Article de méthode

Expansion et adipogénèse Induction de progéniteurs d'adipocytes à partir de tissus adipeux périvasculaires isolés par tri magnétique de cellules activées

DOI :

10.3791/55818

⸱

30 juin 2017

 ,  ,  , 
1Department of Large Animal Clinical Sciences, Michigan State University, 2Department of Pharmacology and Toxicology, Michigan State University

Dans cet article

Résumé

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Nous rapportons ici une méthode pour l'isolement des populations de cellules progénitrices d'adipocytes (APC) à partir du tissu adipeux périvasculaire (PVAT) en utilisant le triage cellulaire activé par magnétisation (MCS). Cette méthode permet une augmentation de l'isolement de l'APC par gramme de tissu adipeux par rapport au tri de cellules activées par fluorescence (FACS).

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L'expansion du tissu adipeux périvasculaire (PVAT), un régulateur majeur de la fonction vasculaire par la signalisation paracrine, est directement liée au développement de l'hypertension pendant l'obésité. L'étendue de l'hypertrophie et de l'hyperplasie dépend de la localisation du dépôt, du sexe et du type de phénotypes cellulaires progéniteurs adipocytaires (APC) présents. Les techniques utilisées pour l'APC et l'isolement des préadipocytes au cours des 10 dernières années ont considérablement amélioré la précision à laquelle les cellules individuelles peuvent être identifiées en fonction de marqueurs de surface cellulaire spécifiques. Cependant, l'isolement de l'APC et des adipocytes peut être un défi en raison de la fragilité de la cellule, surtout si la cellule intacte doit être retenue pour les applications de culture cellulaire.

Le tri cellulaire activé par magnétisation ( MCS) fournit une méthode pour isoler un plus grand nombre d'APC viables par unité de poids de tissu adipeux. L'APC récolté par MCS peut être utilisé pour des protocoles in vitro pour développer les préLes dipocytes et les différencier en adipocytes par l'utilisation de cocktails à facteur de croissance permettant d'analyser le potentiel proliférateur et adipogène retenu par les cellules. Cette expérience a porté sur les dépôts PVAT aortiques et mésentériques, qui jouent un rôle clé dans le développement des maladies cardiovasculaires lors de l'expansion. Ces protocoles décrivent des méthodes pour isoler, développer et différencier une population définie d'APC. Ce protocole MCS permet d'utiliser l'isolation dans toute expérience où le tri cellulaire est nécessaire avec un équipement ou une formation minimale. Ces techniques peuvent aider d'autres expériences pour déterminer la fonctionnalité de populations cellulaires spécifiques en fonction de la présence de marqueurs de surface cellulaire.

Introduction

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Le tissu adipeux périvasculaire (PVAT), en raison de sa proximité avec les vaisseaux sanguins, est un composant de signalisation paracrine majeur dans la fonction vasculaire 1 . L'expansion de ce tissu adipeux dépend du phénotype des cellules progénitrices d'adipocytes (APC) présentées 2 , 3 . L'isolement des cellules à partir de tissus adipeux est difficile car les adipocytes primaires sont fragiles, dynamiques et de taille. Certaines techniques d'isolement peuvent également modifier le phénotype et la morphologie cellulaire en augmentant la synthèse des protéines inflammatoires et en réduisant l'expression génétique adipogène 4 , en soulignant l'importance d'un protocole qui maintient l'intégrité des cellules.

La culture des cellules primaires et des sous-populations spécifiques de préadipocytes donne une approche réductionniste de la croissance in vivo et maintient un maquillage génétique cellulaire équivalent 5 , bien que le travailMoi avec ces cellules est limité en raison de la détérioration avec le vieillissement, ou la sénescence 6 . Les préadipocytes provenant de divers dépôts adipeux, y compris les dépôts sous-cutanés et omental, démontrent également des différences dans la prolifération 7 , ce qui met l'accent sur l'importance de la collecte de cellules à partir de sites anatomiques spécifiques. Les cellules précurseurs des dépôts adipeux blancs non PVAT ont été caractérisées dans les études précédentes 7 , 8 , 9 , mais on sait moins sur les phénotypes APAT de PVAT.

Les techniques décrites ici permettent l'analyse de populations APC spécifiques et définies ayant un impact minimal sur leur morphologie, leur viabilité et leur potentiel de prolifération et de différenciation. Le tri de cellules activé par magnétisation (MCS) est susceptible d'être utilisé dans les applications en aval, telles que la culture, car les grains se dissolvent sans altérer la cellule. MCS est également économique, et une fois que l'anticorps est conLes centrations ont été normalisées, le besoin de tests de cytométrie de flux est minime. Des études in vitro avec des précurseurs de PVAT peuvent également donner un aperçu du potentiel que ces cellules primaires peuvent avoir.

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Protocole

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Toutes les procédures décrites dans cet article suivent les lignes directrices établies par le Comité institutionnel pour les soins et l'utilisation des animaux (IACUC) de l'Université d'État du Michigan. Tous les tampons et les médias doivent être protégés de la lumière.

1. Préparation des tampons, des supports et des instruments

  1. Préparer la solution tampon Bicarbonate de Krebs Ringer (KRBB): chlorure de sodium 135 mM, chlorure de potassium 5 mM, sulfate de magnésium 1 mM, phosphate de potassium 0,4 mM, 5,5 mM de glucose, 1% d'antibiotique / antimycotique (10 000 unités / mL de pénicilline, 10 000 μg / Ml de streptomycine, 25 μg / ml d'amphotéricine B) et 10 mM d'HEPES (pH = 7,4). Cette solution est stable pendant 3 semaines lorsqu'elle est maintenue stérile et à 4 ° C.
  2. Préparer la solution de collagénase de type 1: 1 mg / mL dans du KRBB avec de l'albumine de sérum bovin à 4% (BSA). Cette solution doit être maintenue à 37 ° C et stable pendant 4 h.
  3. Préparer une solution tampon de lyse d'érythrocytes: chlorure d'ammonium 154 mM, bicarbonate de potassium 10 mM, Et 0,1 mM d'EDTA. Conserver à 4 ° C pendant un maximum d'un mois.
  4. Préparer le tampon de blocage MCS: base de support DMEM / F12, 10% de sérum bovin fœtal (FBS), 5% de sérum d'âne normal, 40 μL / mL de F (ab) Fragment Donkey Anti-Rat IgG. Conserver à 4 ° C pendant un maximum d'un mois.
  5. Préparer une solution tampon MCS: solution salée tamponnée au phosphate (PBS, pH = 7,5), 0,5% de BSA et 2 mM d'EDTA. Conserver à 4 ° C pendant un maximum d'un mois. Solution de gaspillage en chauffant à 37 ° C dans un récipient en verre puis en appliquant un vide pendant 15 s. Laisser le tampon non utilisé tamponné.
  6. Préparation de la fraction vasculaire Stromal (SVF) Médias basaux: milieu d'aigles modifiés de Dulbecco (DMEM): F12, 15% de sérum de veau fœtal (FCS), 1% d'antibiotique / antimycotique (10 000 unités / mL de pénicilline, 10 000 μg / ml de streptomycine, 25 μg / ML d'amphotéricine B), 44,05 mM de bicarbonate de sodium, 100 uM d'acide ascorbique, 33 uM de biotine, 17 uM de pantothénate, 2 mM de L-glutamine et 20 mM de HEPES. Restez stérile et à 4 ° C jusqu'à 2 semaines.
  7. Préparez APC &# 160; Médias: Méthodes basales avec des facteurs de croissance supplémentaires, y compris facteur de croissance épidermique de 10 ng / mL), facteur inhibiteur de leucémie (10 ng / mL), facteur de croissance dérivé des plaquettes BB (10 ng / mL) et facteur de croissance de fibroblastes basique ( 5 ng / mL). Restez stérile et à 4 ° C jusqu'à 2 semaines.
  8. Préparer le milieu d'induction APC: milieu APC avec 10% de FBS, 2,5 μg / mL d'insuline, 0,5 mM de 2-isobutyl-1-méthylaxanthine (IBMX), 1 μM de dexaméthasone et 200 pM de T3 (hormone thyroïdienne de triiodothyronine). Restez stérile et à 4 ° C jusqu'à 2 semaines.

2. Isolation des progéniteurs d'adipocytes

  1. Anesthésier le rat selon les directives institutionnelles. Placez le rat en accalmie dorsale. Confirmez la profondeur de l'anesthésie par un pincement et la perte de réponse réflexe à ce stimulus douloureux.
    NOTE: Ce protocole utilise des rats Sprague Dawley de 10 semaines et 70 mg / kg de pentobarbital administré par injection intraperitoneale.
  2. Faire une incision verticale de la ligne médiane wAvec des ciseaux le long du sternum dans la zone thoracique et dans la zone périnéale. Accédez à la cavité abdominale et exposez l'artère mésentérique supérieure, les petits vaisseaux de résistance mésentérique (mPVAT) et l'aorte thoracique (aPVAT).
    1. Séchez toutes les connexions au mésentère et à l'aorte et enlevez les vaisseaux des animaux. Isoler le PVAT en utilisant un microscope à dissection et une boîte de Petri remplie de KRBB pour voir les vaisseaux et isoler le PVAT.
    2. Dans cette expérience, collectez les adipeux gonadiques (GON) pour représenter un dépôt adipeux non PVAT. Placez des tampons gras isolés sur de la glace dans du KRBB avec HEPES 10 mM (pH = 7,4).
    3. Dans un capot de prévention de la biosécurité, transférez environ 50 mg de tissu dans un tube de 1,7 ml avec 1 ml de solution de collagénase de type I et piquez avec des ciseaux en tissu (morceaux de 1 à 3 mm).
  3. Déterminer les échantillons en incubant à 37 ° C dans un incubateur de rôtissoire (ou incubateur avec un agitateur orbital) pendant 1 h. Dans un capot de sécurité biologique, filtre séquentiellement le matériau digéré à travers 100 et 40 Μm dans un tube de 50 ml. Centrifuger le filtrat résultant à 4 ° C pendant 10 min à 300 x g.
    REMARQUE: Toutes les étapes du protocole à partir d'ici doivent être effectuées dans un capot de sécurité biologique pour maintenir les cellules stériles.
  4. Verser le surnageant et resuspendre les pastilles contenant les cellules de SVF dans 1 ml de solution de tampon de lyse Erythrocyte 1X et transférer à un tube de microcentrifugeuse de 1,7 mL. Incuber les cellules pendant 5 min à la RT protégée contre la lumière et centrifuger à 4 ° C pendant 5 min à 300 x g.
  5. Verser le surnageant et ré-endiguer le culot cellulaire restant dans le support basal SVF. Collectez un sous-échantillon de 20 μL pour compter les cellules vivantes avec Trypan Blue Solution.
    NOTE: Le nombre de cellules SVF pouvant être isolées varie selon le site. Les nombres moyens de SVF récoltés par mg de tissu sont: aPVAT = 5,0 ± 2,0x10 3 , mPVAT = 1,04 ± 0,62x10 4 , GON = 2,4 ± 1,2x10 5 .

3. Tri des cellules magnétiquement activé

_content "> REMARQUE: Isoler APC de SVF en fonction des marqueurs de surface de cellules CD34 et PDGFRα en effectuant toutes les étapes à 4 ° C.

  1. Cellules centrifugées pendant 5 min à 300 x g. Verser le surnageant et remettre en suspension le culot cellulaire dans un tampon de blocage MCS à 1 x 10 6 cellules / ml et incuber pendant 20 minutes.
    REMARQUE: Les suspensions cellulaires de 1 x 10 6 - 2 x 10 8 cellules / ml peuvent être séparées efficacement.
  2. Incuber des cellules avec 5 μL de souris anti-CD34 conjuguées à FITC (1 μg / 1 x 10 6 cellules) pendant 30 minutes à 4 ° C. Cellules centrifuges pendant 5 min à 300 xg et 4 ° C.
    1. Incuber avec 4 μL de microbilles anti-FITC et 96 μL de tampon MCS (volume total de 100 μL) pendant 5 min à 4 ° C dans l'obscurité pour séparer les cellules CD34 + et CD34.
  3. Fixez le séparateur magnétique sur le support et placez la colonne MultiSort (MS), avec les ailes de la colonne vers l'avant, dans le séparateur. Placer 5 mLTube de collecte sous la colonne MS dans le support de tube supérieur.
  4. Préparez la colonne MS en rinçant avec MCS Buffer Solution. Appliquer 500 μL de MCS Buffer sur le dessus de la colonne et laisser passer le tampon. Jeter les effluents et changer le tube de collecte.
  5. Chargez la suspension cellulaire marquée par un anticorps sur la colonne de MS préparée. Collecter le flux contenant des cellules non étiquetées.
  6. Wash MS Column avec 500 μL de tampon MCS dégazé 3x. Recueillir des cellules non marquées qui traversent et se combiner avec le flux à travers l'étape précédente.
  7. Retirez MS Column du séparateur magnétique et placez-le sur un nouveau tube de collecte. Pipeter 1 mL de tampon MCS sur la colonne MS. Éloignez immédiatement la fraction avec les cellules étiquetées magnétiquement par une pression ferme, mais lentement, en appliquant le piston fourni avec la colonne afin de ne pas laisser excès de gaz dans la colonne.
    REMARQUE: Les nombres de cellules isolés varieront selon le site. Nombre moyen d'APC CD34 + isolés de la population SVF parMg de tissu sont: aPVAT = 2,6 ± 0,43x10 2 , mPVAT = 9,6 ± 1,4x10 2 , GON = 1,3 ± 0,22x10 3 .
  8. Cellules de spin pendant 5 minutes à 300 × g et 4 ° C. Incuber la fraction CD34 + recueillie dans 10 μL d'une solution 1: 200/1 x 10 6 cellules Rabbit anti-PDGFRa pendant 30 min à 4 ° C.
    1. Centrifuger les cellules à nouveau pendant 5 min à 300 xg et 4 ° C. Incuber les cellules marquées avec 4 μL de microbilles IgG anti-lapin et 96 μL de tampon MCS en répétant les étapes 3.3 à 3.7 pour isoler.
      REMARQUE: Les nombres de cellules isolés varieront selon le site. Les nombres moyens de PDGFRα + APC isolés de la population CD34 + par mg de tissu sont: aPVAT = 2,4 ± 0,64, mPVAT = 8,4 ± 2,4, GON = 10,4 ± 1,9, soit 0,5 à 10% de la population précédemment isolée.

4. Culture cellulaire et adipogénèse Induction

  1. Culture le SVFEt APC dans des plaques de culture tissulaire de 6 puits en milieu basal avec remplacement tous les 2 jours. Après 3 passages en série, plaque dans des plaques de culture de tissus noires de 96 puits à 1x10 2 cellules / puits pour les essais de prolifération, qui sont évalués à 8, 24, 48 et 96 h, et à 50 000 cellules / puits dans des plaques de 24 puits ou 10 000 cellules / puits dans des plaques de culture tissulaire de 48 puits pour les essais d'adipogénèse, qui sont qualitatifs et quantitatifs.
  2. Complétez les médias basiques APC pendant 48 h après la confluence et avant l'induction avec la protéine morphogène osseuse 4 (3,3 nmol / L) comme indiqué 10 pour la différenciation. Induire les cellules après 48 h de confluence à 100% (jour 0) en utilisant le support d'induction APC pour incuber les cellules.
  3. Après 48 h, changez de support pour maintenir les cellules dans les médias d'induction APC sans IBMX et dexaméthasone, pendant 14 jours avec les changements de média toutes les 48 h.
  4. Isolation MCS validée par FACS.
    1. Prendre un sous échantillon de 50 μL (50 000 cellules) séparé magnétiquementEt lave avec une solution FACS.
    2. Centrifuger les cellules et resuspendre dans 100 μl d'une solution 1: 1000 d'IgG Dylight 405 anti-lapin d'âne pour étiqueter les cellules PDGFRα + . Incuber pendant 30 minutes protégé de la lumière et à 4 ° C.
    3. Lavez les cellules et résidez dans 200 μL de solution de formaldéhyde à 2% jusqu'à l'analyse des fuites à 488 nm (FITC) et 405 nm (Dylight 405) sur un cytomètre de flux.
      NOTE: L'accumulation de lipides par les cellules cultivées est évaluée quantitativement en utilisant un dosage lipophile de la fluorescence de l'adipogénèse dans un lecteur de microplaque mesurant la fluorescence et en utilisant des préadipocytes comme étalons pour l'accumulation de lipides. L'accumulation de lipide est également mesurée qualitativement par la coloration des colorants lipidiques et l'imagerie effectuée sur un microscope inversé équipé d'une caméra, ce qui fait que le pourcentage de cellules totales contenant ou non des lipides est observable. Tout lecteur de plaques capable de mesurer la fluorescence avec excitation à 485 nm et l'émission à 572Nm est adapté pour l'analyse ainsi que tout microscope avec une caméra capable de capturer des images numériques.

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Résultats

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La capacité proliférative des préadipocytes et le potentiel adipogène des précurseurs d'adipocytes sont des caractéristiques qui sont maintenues in vitro 11 . La prolifération in vitro de SVF isolé et d'APC à partir d'aPVAT, de mPVAT et de GON de rats mâles a été évaluée à 8, 24, 48 et 96 h après le placage en utilisant un dosage d'ADN quantitatif. Aucune différence de site dans le taux d'expansion SVF n'a été observée à aucun moment, à ...

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Discussion

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L'objectif central de l'expérience actuelle est l'isolement, l'expansion et l'induction adipogène d'APC des dépôts PVAT. Nous présentons ici un protocole pour l'isolement de l'APC basé sur l'identification des cellules exprimant les marqueurs de surface CD34 et PDGFRα. Ces protéines de surface ont été précédemment identifiées sur APC avec des taux de prolifération élevés et le potentiel de se différencier en adipocytes blancs ou marron dans différents dépôts adipeux ...

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs n'ont rien à dévoiler.

Remerciements

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Les Laboratoires Contreras et Watts et le Dr William Raphael. Ces expériences ont été supportées par NHLBI F31 HL128035-01 (standardisation du protocole de digestion des tissus), NHLBI 5R01HL117847-02 et 2P01HL070687-11A1 (animaux) et NHLBI 5R01HL117847-02 (isolement et culture cellulaire).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
strong
Plats de dissectionfaits à la main avec
Pyrex7740 Verre
Élastomère de siliconeDow CorningSylgard 170Kit
de suture en soie tresséeHarvard Apparatus51-7615SP104
Stéréomicroscope MZ6Leica10447254
Stereomaster Microscope Source de lumière à fibre optiqueFisher Scientific12562-36
Ciseaux VannasGeorge Tiemann & Co160-150
Pince à échardesGeorge Tiemann & Co160-55
Ciseaux à tissusGeorge Tiemann & Co105-400
KRBB Solution
sodiumSigma-Aldrich7647-14-5
Chlorure de potassiumSigma-Aldrich7447-40-7
Sulfate de magnésiumSigma-Aldrich7487-88-9
Phosphate de potassium dibasiqueSigma-Aldrich7758-114
GlucoseSigma-Aldrich50-99-7
Antibiotique/AntimicotiqueCorning30-004-CI
HEPESCorning25-060-CI
Strong>Digestion tissulaire
Collagénase de type 1Worthington BiochemicalLS004196
Albumine sérique bovine (BSA)Fisher Scientific9048-46-8
Tampon de lyse des globules rougesBioLegend4203011X Solution de travail
Bain-marieThermo-Fisher Scientific2876Bain d’agitation réciproque
Armoire de biosécuritéThermo-Fisher Scientific1385
Incubateur de rôtisserieDaiggerEF4894C
100 & micro; m Crépine à cellulesThermo-Fisher Scientific22-363-549Jaune
40 & micro ; m Filtre cellulaireThermo-Fisher Scientific22-363-547
HémocytomètreCole-ParmerUX-79001-00
Bleu trypanSigma-Aldrich93595
Isolation cellulaire
strongOctoMACS KitMiltenyi Biotech130-042-108
(DMEM) :F12 Corning moyen90-090
Sérum de bovin fœtal à base moyenne (FBS)Corning35016CVUSA Origins Sérum d’âne
normalAbCamAB7475
Anti-CD34Santa CruzSC-7324FITC-conjugué
Anti-PDGFR & alpha ;Thermo-Fisher ScientificPA5-17623
Âne Anti-Lapin IgGJackson ImmunoResearch712-007-003
Solution saline tamponnée au phosphate (PBS) 10XCorning46-013-CM1X Solution de travail
EDTAFisher Scientific15575020
Culture cellulaire
CO Incubateur 2 cellulesThermo-Fisher Scientific51030285Heracell 160i  ;
Plaques 6 puitsCorning3516Plaques 48
puitsTC Corning3548Plaques 96 puits traitées
, paroi noireCorning353376
Bicarbonate de sodiumSigma-Aldrich144-55-8
veau fœtal traité TC (FCS)Corning35011CVUSA Origins
Acide ascorbiqueSigma-Aldrich50-81-7
BiotineSigma-Aldrich58-85-5
PantothénateSigma-Aldrich137-08-6
L-GlutamineCorning61-030
Protéine morphogénique osseuse 4 (BMP4)Prospec BioCYT-081
Facteur de croissance épidermique (EGF)PeproTech400-25
Leucémie Facteur inhibiteurPeproTech250-02
Facteur de croissance dérivé des plaquettes BBProspec BioCYT-740
Facteur de croissance des fibroblastes de base (bFGF)PeproTech450-33
InsulineCorning25-800-CRITS Solution
IBMXSigma-Aldrich28822-58-4
DexaméthasoneSigma-Aldrich50-02-2
T3 (triiodothyronine)Sigma-Aldrich6893-023
Cell Analysis
CyQUANT Essai de proliférationThermo-Fisher ScientificC7026
AdipoRed Réactif de fluorescenceLonzaPT-7009
Oil Red O Lipid Dye ReactiveSigma-AldrichO1391En Solution
M1000 Lecteur de microplaquesTecan
Eclipse Microscope inverséNikon
Digital Sight DS-Qil Appareil photoNikon
une boîte de Petri de culture en silicone Chlorure de < bleu / traitées TC traité TC Sérum de

Références

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Mots-clés

Cellules prog nitrices d adipocytesfraction vasculaire stromaleprotocoles d expansion cellulaireisolement du marqueur CD34cellules positives au PDGFR alphatechniques de culture tissulaireprotocoles d essai de prolif ration

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