Article de méthode

Un dosage de point à 5 mC Quantification du niveau de méthylation d'ADN de la Dedifférenciation des chondrocytes In Vitro

DOI :

10.3791/55565

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17 mai 2017

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1Guangzhou Medical University, 2Shenzhen Key Laboratory of Tissue Engineering, Shenzhen Laboratory of Digital Orthopeadic Engineering, Department of Orthopedics, Shenzhen Second People's Hospital (The First Hospital Affiliated to Shenzhen University), 3Department of Chemistry, The Chinese University of Hong Kong, 4School of Biomedical Engineering, Shanghai Jiao Tong University, 5Renji Hospital Clinical Stem Cell Research Center, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, 6Shantou University Medical College

Dans cet article

Résumé

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Nous présentons une méthode pour quantifier la méthylation de l'ADN en fonction de la 5-méthylcytosine (5-mC) dot blot. Nous avons déterminé les niveaux de 5 mC pendant la dédifférenciation des chondrocytes. Cette technique simple pourrait être utilisée pour déterminer rapidement le phénotype des chondrocytes dans le traitement ACI.

Résumé

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La dédifférenciation des chondrocytes hyalins dans les chondrocytes fibroblastiques accompagne souvent l'expansion monocouche de chondrocytes in vitro . Le niveau global de méthylation de l'ADN des chondrocytes est considéré comme un biomarqueur approprié pour la perte du phénotype des chondrocytes. Cependant, les résultats basés sur différentes méthodes expérimentales peuvent être incohérents. Par conséquent, il est important d'établir une méthode précise, simple et rapide pour quantifier les niveaux globaux de méthylation de l'ADN pendant la dédifférenciation des chondrocytes.

Les techniques actuelles d'analyse de la méthylation à l'échelle du génome reposent largement sur le séquençage génomique des bisulfites. En raison de la dégradation de l'ADN pendant la conversion du bisulfite, ces procédés nécessitent généralement un volume d'échantillon important. D'autres méthodes utilisées pour quantifier les niveaux globaux de méthylation de l'ADN comprennent la chromatographie liquide haute performance (HPLC). Cependant, la HPLC nécessite une digestion complète de l'ADN génomique. En outre, le coût prohibitif élevé de la HPLC dansLes instruments limitent l'application plus large de HPLC.

Dans cette étude, l'ADN génomique (ADNg) a été extrait de chondrocytes humains cultivés avec un nombre variable de passages. Le niveau de méthylation de l'ADNc a été détecté en utilisant un dosage de transfert de point spécifique à la méthylation. Dans cette approche dot blot, un mélange d'ADNg contenant l'ADN méthylé à détecter a été repéré directement sur une membrane N + en tant que point à l'intérieur d'un modèle de modèle circulaire préalablement étiré. Par rapport à d'autres approches d'imprégnation à base d'électrophorèse sur gel et d'autres procédures complexes de transfert, la méthode de transfert de points enregistre un temps important. En outre, les transferts de points peuvent détecter le niveau global de méthylation de l'ADN en utilisant un anticorps 5-mC disponible dans le commerce. Nous avons constaté que le niveau de méthylation de l'ADN différait entre les sous-cultures monocouches et pouvait donc jouer un rôle clé dans la dédifférenciation des chondrocytes. Le point blot 5 mC est une méthode fiable, simple et rapide pour détecter le niveau général de méthylation de l'ADN pour évaluerPhénotype chondrocyte.

Introduction

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L'implantation de chondrocytes autologue (ACI) est une procédure relativement nouvelle et à la fine pointe de la technique pour traiter les défauts du cartilage articulaire 1 , 2 . L'une des étapes cruciales de l'ACI est l'amplification des chondrocytes par culture monocouche in vitro . Pendant l'amplification, les chondrocytes hyalines perdent facilement leur phénotype et deviennent dédifférenciés, ce qui n'est pas souhaitable pour le traitement ACI 3 , 4 . Pour optimiser le résultat du traitement ACI, l'étendue de la dédifférenciation des chondrocytes devrait être déterminée avant la replantation. Il est impératif d'établir un moyen économique et rapide de déterminer le statut des chondrocytes. Récemment, l'association entre la méthylation de l'ADN et la dédifférenciation des chondrocytes a attiré beaucoup d'attention 4 , 5 , 6 . La méthylation de l'ADN est un processus par whDes groupes méthyle sont ajoutés à l'ADN, ce qui entraîne la conversion des résidus de cytosine en 5-méthylcytosine (5-mC).

Pour élucider la biologie de la méthylation de l'ADN dans la dédifférenciation des chondrocytes, la première étape consiste à évaluer le niveau de méthylation de l'ADN des chondrocytes qui, jusqu'à présent, se sont révélés difficiles. Le séquençage génomique du bisulfite est la technique la plus utilisée pour analyser la méthylation de l'ADN 7 , 8 . Dans ce dosage, la conversion de bisulfite provoque une dégradation de l'ADN, et donc une quantité substantielle d'échantillon doit être fournie pour l'essai. En outre, la chromatographie liquide haute performance (HPLC) a été utilisée pour quantifier les niveaux globaux de méthylation de l'ADN 9 , 10 . Cependant, l'analyse HPLC nécessite une digestion par l'ADN génomique. En outre, des instruments expérimentaux avancés et coûteux sont nécessaires. Par conséquent, en plus du coût élevé, ces procédures expérimentales sont des contre-inconvénientsUming. Les anticorps anti-5-mC sont maintenant disponibles dans le commerce, ce qui a créé la possibilité d'un transfert immunologique d'ADN génomique contenant 5 mC à partir de génomes complexes.

Dans ce rapport, nous avons extrait l'ADN génomique des chondrocytes cultivés dans une série de cultures monocouches. Nous avons utilisé un test de point blot pour évaluer le contenu de 5 mC dans les chondrocytes humains avec différents nombres de passages. Nous avons constaté que le contenu de 5 mC était augmenté dans les chondrocytes fortement dédifférenciés par rapport aux chondrocytes à dédifférenciation de bas grade. En outre, nous avons identifié une relation entre le statut de dédifférenciation et les niveaux de 5 mC. Enfin, nous avons signalé que les changements dans le contenu de 5 mC étaient associés au phénotype des chondrocytes. Par conséquent, l'essai de transfert de point de 5 mC est une méthode fiable, simple et rapide pour détecter le niveau de méthylation de l'ADN dans les chondrocytes.

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Protocole

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Cette étude a été approuvée par le Comité d'éthique humaine de Shenzhen Second People's Hospital.

1. Collection tissulaire du cartilage articulaire humain et culture des chondrocytes

  1. Préparation des matériaux
    1. Préparez le milieu de Eagle modifié (DMEM) de Dulbecco complété par 10% de sérum bovin fœtal et 1% de pénicilline-streptomycine. Préparez 1 mg / mL de collagénase II, 0.25% de trypsine-EDTA, de solution salée tamponnée au phosphate (PBS) et un filtre cellulaire (nylon de 40 μm).
  2. Collecte du tissu cartilagineux articulaire humain
    1. Isoler le cartilage articulaire des articulations du genou des patients donneurs après un traumatisme. Obtenir le consentement éclairé de tous les participants.
    2. Découper le cartilage en 1-2 mm 3 en utilisant un scalpel stérile et digérer les chondrocytes du cartilage haché avec 1 mg / mL de collagénase II dans le DMEM à 37 ° C pendant 12-16 h.
    3. Filtrer le celL suspension à travers un filtre cellulaire (40 μm) et laver deux fois avec du PBS.
    4. Compter les cellules avec un hémocytomètre et une graine à une densité de 20 000 à 30 000 cellules / cm 2 dans du DMEM supplémenté avec 10% de sérum bovin fœtal (FBS) et 1% de pénicilline-streptomycine.
    5. Culture dans un incubateur à 37 ° C.
  3. Expansion de chondrocytes monocouche
    1. Récolte des cellules sous-confluentes en utilisant 0,25% de trypsine-EDTA et re-plaque à une densité de 6 600 cellules / cm 2 . Changez le support deux fois par semaine.
    2. Chondrocytes culturels en monocouches pour un maximum de six passages et évaluation aux passages 1, 2, 3, 4 et 5.

2. Extraction d'ADN génomique (ADNc)

  1. Recueillir des cellules et resuspendre dans 500 μL de tampon de lyse (15 mM Tris pH 8,0, 10 mM EDTA pH 8,0, 0,5% SDS, 200 μg / mL RNase A) pour 10 millions de cellules. Remettre en suspension les cellules par pipettage et inversion rapide, puis incuber pendant 1 h à 37 ° C.
  2. UNEDd proteinase K à une concentration de 160 μg / mL de lysat cellulaire et inverser vigoureusement le mélange. Incuber 6 h à 55 ° C.
  3. Ajouter un volume de Tris pH 7.9 phénol saturé: chloroforme: alcool isoamylique (25: 24: 1) à l'échantillon. Vortex ou secouer l'échantillon à la main soigneusement pendant environ 20 s.
  4. Centrifuger l'échantillon à température ambiante pendant 5 min à 13 000 × g. Retirer la phase aqueuse supérieure et transférer la couche dans un tube frais.
  5. Extraire avec un volume égal de chloroforme pour éliminer le phénol et transférer la phase aqueuse supérieure à un tube frais.
  6. Précipiter l'ADN en ajoutant 0,1 volume d'échantillon d'acétate de sodium 3 M à pH 8,0 et 2 volumes d'éthanol à 100%.
  7. Conserver le tube à -20 ° C pendant la nuit pour précipiter l'ADNc.
  8. Centrifuger l'échantillon à 4 ° C pendant 10 min à 16 000 xg pour extraire l'ADNc.
  9. Laver l'échantillon trois fois avec de l'éthanol à 70% et centrifuger à 4 ° C pendant 2 min à 13 000 x g.
  10. Supprimer le surnageantT soigneusement et ensuite sécher à l'air. Remettre en suspension l'ADN dans 10 mM Tris pH 8,0, 0,1 mM EDTA.

3. Profilage en méthylation d'ADN

  1. Utilisez un kit de méthylation d'ADN pour effectuer la conversion de bisulfite en utilisant un total de 500 ng d'ADN génomique, selon le protocole du fabricant. Eluir dans 10 μl de tampon d'élution (50 ng / μL).
  2. Effectuer le profilage de méthylation d'ADN en utilisant un kit commercial selon le protocole du fabricant.

4. Analyse du point de transfert

  1. Denaturez l'ADN isolé (1 mg par échantillon) dans NaOH 0,1 M pendant 10 min à 95 ° C. Neutraliser l'ADN avec NH 4 OAc 1 M sur de la glace, puis diluer deux fois. Présenter 2 μl de l'ADN génomique dilué en série sur une membrane N + .
  2. Nettoyer la membrane à 80 ° C pendant 30 min.
  3. Bloquer les sites de liaison d'anticorps non spécifiques en trempant la membrane N + dans 5% de BSA dans TBS-T pendant 1 h. Utilisez une boîte de Petri de 10 cm comme réactionChambre à ion à température ambiante.
  4. Après avoir lavé 5 minutes trois fois dans TBST, incuber la membrane avec un anticorps monoclonal anti-5-méthylcytosine (5-mC) anti-5 (1: 1 000) dans du TBS-T à 4 ° C pendant une nuit.
  5. Laver la membrane pendant 5 min trois fois dans le TBS-T, puis incuber avec un anticorps secondaire, une immunoglobuline G (IgG) anti-souris mâchée conjuguée à HRP (1: 5000) dans du TBS-T pendant 1 h à température ambiante.
  6. Laver la membrane pendant 5 min trois fois dans TBS-T.
  7. Ajouter le substrat enzymatique à la membrane et incuber pendant 5 à 10 min. Visualisez le signal d'anticorps secondaire en utilisant un kit de chimioluminescence conformément aux instructions du fabricant.

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Résultats

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Les chondrocytes ont été cultivés dans une monocouche jusqu'au passage 6 (P6). Les chondrocytes ont montré des modifications phénotypiques progressives avec des passages successifs de la culture monocouche. La morphologie des chondrocytes P0 était ronde, alors que les cellules étaient fortement pincées et aplatis avec des passages successifs jusqu'à P6 ( figure 1 ). Ce changement de morphologie est typique du processus de dédifférenciation des chondrocytes. Pendant ce te...

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Discussion

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La dédifférenciation des chondrocytes in vitro compromet sérieusement le résultat de l'ACI dans le traitement de la réparation des défauts du cartilage 11 , 12 . Pour optimiser les résultats ACI, il est crucial d'éviter l'utilisation de chondrocytes dédifférenciés 13 . Des études ont suggéré que le niveau général de méthylation de l'ADN est associé à l'étendue de la dédifférenciation des chondrocytes

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs déclarent qu'ils n'ont pas d'intérêts financiers concurrents.

Remerciements

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Ce travail a été soutenu par les subventions suivantes: Fondation des sciences naturelles de la Chine (n ° 81572198; n ° 81260161; n ° 81000460); Fondation des sciences naturelles de la province du Guangdong, Chine (n ° 2015A030313772); Projet financé par la Fondation canadienne de la science postdoctorale (no 2013M530385); La Fondation de recherche médicale de la province de Guangdong, en Chine (no A2016314); Projets de science et de technologie de Shenzhen (n ° JCYJ20160301111338144; N ° JSGG20151030140325149; N ° JSGG20140519105550503; No.GJHZ20130412153906739; N ° JCYJ20140414170821160; No.JCYJ20140414170821200).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
forts
DMEMGibco Inc.11965&ndash ; 092Chaud en 37 ° ; C bain-marie avant utilisation
Saline tamponnée au phosphate (PBS)HyClone Inc.SH30256,01BD-PBS, sans Ca2+/Mg2+
FBSGibco Inc.10099-141
Trypsine à 0,25 %/EDTAGibco Inc.25200-056
Pénicilline-streptomycine à 1 %Gibco Inc.15140-122
ChloroformeMallinckrodt4440
Alcool isoamyliqueSigmaI-3643
PhénolGibco BRL15513-039
Protéinase KGibco BRL24568-2
Tampon TAE  ;Bio Whittaker16-011V
Eau distilléeGibco BRL15230-170
1 M Tris-HClBiosharp Inc.BL514A
Tween20Biotop Inc.
BSAProliant Inc.68700
Colgénase, Type IISigma-AldrichC6885
[en-tête]
Équipement
HémocytomètreISOLAB Inc.075.03.001
Falcon 100 mm BoîteCorning353003
Tubes à centrifugerTPP AG91050Stérilisée aux rayons gamma
Centrifugeuse à grande vitesseEppendorf5804R
ThermoMixerMIULABMTH-100
Incubateur à cellules de dioxyde de carboneThermo scientific3111
Système d’analyse de chimi-imagerieUVITEC CambridgeALLIANCE
C58H114O26

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Brittberg, M., et al. Treatment of deep cartilage defects in the knee with autologous chondrocyte transplantation. N Engl J Med. 331, 889-895 (1994).
  2. Pareek, A., et al. Long-Term Outcomes After Autologous Chondrocyte Implantation: A Systematic Review at Mean Follow-Up of 11.4 Years. Cartilage. 7 (4), 298-308 (2016).
  3. Duan, L., et al. Cytokine networking of chondrocyte dedifferentiation in vitro and its implications for cell-based cartilage therapy. Am J Transl Res. 7 (2), 194-208 (2015).
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  5. Duan, L., Liang, Y., Ma, B., Zhu, W., Wang, D. Epigenetic regulation in chondrocyte phenotype maintenance for cell-based cartilage repair. Am J Transl Res. 7 (11), 2127-2140 (2015).
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Mots-clés

Dot blot la 5 m thylcytosineessai de m thylation de l ADNextraction d ADN g nomiqueproc dure de dot blotd tection par anticorps anti 5 mCanalyse du ph notype des chondrocytesimplantation de chondrocytes autologuesm thode de d naturation de l ADNd tection par chimiluminescence

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