Une approche fondée Spectrométrie liquide tandem chromatographie-masse pour l&#39;analyse des Métabolite<em&gt; Staphylococcus aureus</em

Résumé

Nous décrivons ici un protocole pour l'extraction des métabolites à partir de Staphylococcus aureus et leur analyse ultérieure par Chromatographie liquide et spectrométrie de masse.

Résumé

Dans un effort pour contrecarrer les bactéries pathogènes, les hôtes limitent souvent la disponibilité des nutriments sur le site de l'infection. Cette limitation peut modifier les abondances des métabolites clés qui répondent facteurs réglementaires, l'ajustement du métabolisme cellulaire. Ces dernières années, un certain nombre de protéines et d'ARN ont émergé comme des régulateurs importants de l'expression des gènes de virulence. Par exemple, la protéine CodY répond à des niveaux d'acides aminés à chaîne ramifiée et GTP et est largement conservée dans bas G + C des bactéries Gram-positives. En tant que régulateur global dans Staphylococcus aureus, CodY contrôle l'expression de douzaines de gènes de virulence et métaboliques. Nous présumons que S. aureus utilise CodY, en partie, de modifier son état métabolique dans un effort d'adaptation aux conditions de limitation de nutriments potentiellement rencontrés dans l'environnement hôte. Ce manuscrit décrit un procédé pour l' extraction et l' analyse des métabolites provenant de S. aureus en utilisant la chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de massespectrométrie, un protocole qui a été développé pour tester cette hypothèse. La méthode met également en évidence les meilleures pratiques qui assureront la rigueur et la reproductibilité, comme le maintien de l'état d'équilibre biologique et l'aération constante sans l'utilisation des cultures de chémostat continue. Par rapport aux USA200 sensibles à la méthicilline de S. aureus souche parentale isoler UAMS-1, le mutant isogénique codY présentait une augmentation significative des acides aminés dérivés de l' aspartate (par exemple, threonine et isoleucine) et des diminutions de leurs précurseurs (par exemple, l' aspartate et O -acetylhomoserine ). Ces résultats sont en bonne corrélation avec les données de transcription obtenus avec l' analyse de l' ARN-seq: gènes dans ces voies ont été régulés à la hausse entre 10 et 800 fois dans le mutant nul codY. Le couplage des analyses globales du transcriptome et métabolome peut révéler comment les bactéries modifient leur métabolisme lorsqu'ils sont confrontés à un stress environnemental ou alimentaire, fournissant un aperçu potentiel dans les Physchangements siologiques associés à l'épuisement des nutriments a connu au cours de l'infection. Ces découvertes peuvent ouvrir la voie à la mise au point de nouveaux anti-infectieux et thérapeutiques.

Introduction

Les bactéries pathogènes doivent faire face à de nombreux défis dans l'environnement hôte. En plus d'attaque directe par les cellules immunitaires, l'hôte séquestrant également des nutriments essentiels pour la survie et la réplication bactérienne, générant une immunité nutritionnelle ^{1, 2.} Pour survivre à ces environnements hostiles, les bactéries pathogènes déploient des facteurs de virulence. Certains de ces facteurs permettent aux bactéries d'échapper à la réponse immunitaire; D' autres facteurs comprennent sécrétées enzymes digestives, telles que l' hyaluronidase, thermonucléase, ....

Protocole

1. Préparation de tampon Solutions

1. Préparer une solution saline tamponnée au phosphate (PBS; pH 7,4) par dilution d'une solution mère de 10 x PBS à une concentration finale de 1 x avec ultrapure (distillée et désionisée) de l'eau.
2. Préparer la solution de trempe en combinant 2 ml d'acétonitrile, 2 ml de methanol, 1 ml de H ₂ O ultrapure, et 19 ul (0,1 mM de concentration finale) d'acide formique.
3. Préparez solvant LC-MS A par addition d'acide formique (0,2% [v / v] de concentration finale) de l'eau ultrapure.
4. Préparer solvant LC-MS B par addition d'acide formique (0,2% [v / v] de concentrat....

Résultats

Nous avons analysé les pools de métabolites intracellulaires dans S. aureus pendant la croissance in vitro dans un milieu riche et complexe,. Comme preuve de principe, nous avons des profils de métabolites comparés entre les méthicilline S. aureus sensible à l' ostéomyélite isoler UAMS-1 (type sauvage [WT]) et une souche isogénique manque le régulateur transcriptionnel global CodY (Δ codY) ^26. L'état d' équilibre, le.......

Discussion

Tous les métabolites de petites molécules sont reliés entre eux par leurs origines communes dans les voies métaboliques centrales. Au cours de la croissance exponentielle, les cellules bactériennes sont à l'état d'équilibre biologique et métabolique, donnant un aperçu de l'état physiologique dans des conditions spécifiques. CodY surveille la suffisance des éléments nutritifs en répondant à ILV et GTP. Comme ILV et GTP baisse des piscines, l' activité est susceptible CodY réduit progressivement, en ajusta.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Material/Equipmenta
DeLong Culture Flask (250 mL)	Belco	2510-00250
Gourde de poing, 500 mL	Pyrex	5340
3-hole Rubber Stopper, #7	Fisher	14-131E
Porte-filtre/fritte en acier inoxydable	VWR	89428-936
Boîte de Pétri, 35 mm	Corning	430588	Non traité pour culture tissulaire
Membrane mixte d’ester de cellulose, 0,22 &mu ;	Millipore	GSWP02500
Tubes résistants aux chocs, 2 mL	USA Scientific	1420-9600
Billes de silice, 0,1 mm	Biospec Products Inc	11079101Z
Homogénéisateur Precellys 24	Bertin Instruments	EQ03119-200-RD000.0
Kit de dosage des protéines Micro BCA	Pierce (Thermo Scientific)	23235
Colonne d’hydrure de diamant de type C Agilent		70000-15P-2
LC-MS à temps de vol (TOF) de masse précise, série 6200	Agilent	G6230B
Quat Pompe, série 1290	Agilent	G4204A  ;
Pompe à poubelle, série 1290	Agilent	G4220A  ;
Entraînement de soupape, série 1290	Agilent	G1107A  ;
Pompe isocratique, série 1290	Agilent	G1310B  ;
TCC, série 1290	Agilent	G1316C  ;
Échantillonneur, série 1290	Agilent	G4226A  ;
Thermostat, série 1290	Agilent	G1330B  ;
chimique
tryptique	Becton Dickinson	211825
Difco Agar, granulé	Becton Dickinson	214530	Le milieu solide contient 1,5 % [p/v]
gélose Solution saline tamponnée au phosphate (pH 7,4) 10x	Ambion	AM9624	Diluer frais à 1x avec de l’eau ultra-pure
Acétonitrile	Fisher Scientific	A955-500	Optima LC-MS
Méthanol	Fisher Scientific	A456-500	Optima LC-MS ;
toxique Acide formique	Sigma Aldrich	94318	Pour la spectrométrie de masse, 98 %
Software
MassHunter	Agilent	G3337AA
Bacterial Strain	Espèce	Souche	Génotype
SRB 337	Staphylococcus aureus	USA200 MSSA UAMS-1	type sauvage
SRB 372	Staphylococcus aureus	USA200 MSSA UAMS-1	&Delta ; codY ::erm
aLes produits chimiques et matériaux énumérés sont spécifiques à la méthode décrite et n’incluent pas les produits chimiques ou fournitures de laboratoire standard.

Bouillon de soja de