique un positionnement incorrect. Si cela se produit, retirez l'aiguille et répétez le processus proximal au site précédent.
8. Visualiser l'expression du gène en effectuant le BLI in vivo (voir étape 2) à 24 et 48 h après l'injection intraveineuse.

2. In Vivo BLI

REMARQUE: Préparez préalablement une solution stock spéciale de 15 mg / mL de D-luciférine dans du DPBS, filtrez-la en utilisant une unité de filtrage de 0,22 μm et rangez-la à -20 ° C.

1. Placez les souris dans une chambre d'anesthésie en plexiglas transparente. Assurez-vous que la chambre isoflurane est pleine. Lorsque vous êtes prêt à anesthésier les animaux, assurez-vous que la pompe (lEft) et les commutateurs de chambre (droite) sont allumés. Tournez la molette isoflurane à 2,5% pour l'induction et 2% pour la maintenance. Les animaux à l'intérieur de la chambre IVIS sont maintenus sous une anesthésie isofluorane à 2,5% lors de l'acquisition de l'image.
2. Une fois que les souris sont totalement anesthésiées, injecter 10 mL / kg de poids corporel de la solution de D-luciférine par voie intraperitoneale 15 minutes avant l'imagerie.
   NOTE: Une étude cinétique sur la D-luciférine doit être effectuée pour déterminer l'heure du pic du signal après l'administration de la D-luciférine.
3. Ouvrez le système d'imagerie in vivo et préparez la chambre d'imagerie en la doublant avec un morceau de cartouche noire (jetez dès l'achèvement). Placez les cônes du nez au besoin pour une anesthésie correcte (utilisez un cône par souris).
   REMARQUE: Le tube qui fournit l'anesthésie à l'instrument est divisé de sorte que la même concentration d'anesthésie soit intégrée aux collecteurs d'anesthésie situés à l'intérieur du système d'imagerie.
4. Transférer les souris (jusqu'à 5) de la bBoeuf au cône du nez attaché au collecteur dans le système d'imagerie et ferme la porte. L'acquisition d'image dure 5 min.
5. Acquérir un BLI en utilisant le logiciel du fabricant, comme suit.
   1. Initialiser le logiciel. Dans le panneau de contrôle d'acquisition du système d'imagerie in vivo , mettez une marque à côté de Luminescent . Confirmez que le paramètre Filtre d'excitation est Bloc et le paramètre Filtre d'émission est Ouvert.
   2. Cliquez sur les flèches: pour le mode Luminescent Imaging, sélectionnez un temps d'exposition de 5 minutes, Binning 8 et F / Stop 1; Pour le mode d'imagerie photographique, sélectionnez Binning 4 et F / stop 8.
   3. Dans la liste déroulante Champ de vision, sélectionnez D, 19 cm, et une hauteur de sujet de 1,5 cm. Cliquez sur Acquisition lorsque vous êtes prêt à acquérir l'image.
6. Lorsque l'acquisition de l'image est terminée, placez les souris dans leurs cages.
7. Quantifier les photons émis par des régions spécifiques en utilisant le logiciel du fabricant.
   1. Cliquez Outils ROI dans la palette d'outils. Dans les outils ROI , sélectionnez le ROI de mesure dans la liste déroulante Type.
   2. Cliquez sur l'icône Carré et tracez un ROI carré avec les dimensions appropriées pour couvrir le thorax d'un animal. Copiez et collez le ROI pour chaque animal pour obtenir des ROI avec les mêmes dimensions. Dans le panneau Outils ROI, cliquez sur Mesurer ROI pour obtenir les mesures de l'intensité totale dans les ROI.
   3. Observez les données de mesures ROI pour tous les ROI créés dans les images ou les séquences pendant une session (un ROI par ligne). Cliquez sur Exporter et sélectionnez le dossier où le fichier sera enregistré.

3. Défi de la souris avec des stimulations pro-inflammatoires

REMARQUE: Avant le défi de la souris avec des stimuli pro-inflammatoires, vérifiez l'activation de base par BLI i n vivo (voir étape 2). Au moins 7 jours doivent passer entre la délivrance génétique in vivo et le mousDéfi pour permettre à l'inflammation légère et transitoire de disparaître.

1. Préparez l'équipement pour l'instillation intratrachéale (voir Figure 1 et Figure 2 ).
   1. Raccorder les seringues jetables de 5 ml avec le ressort (C, E), une seringue de 100 μL (B) et une jauge jetable (D) sur le robinet à 3 voies (A). Placez le système sur le support (H). Placez le système sur le support (H).
   2. Connectez le tube médical micro PE190 (F) à la jauge jetable (D) et au stylo siècle (G).
   3. Remplissez la seringue de 5 mL avec 800 μL d'air et tournez le robinet à 3 voies.
      REMARQUE: Remplir le tube avec le surnageant de culture Pseudomonas aeruginosa en aspirant 50 μl dans la seringue de 100 μl.

Figure 1: Représentation schématiqueNtation d'un composant unique du dispositif intratrachéal.
(A) robinet à 3 voies, (B) seringue de 100 μL Hamilton, (C) seringue jetable 5 mL, (D) jauge jetable, (E) seringue 5 mL jetable à ressort, (F) tube médical PE190 micro , (G) pen century, and (H) support. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2: Représentation du périphérique intradubraque assemblé.
Les identifications sont identiques à celles de la figure 1 . Cliquez s'il vous plaitIci pour voir une version plus grande de ce chiffre.

2. Anesthésier les souris à l'aide d'une chambre d'évaporateur d'isoflurane réglée à 2,5% d'isoflurane mélangé à de l'oxygène.
3. Surveiller l'animal pour évaluer les effets de l'anesthésie après 3 à 5 min.
   REMARQUE: Pour confirmer que la souris est complètement anesthésiée, surveillez attentivement les signes suivants: la vitesse de respiration ralentie devrait ralentir, le manque d'étirement du bras lorsqu'il est pris par le cou et un manque de réponse lorsque les membres postérieurs sont stimulés. Attendez quelques minutes supplémentaires et vérifiez à nouveau avant de passer à l'étape suivante si ces critères ne sont pas respectés.
4. Placez la souris anesthésiée sur la plate-forme d'intubation en plexiglas, en la suspendant par ses incisives, qui sont placées sur le fil.
5. Allumez le laryngoscope avec la main gauche (pour les chercheurs droitiers) et prenez une paire de pinces à extrémités franches. Utilisez la pointe du laryngoscope et la pince pour ouvrir doucement la bouche.
6. Tirez la langue et hVieux sur le côté en utilisant la pince. Guidez la lame du laryngoscope vers l'arrière de la bouche. Gardez le laryngoscope pressé très doucement à un angle de 90 ° jusqu'à ce que l'ouverture de la trachée soit visible. Tenez le laryngoscope en place.
7. En utilisant d'autre part, prenez le tube de distribution connecté à la fin du tube PE et insérez-le dans la trachée. Faites pivoter la valve à trois voies pour délivrer l'inoculum. Retirez le tube de la trachée le plus tôt possible. Maintenez la souris enfoncée pendant quelques secondes pour permettre l'inhalation d'inoculum dans les poumons.
   REMARQUE: Les souris vont étouffer et mourir si la trachée est bloquée pendant trop longtemps.
8. Retirez la souris de la plate-forme. Le temps de récupération peut varier en fonction des souches; Surveillez la souris avec diligence, en veillant à ce que l'animal soit complètement éveillé dans les 30 minutes suivant la procédure.
9. Injecte intrapéritoné 150 mg / kg de D-luciferine et image les poumons en utilisant un système d'imagerie in vivo 4, 24 et 48 h après l'intratrachéalInstillation des stimuli. Quantifier les photons émis par des régions spécifiques en utilisant le logiciel du fabricant.

Résultats

Le modèle de souris transgénique transitoire bIL-8-Luc a été utilisé pour la surveillance in vivo de l'inflammation pulmonaire chez des souris ayant du défi de surnageant bactérien concentré (30x) contenant des facteurs de virulence sécrétés. La réponse inflammatoire induite était détectable par imagerie in vivo comme une augmentation du signal BLI. L'activité pro-inflammatoire était nettement détectable 2,5 h post-instillation, bien que le signal BLI atteigne l...

Discussion

Dans un travail précédent ¹¹ , un contraste entre les marqueurs BLI et BAL de BIL-8-Luc-dependent a été montré. Il s'est appuyé sur le degré différentiel de sensibilité dans les souches de souris ¹² . Pour cette raison, la première application du modèle bIL-8-Luc à une souche de souris différente nécessite une étude initiale de la réponse inflammatoire, à la fois en termes de BLI et de marqueurs inflammatoires plus standardisés.

La transfec...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
FMT 2500 Système de tomographie par fluorescence	Perkin Elmer Inc.	Constructeur
IVIS Lumina série II Préclinique In Vivo ; Système d’imagerie	Perkin Elmer Inc.	Constructeur
MMPsense 750 FAST	Perkin Elmer Inc.	NEV10001EX	Protéger de la lumière, ranger la sonde à 4 ° ; C
Femelle consanguine BalbC	Harlan Laboratories Italie		Avant l’utilisation, les animaux ont été acclimatés pendant au moins 5 jours aux conditions locales du vivarium
Plasmide bIL-8-Luc	Département des sciences médicales vétérinaires, Université de Parme, Italie		Stocker le plasmide à -20 ° ; C
pGL3vector de base	Promega	E1751	Stocker le vecteur à -20 ° ; C
JetPEI Réactif de transfection d’ADN	Polyplus transfection	201B-001G	Le mélange d’ADN et de JetPEI a été formulé avec un rapport N/P final de 7
D-luciférine sel de potassium 1 g	Perkin Elmer Inc.	122796	Protéger de la lumière, conserver à -20 °C C
Logiciel d’image vivante	Caliper Life Sciences,Experimental	Builder
Isoflurane	ESTEVE spa	571329.8	Ne pas inhaler
le Bio-Plex Cytokine Assay Kit	Bio-Rad Laboratories	M60-009RDPD	Stocker le kit non ouvert à 4 ° ; C
Compteur de cellules automatisé	Dasit XT 1800J	Constructeur
Penn-century modèle DP-4M Insufflateur de puissance sèche	Penn-century	DPM-EXT
Système d’anesthésie gazeuse XGI-8	Perkin Elmer Inc.	Experimental Builder
PE190 micro tube médical	2instruments biologiques snc	BB31695-PE/8
Seringue sans aiguille 5 mL	Terumo	SS*05SE1	Couper les planches du piston à l’aide d’un ciseau
Hamilton 0,10 mL (modèle 1710)	Gastight	81022
Discofix Robinet d’arrêt 3 voies	Braun	4095111
Seringue avec aiguille 1 mL	Pic solution	3,071,260,300,320	Utilisation sans aiguille
Tubes d’alimentation en plastique 18ga x 50 mm	2instruments biologiques snc	FTP-18-50	Couper obliquement la pointe  ;

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