Article de méthode

Synthèse de chimio-enzymatique des N- glycans pour le développement de la baie et anticorps anti-VIH de profilage

DOI :

10.3791/55855

⸱

5 février 2018

 ,  ,  , 
1Genomics Research Center, Academia Sinica

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Une approche modulaire de la synthèse des N- glycans à fixer sur un verre recouvert d’oxyde d’aluminium glisser (slide NOC) comme un microréseau glycane a été mis au point et son utilisation pour la détermination des caractéristiques d’un VIH largement anticorps neutralisant a été démontrée.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous présentons un moyen très efficace pour la préparation rapide d’un large éventail de N-liée d’oligosaccharides (évalués à plus de 20 000 structures) que l'on retrouve communément sur les glycoprotéines humaines. Pour atteindre la diversité structurale désirée, la stratégie a commencé avec la synthèse enzymatique chimio des trois types de modules de fluorure d’oligosaccharyl, suivies de leurs glycosylations α sélectifs par étapes à la 3-O et 6-O les positions de la résidus mannose du trisaccharide noyau commun ayant une liaison β-mannoside crucial. Nous attachée plus loin le N- glycans à la surface d’une lame de verre enduit d’oxyde d’aluminium (NOC) pour créer un tableau mixte covalent pour l’analyse de l’interaction ligand-hétéro avec un anticorps anti-VIH. En particulier, le comportement de liaison d’un nouvellement isolé du VIH-1 largement anticorps neutralisant (bNAb), PG9, au mélange de rapprochées Man5GlcNAc2 (Man5) et le 2, 6-di-sialylés bi-antennaire complexe type N- glycanes (SCT ) sur un tableau de NOC, ouvre une nouvelle voie pour guider la conception immunogène efficace pour le développement de vaccin contre le VIH. En outre, notre gamme de NOC incarne un outil puissant pour étudier les autres anticorps anti-VIH pour le comportement de liaison du ligand-hétéro.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

N- glycans sur les glycoprotéines sont liées de façon covalente à l’asparagine (Asn) résidus du consensus Asn-Xxx-Ser/Thr sequon, qui affectent plusieurs processus biologiques telles que la reconnaissance de conformation, antigénicité, solubilité et la lectine protéine 1 , 2. la synthèse chimique des N-oligosaccharides liés représente un défi synthétique important en raison de leur énorme hétérogénéité structurale de micro et de l’architecture très ramifiée. Une sélection rigoureuse de la protection des groupes pour optimiser la réactivité des blocs de construction, réalisation de sélectivité à l’anomère centres et l’usage approprié du promoteur / activateur est des éléments clés dans la synthèse d’oligosaccharides complexes. Pour résoudre ce problème de complexité, une grande quantité de travail pour faire progresser les N- glycanes synthèse a été signalée récemment3,4. En dépit de ces approches robustes, trouver une méthode efficace pour la préparation d’une vaste gamme de N- glycanes (~ 20 000) reste un grand défi.

Le taux de mutation rapide du VIH-1 pour atteindre la vaste diversité génétique et sa capacité à échapper à la neutralisation des anticorps, est parmi les plus grands défis pour développer un vaccin sûr et prophylactique contre le VIH-15,6 , 7. une tactique efficace que le VIH utilise pour éviter la réaction immunitaire l’hôte est la glycosylation post-traductionnelle d’enveloppe glycoprotéine gp120 avec une diverse N-liée glycanes dérivée de l’hôte glycosylation machines8, 9. Un rapport récent concernant l’analyse précise de glycosylation monomère recombinante de gp120 du VIH-1 de cellules 293 t rein embryonnaire humain (HEK) suggère la présence de microheterogeneity structurel avec une caractéristique spécifique des cellules modèle10 , 11 , 12. par conséquent, la compréhension des spécificités de glycane de VIH-1 bNAbs nécessite bien caractérisé gp120 liés N- glycane structures en quantité suffisante pour l’analyse.

La découverte de la technologie des microréseaux glycane fourni haut débit d’exploration des spécificités d’une gamme variée de protéines de liaison aux glucides, adhésines de virus/bactéries, toxines, anticorps et lectines13,14 . L’arrangement systématique de glycanes dans un format de puce qui pourrait déterminer les interactions de protéine-glycane problématique de faible affinité par présentation multivalents15,16,17,18. Cet arrangement de glycane puce semble idéalement imiter efficacement les interfaces de cellules. Pour enrichir la technologie et de surmonter le problème inégal associé à des formats de tableau conventionnel, notre groupe a récemment mis au point un tableau de glycane sur une lame de verre revêtu d’oxyde d’aluminium (NOC) à l’aide de glycanes de culot acide phosphonique pour accroître l’intensité du signal, homogénéité et sensibilité19,20.

Afin d’améliorer la compréhension actuelle de glycane épitopes du VIH-1 nouvellement isolé largement neutraliser les anticorps (bNAbs), nous avons développé une stratégie modulaire très efficace pour la préparation d’un large éventail de N-liée glycanes21 ,22 à imprimer sur un NOC glisser (voir Figure 1). Spécificité de profilage études du VIH-1 bNAbs sur un tableau de NOC offert la détection inhabituelle du comportement de liaison de hétéro-glycane de très puissant bNAb PG9 qui a été isolé chez le VIH infectées personnes23,24,25.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Protocole

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. préparation des D1/D2 de bras Modules22

  1. Préparation des 2 intermédiaire
    1. Peser à partir de matière 1 (illustrée à la Figure 2, p-methoxyphenyl-O-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl-(1→2)-α-D-mannopyranoside (100 mg, 0,204 mmol)) dans un tube de 15 mL et dissoudre dans Tris contenant du tampon (25 mM, pH 7,5) chlorure de manganèse (MnCl2, 10 mM) pour obtenir une concentration finale de glycane de 5 mM.
    2. Ajouter 2 équivalents de l’uridine diphosphate de galactose (UDP-Gal).
    3. Ajouter 150 unités de l’enzyme β-1, 4 galactosyl transférases de lait de vache et incuber le mélange à 37 oC pendant 15 h.
    4. Après 15 h, effectuer la chromatographie sur couche mince (CCM) pour indiquer la consommation totale de matière première en repérant le mélange réactionnel dans une assiette de TLC, développe avec n-butanol/acide/eau (H2O) 1:1:1 ratio et la coloration par un solution de 0,25 M cérium d’ammonium molybdate suivi du chauffage. Puis étancher la réaction par chauffage à 90 oC pendant 5 min.
    5. Centrifuger le mélange réactionnel à une vitesse de 2 737 x g pendant 3 min et charger le surnageant au dessus de la colonne de gel de polyacrylamide (voir Table des matières). Éluer la colonne à l’aide d’eau distillée désionisée et recueillir le produit avec des fractions de 1 à 2 mL.
    6. Surveiller les fractions collectées par TLC26, développer avec n-butanol : H2o : acide acétique 1:1:1 ratio et taches provoquées par une solution de molybdate d’ammonium de cérium suivi du chauffage. Lyophiliser27 produit contenant des fractions pour obtenir 2 intermédiaires (115 mg, 86 %) sous forme de poudre blanche. Caractériser le produit par NMR28 et29 de la spectroscopie de masse (voir le fichier de données supplémentaires).
  2. Préparation de l’intermédiaire 3
    1. Peser à partir de matériel 2 (illustré à la Figure 2, p-methoxyphenyl-O-β-D-galactopyranosyl-(1→4)-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl-(1→2)-α-D-mannopyranoside (80 mg, 0,122 mmol)) dans un tube de 15 mL et dissoudre dans Tris tampon (25 mM, pH 7,5) contenant MnCl2 (10 mM) pour préparer une concentration finale de glycane de 5 mM.
    2. Ajouter 2 équivalents de sel de guanosine 5'-diphospho-β-L-fucose disodique (PIB-Fuc).
    3. Ajouter 150 unités d’enzyme α-1, 3 fucosyle transférases de Helicobacter pylori (Hp1-3FTΔ26695) et incuber le mélange à 37 oC pendant 15 h.
    4. Suivez l’étape 1.1.4.
    5. Suivez l’étape 1.1.5.
    6. Suivez l’étape 1.1.6 pour obtenir intermédiaire 3 (82 mg, 84 %) sous forme de poudre blanche. Caractériser le produit par RMN et la spectrométrie de masse (voir le dossier de données supplémentaires).
  3. Préparation des Modules 4 et 5
    1. Peser le composé 2,-methoxyphenyl-O-β-D-galactopyranosyl-(1→4)-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl-(1→2)-α-D-mannopyranoside p(0,230 g, 0,360 mmol) ou composé 3, p- methoxyphenyl-O-β-D-galactopyranosyl-(1→4)-[α-L-fucopyranosyl-(1→3)-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl]-(1→2)-α-D-mannopyranoside (0,100 g, 0,125 mmol) dans un ballon à fond rond 25 mL single-cou et faire sécher sous vide pendant 30 min.
    2. Enlever le ballon de vide, remplissez-la d’azote gazeux, ajouter un magnétique, couronner avec un septum en caoutchouc et fixer un ballon d’azote.
    3. 7 mL de pyridine sec et 3 mL d’anhydride acétique (Ac2O) injecter le ballon placé sur un bain de glace à 0 oC. remuer la réaction qui en résulte pendant 12 h à température ambiante à l’aide d’un agitateur magnétique à 600-700 tr/min. Évaporer le solvant à l’aide d’une rotative évaporateur à une dépression de 0 - 10 mbar à 50 oC.
    4. Diluer le mélange brut moyen de 30 mL de dichlorométhane (DCM) et extraire avec bicarbonate de sodium aqueux saturé (NaHCO3) (2 x 20 mL) dans une ampoule à décanter de 50 mL.
    5. Réextraire la phase aqueuse avec du DCM (3 x 15 mL) et sécher les couches organiques combinés sur sulfate de sodium. Enlevez le sulfate de sodium par filtration et lavez avec du DCM (5 mL). Laisser évaporer le solvant à l’aide d’un évaporateur rotatif à pression sous vide de 400 mbar à 40 oC.
    6. Chargez la solution de mélange brut dans 2 mL de DCM sur le dessus du lit de la silice.
    7. Éluer la colonne avec un mélange contenant du toluène et acétone à partir de 0 - 20 % acétone dans le toluène et recueillir des fractions de 5 à 10 mL.
    8. Surveiller les fractions collectées par TLC (étapes 1.1.4 et 1.1.6), développer avec toluène/acétone (7/3), et la coloration avec une solution de molybdate d’ammonium cérium suivis du chauffage sur une plaque chauffante.
    9. Évaporer le produit contenant des fractions à l’aide d’un évaporateur rotatif pour obtenir les produits désirés comme écume blanche à 72 % et des rendements de 85 %, respectivement.
    10. Dissoudre les produits dans 7 mL d’acétonitrile : toluène : H2O en 4:2:1 ratio dans un ballon à fond rond 25 mL.
    11. Ajouter nitrate de cérium d’ammonium (2 équivalents) en refroidissant à 0 oC à l’aide d’un bain de glace. Remuer la réaction à température ambiante pendant 3 h à ~ 500-800 tr/min.
    12. Après TLC indique la consommation totale de matière première (TLC développer avec toluène/acétone (7/3) et la visualisation de l’absorbance UV à 254 nm ou par coloration avec une solution de molybdate d’ammonium de cérium suivi du chauffage), diluer le mélange réactionnel avec l’acétate d’éthyle (30 mL) et extrait avec H2O (15 x 2 mL).
    13. Extraire les couches organiques combinées avec 5 mL de solution saturée de chlorure de sodium (NaCl).
    14. Laisser évaporer le solvant à l’aide d’un évaporateur rotatif à pression de vide de 240 mbar à 40 oC.
    15. Chargez la solution du brut produit dans 2 mL de DCM sur le dessus du lit de la silice. Éluer la colonne avec un mélange contenant du toluène et acétone (0 - 20 % d’acétone dans le toluène) et recueillir des fractions de 5 à 10 mL. Surveiller les fractions collectées par TLC, développer avec toluène/acétone (7/3).
    16. Faire évaporer les fractions contenant du produit à l’aide d’un évaporateur rotatif à 77 mbar vide et 40 oC pour obtenir les produits désirés comme des mousses blanches.
    17. Dissoudre les alcools respectifs dans 10 mL de DCM dans un ballon à fond rond 25 mL single-cou et laisser refroidir à-30 oC.
    18. Ajouter trifluorure de diéthylaminosoufre (DAST, 2 équivalents). Remuer le mélange réactionnel à-30 oC pendant 2 h.
    19. Après TLC indique la consommation de matière première (TLC développer avec toluène/acétone (4/1) et la visualisation de l’absorbance UV à 254 nm ou par coloration avec une solution de molybdate d’ammonium de cérium suivi du chauffage), diluer le mélange réactionnel avec du DCM (30 mL) , et saturé de lavage avec NaHCO3 (15 x 2 mL).
    20. Extraire la couche organique combinée avec 5 mL de solution saturée de NaCl, séchez-le en ajoutant du sulfate de magnésium anhydre, filtrer le mélange après un lavage avec du DCM (5 mL) et ramasser dans un ballon à fond rond 100 mL single-cou.
    21. Laisser évaporer le solvant à l’aide d’un évaporateur rotatif à pression sous vide de 400 mbar à 40 oC.
    22. Chargez la solution du brut produit dans 2 mL de DCM sur le dessus du lit de la silice. Éluer la colonne avec un mélange de toluène et d’acétone (0-20 % d’acétone dans le toluène) et de recueillir des fractions de 5 à 10 mL.
    23. Surveiller les fractions collectées par TLC, développer avec toluène/acétone (7/3).
    24. Évaporer le produit contenant des fractions à l’aide d’un évaporateur rotatif pour obtenir les produits désirés 4, [2,3,4,6-O-tetraacetyl-β-D-galactopyranosyl]-(1→4)-[3,6-O-diacetyl-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl]-(1→2)-3,4,6- O-triacétyl-α-D-mannopyranosyl fluorure (54 % par rapport à 2 étapes) et 5, [2,3,4,6-O-tetraacetyl-β-D-galactopyranosyl]-(1→4)-[2,3,4-O-triacetyl-α-L-fucopyranosyl-(1→3)-3,6-O-diacetyl-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl]-(1→2)- 3,4,6-O-triacetyl-α-D-mannopyranosyl fluorure (67 % par rapport à 2 étapes) comme solides blancs.
    25. Caractériser le produit par RMN et la spectrométrie de masse (voir le dossier de données supplémentaires).

2. préparation du glycane 10

  1. Préparation des intermidiate 7
    1. Peser argent dichlorure de bis(cyclopentadienyl)hafnium(IV) (AgOTf) (0,039 g, 0.155 mmol), triflate (Cp2HfCl2) (0,041 g, 0,108 mmol) dans un ballon à fond rond 25 mL single-cou, sécher sous vide ligne schlenk pendant 30 min, retirer de la l’aspirateur et remplir avec de l’azote gazeux.
    2. Transvider les fraîchement séché 4 Å tamis moléculaires (0,2 g) dans la fiole contenant le AgOTf et Cp2HfCl2, ajouter a magnétique, bouchon avec le septum immédiatement et ajouter un ballon d’azote.
    3. Transfert de 3 mL de toluène sec dans le ballon avec une seringue en verre sec. Remuer le mélange réactionnel pendant 1 h à température ambiante et puis refroidir à 0 oC.
    4. Injecter une solution de donateurs 4 (Figure 2, g 0,043, 0,046 mmol) et accepteur 6, 5-Azidopentyl-O-2-O-acetyl-4,6-O-benzylidine-β-D-mannopyranosyl-(1→4)-O-(3,6-di-O-benzyl-2-deoxy-2-(2,2,2-trichloroethoxy) carbonylamino-β-D-glucopyranosyl)-(1→4)-O-3,6-di-O-benzyl-2-deoxy-2-(2,2,2-trichloroethoxy)carbonylamino-β-D-glucopyranoside (Figure 3, 0,045 g, 0,031 mmol) dans 3 mL de toluène dans le ballon à travers le septum à l’aide d’une seringue de 10 mL à 0 o C. remuer le mélange réactionnel à température ambiante pendant 3 h.
    5. Après TLC indique la consommation de matières premières (TLC, développer avec DCM/acétone (8,5/1,5) et la visualisation de l’absorbance UV à 254 nm ou par coloration avec une solution de molybdate d’ammonium de cérium suivi du chauffage), étancher la réaction par injection 10 équivalents de triéthyle amine.
    6. Filtrer les tamis moléculaires à travers un lit de Célite dans un ballon jaugé de 50 mL à fond rond et plus laver avec 10 mL d’acétate d’éthyle. Extraire les couches organiques combinées avec une solution saturée d’aqueuse NaHCO3 (2 x 20 mL) dans une ampoule à décanter de 50 mL. Extraire la phase aqueuse avec l’acétate d’éthyle (3 x 15 mL).
    7. Extraire les couches organiques combinées avec une solution saturée de NaCl (5 mL), séchez-le à l’aide de sulfate de magnésium anhydre, filtrer le mélange afin de supprimer le sulfate de magnésium, laver avec de l’acétate d’éthyle (3 x 15 mL) et recueillir le filtrat dans un ballon à fond rond de 100 mL.
    8. Laisser évaporer le solvant à l’aide d’un évaporateur rotatif à pression de vide de 240 mbar à 40 oC.
    9. Chargez la solution du brut produit dans du DCM au sommet de la colonne de lit de silice. Éluer la colonne avec un mélange contenant du DCM et l’acétone (0-10 % d’acétone dans du DCM) et recueillir des fractions de 5 à 10 mL.
    10. Surveiller les fractions collectées par TLC, développer avec DCM/acétone (8,5/1,5). Évaporer les fractions contenant le produit à l’aide d’un évaporateur rotatif à obtenir [5-Azidopentyl-O-{[2,3,4,6-O-tetraacetyl-β-D-galactopyranosyl]-(1→4)-[3,6-O-diacetyl-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl]-(1→2)- 7, intermidiate 3,4,6-O-triacetyl-α-D-mannopyranosyl]}-(1→3)-[2-O-acetyl-4,6-O-benzylidine-β-D-mannopyranosyl-(1→4)-O-(3,6-di-O-benzyl-2-deoxy-2-(2,2,2-trichloroethoxy)carbonylamino-β-D-glucopyranosyl)-(1→4)-O-3,6-di-O-benzyl-2-deoxy-2-( 2,2,2-façon) carbonylamino-β-D-glucopyranoside (0,052 g, 70 %), comme la mousse blanche.
    11. Caractériser le produit par RMN et la spectrométrie de masse (voir le dossier de données supplémentaires).
  2. Préparation d’intermidiate 8
    1. Peser hexasaccharide 7 (Figure 3, 0,040 g, 0,016 mmol) dans un ballon à fond rond 25 mL single-cou, sécher sous vide pendant 1 h, retirer du vide, remplissez-la d’azote gazeux, ajouter un magnétique et couronner avec un septum en caoutchouc.
    2. Transfert de 3 mL d’acetonitrile:methanol (MeOH) (rapport 2:1) dans le ballon.
    3. Ajouter p-toluène sulfonique acide monohydraté (0,001 g, 0.008 mmol) dans le ballon à réaction et remuez la réaction à 800 tr/min pendant 5 h.
    4. Après TLC indique la consommation de matière première (TLC, développer avec DCM/acétone (8,5/1,5) et la visualisation de l’absorbance UV à 254 nm ou par coloration avec une solution de molybdate d’ammonium de cérium suivi du chauffage), étancher la réaction par injection 10 équivalents de triéthyle amine.
    5. Laisser évaporer le solvant à l’aide d’un évaporateur rotatif à pression de vide de 337 mbar à 40 oC.
    6. Dissoudre le mélange brut avec environ 2 mL de DCM et le charger sur le dessus du lit de la silice.
    7. Éluer la colonne avec un mélange de DCM et d’acétone (0 - 10 % d’acétone dans du DCM) et recueillir des fractions de 5 à 10 mL. Surveiller les fractions collectées par TLC, développer avec DCM/acétone (8,5/1,5). Laisser évaporer le solvant à l’aide d’un évaporateur rotatif à 400 mbar vide et 40 oC.
    8. Sécher le résidu sous pression réduite pour donner intermédiaire 8, 5-Azidopentyl-O-(2-O-acetyl-3,4,6-tri-O-benzyl-ced pressure to give →3)-2-O-acétyl-4, 6-O-benzylidine-β - D - mannopyranosyl-(1→4) - O-(3, 6- di-O-benzyl-2-deoxy-2-phthalimido-β-D-glucopyranosyl)-(1→4)-O-3,6 - di-O-benzyl-2-deoxy-2-phthalimido-nzyl-2-deoxy-2-phth. (Figure 3, 0,022 g, 57 %) sous forme de solide blanc. Caractériser le produit par RMN et la spectrométrie de masse (voir le dossier de données supplémentaires).
  3. Préparation du Tango Intermediaire 9
    1. Préparation de Tango Intermediaire 9 (Figure 3) a été réalisée à l’aide de donateurs 5 (0,015 g, 13,2 µmol) et de l’accepteur 8 (Figure 3, 0,020 g, 8,80 µmol).
    2. AgOTf (0,011 g, 44,1 µmol) et Cp2HfCl2 (0,012 g, 30,8 µmol) étaient utilisés comme un promoteurs.
    3. Effectuez les opérations 2.1.1 à 2.1.10 pour obtenir intermédiaire 9, 5-Azidopentyl - O-{[2,3,4,6-O-tetraacetyl-β-D-galactopyranosyl]-(1→4)-[3,6-O-diacetyl-2-acétamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl]-(1→2)-[3,4,6-O-triacetyl-α-D-mannopyranosyl]} -(1→3)-{2,3,4,6-O-tetraacetyl-β-D-galactopyranosyl]-(1→4)-[2,3,4-O-triacetyl-α-LS160fucopyranosyl-(1→3)-3,6-O-diacetyl-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl]-(1→2)-3,4,6-O-triacetyl-α-D-mannopyranosyl}-(1→6)-[2- O-acetyl-β-D-mannopyranosyl-(1→4)-O-(3,6-di-O-benzyl-2-deoxy-2-(2,2,2-trichloroethoxy)carbonylamino-β-D-glucopyranosyl)-(1O-benzyl-2-deoxy-2-(2,2,2-trichloroethoxy)carbonylamino-β-D-glucopyranosyl)-D-glucopyra (0.010 g, 34%), as mousse blanche.
  4. Déprotection mondiale de Tango Intermediaire
    1. Peser le composé 9 (0,010 g, 2,9 µmol) dans un ballon à fond rond 25 mL single-cou, ajouter une barre d’agitation magnétique, casquette avec un septum en caoutchouc et fixer un ballon d’azote.
    2. Transférer 2 mL de 1, 4 dioxane : H2O (4:1) dans le ballon. Ajouter hydroxyde de lithium (LiOH) (0,005 g, 50 % en poids) dans le ballon. Remuer le mélange réactionnel à 90-100 oC pendant 12 h et laisser refroidir à température ambiante.
    3. Évaporer le solvant à l’aide d’un évaporateur rotatif et sécher le flacon sous vide pendant 1 h, remplissez-le avec de l’azote, retirez-la de la tubulure de vide et couronner avec un septum en caoutchouc.
    4. Injecter 4 mL de pyridine sec et 2 mL d’anhydride acétique dans la fiole à travers le septum à l’aide d’une seringue de 10 mL à 0 oC. remuer le mélange réactionnel pendant 12 h à température ambiante.
    5. Évaporer le solvant à l’aide d’un évaporateur rotatif à 0-10 mbar pression de vide à 50 oC.
    6. Dissoudre le mélange brut moyen de 30 mL de DCM et extraire la solution saturée aqueuse NaHCO3 (2 x 20 mL) dans une ampoule à décanter de 50 mL.
    7. Réextraire la phase aqueuse avec du DCM (3 x 15 mL). Laisser évaporer le solvant à l’aide d’un évaporateur rotatif.
    8. Chargez une solution de produit dans environ 2 mL de DCM sur le dessus du lit de silice C18. Éluer la colonne avec un mélange d’eau et de méthanol (0 - 100 % de méthanol dans l’eau) et de recueillir des fractions de 5 à 10 mL.
    9. Recueillir les fractions de produit et s’évaporer sous pression réduite pour obtenir le produit désiré en mousse blanche.
    10. Dissoudre le produit dans 5 mL de méthanol sec dans un 25 mL ballon à fond rond et couronner avec un septum en caoutchouc.
    11. Transfert de 0,1 mL de méthylate de sodium (NaOMe) dans le méthanol et cool à 0 oC à l’aide d’un bain de glace et agiter le mélange pendant 12 h.
    12. Enlever le solvant à l’aide d’un évaporateur rotatif et sécher le produit sous vide élevé.
    13. Dissoudre les produits bruts dans 5 mL de méthanol : H2o : acide acétique (6:3:1).
    14. Ajouter hydroxyde de palladium (Pd(OH)2) (50 % en poids) et remuer la réaction sous atmosphère d’hydrogène à l’aide d’un ballon à hydrogène pendant 15 h.
    15. Filtrer la réaction à travers un lit de Célite et laver avec 2 mL de méthanol puis 2 mL d’eau de dd.
    16. Évaporer le solvant à l’aide d’un évaporateur rotatif.
    17. Dissoudre le mélange brut d’environ 1 mL d’eau et la placer sur le dessus du lit de gel de polyacrylamide (voir Table des matières). Éluer le produit avec de l’eau et recueillir des fractions de 1 à 2 mL.
    18. Surveiller les fractions collectées par TLC, développer avec n-butanol : H2o : acide acétique (1:1:1).
    19. Recueillir les fractions de produit et de lyophiliser pour obtenir le produit désiré 10, 5-Aminopentyl-β-D-galactopyranosyl-(1→4)-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl-(1→2)-α-D-mannopyranosyl]-(1→3),-[β-D-galactopyranosyl-(1→4)-( α-L-fucopyranosyl-(1→3)-2-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl)-(1→2)-α-D-mannopyranosyl]-(1→6)-β-D-mannopyranosyl-(1→4)-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl-(1→4)-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranoside (0.002 g, 36%), as a poudre blanche.
    20. Caractériser le produit par RMN et la spectrométrie de masse (voir le dossier de données supplémentaires).

3. préparation des glycanes avec queue acide phosphonique19,22

  1. Peser la glycane respectif (2-5 µmol) dans un ballon à fond rond 5 mL, ajouter un magnétique et couronner avec un septum en caoutchouc.
  2. Transférer 400 µL du diméthylformamide fraîchement séché.
  3. Ajouter [2 (2 (2 (bis (benzyloxy) phosphoryle) éthoxyéthoxy) carbonate d’éthyle (2, 5-dioxopyrrolidin1-yl)] (10-25 µmol, préparé à la maison) à la solution de glycane. Incorporer le mélange à 800 tr/min pendant 5 h.
  4. Évaporer le solvant à l’aide d’un évaporateur rotatif à pression sous vide de 5-10 mbar à 40 oC.
  5. Dissoudre le mélange réactionnel dans 0,5 mL d’eau et de charge au dessus du lit sur gel de polyacrylamide (voir Table des matières). Éluer le produit à l’aide de l’eau et recueillir des fractions de 1 à 2 mL.
  6. Surveiller les fractions collectées par TLC26. Repérer le mélange réactionnel dans une assiette de TLC, puis ajoutez la tache solution de molybdate d’ammonium de 0,25 M cérium ; Suivez par chauffage à l’aide d’une plaque chauffante. Recueillir le produit contenant des fractions et lyophiliser pour obtenir le produit désiré sous forme de poudre blanche.
  7. Dissoudre le produit dans 2 mL d’eau et ajouter les Pd (OH)2 (50 % en poids). Remuer la réaction à 800 tr/mn sous atmosphère d’hydrogène à l’aide d’un ballon à hydrogène pendant 15 h.
  8. Filtrer la réaction à travers un lit de flux-calciné et laver avec 2 mL de méthanol suivi de 2 mL d’eau distillée désionisée. Évaporer le solvant à l’aide d’un évaporateur rotatif à pression de vide de 300 mbar à 40 oC.
  9. Dissoudre le mélange brut d’environ 1 mL d’eau et la placer sur le dessus du lit de gel de polyacrylamide (voir Table des matières).
  10. Éluer le produit avec de l’eau et recueillir des fractions de 1 à 2 mL. Surveiller les fractions collectées par TLC26. Lyophiliser les fractions (congeler le produit à l’aide d’azote liquide, puis poser sur lyophilisateur sous un vide) pour obtenir le produit désiré sous forme de poudre blanche. Caractériser les produits de la RMN et la spectrométrie de masse (voir le dossier de données supplémentaires) à l’aide D2O comme solvant.

4. glycane Array

  1. Préparation d’aluminium revêtues de lames de verre (diapositive NOC) 19 , 20 , 22
    NOTE : Fabrication des lames en aluminium revêtu de verre a été faite à la Division de la technologie des films minces, Instrument Technology Research Center et laboratoires de recherche nationaux appliqués, parc scientifique de Hsinchu, Taiwan.
    1. Pack lames revêtues, vide-joint afin de prévenir la formation de la NAO et maintenir scellé jusqu'à la réaction électrochimique pour surface anodisation.
  2. Surface anodisation d’aluminium revêtues de lames de verre 19 , 20 , 22
    1. La valeur de l’étuve température à 4 ° C. Préparer la solution aqueuse de l’acide oxalique 0,3 M et gardez-le dans un bain de glace. Prenez le bécher de 500 mL, ajouter une barre de l’agitateur magnétique.
    2. L’acide oxalique de 0,3 M de transfert dans le bécher de 500 mL et puis placez une tige de 10 cm de long platine comme une cathode dans la solution. Gardez en remuant (à 300 tr/min), l’acide oxalique pendant tout le processus d’anodisation.
    3. Tourner le logiciel traceur lab, cliquez sur le bouton « configurer » puis « tension de balayage de choix de fonction ». Régler la mise en marche et arrêter la tension à 25,8 V, nombre de points sur 100, conformité à 1 et balayer le retard à 1 200 ms et cliquez sur « OK ».
    4. Serrer l’enduit aluminium verre orientée vers la cathode. Cliquez sur le bouton « test run ». Observer la mesure actuelle (environ 8-10 mA).
    5. Après surface anodisation, laver la lame avec de l’eau bidistillée, purge sec à l’azote et ensuite le stocker dans une chambre de 30 % d’humidité relative à une utilisation ultérieure.
  3. Fabrication de NOC glycane microarray 22
    1. Préparer individuellement 100 µL de glycanes monovalents tous (I-XI) à l’éthylène glycol à une concentration de 10 mM.
    2. Diluer la glycane ci-dessus avec un tampon d’impression (80 % d’éthylène glycol et 20 % de l’eau désionisée) pour faire 100 concentration µM.
    3. Pour l’étude de l’hétéro-ligand, préparer 5 µL de glycanes individuels I-XI et à chacun, ajouter 5 µL de l’homme5GlcNAc2 (ratio 1:1).
    4. Microarrays d’impression par robotique cerner (voir Table des matières) par le dépôt de 0,6 nL des glycanes préalablement préparées sur le NOC slides31.
    5. Conserver les diapositives imprimées dans une boite sec humidité contrôlée avant l’essai de liaison.
  4. Cartographie des épitopes de glycane de HIV-1 anticorps neutralisants largement PG9 22
    1. Préparer 1 mL BSA contenue un tampon PBST, 3 % p/v.
    2. Préparer 70 µL de PG9 (50 µg/mL) dans un tampon PBST (BSA contenait un tampon PBST, 3 % p/v).
    3. Préparer 120 µL d’anticorps secondaire tag fluorescent Donkey anti-IgG humain (Alexa Fluor 647 conjugué) 50 µg/mL dans un tampon PBST (BSA contenait un tampon PBST, 3 % p/v) dans l’obscurité.
    4. Mélanger l’anticorps primaire (PG9) et anticorps secondaire tag fluorescent en rapport 1:1 (60 µL). Incuber les anticorps prémélangées pendant 30 min à 4 ° C.
    5. Chargez la lame de l’ACG dans la chambre d’incubation de diapositive qui est divisée en 16 puits. Transférer 100 µL d’anticorps prémélangées dans le tableau glycane et incuber à 4 ° C pendant 16 h.
    6. Pipette à anticorps prémélangées. Retirer la chambre d’incubation de diapositive.
    7. Laver la lame tout d’abord dans un tampon PBST (PBS et 0,05 % Tween-20), suivi par de l’eau désionisée et essorage sec à 2 000 x g.
    8. Ouvrez le logiciel d’analyse microarray image (voir la Table des matières). Insérer une diapositive avec les fonctionnalités déployèrent vers le bas.
    9. Cliquez sur le menu « réglages », réglez la résolution de l’image à 5 µm par pixel et la longueur d’onde de 635 nm avec PMT450 et la puissance à 100 %.
    10. Cliquez sur le bouton « scan » pour commencer l’imagerie de la diapositive.
    11. Cliquez sur l’icône « file » pour sauvegarder l’image de balayage en format tif.
    12. Effectuer l’analyse d’image en suivant le guide de l’utilisateur du logiciel32.
    13. Calculer l’intensité totale de fluorescence et d’illustrer à l’aide de logiciels33 de traitement d’image (voir la Table des matières).
      NOTE : Ici, l’erreur de pourcentage moyen pour tous les points de données est présenté par les barres d’erreur.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Résultats

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Une stratégie modulaire de chimio-enzymatique pour la synthèse d’une vaste gamme de N -glycans est présentée dans la Figure 1. La stratégie est basée sur le fait que la diversité peut être créée au début de synthèse chimio-enzymatique des trois modules importants, suivi par la mannosylation α spécifiques à la 3-O et/ou 6-O position du résidu mannose de la commune trisaccharide base de N- glycanes. Compte tenu de la diversit...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Une classe de VIH-1 bNAbs y compris PG9 et PG16 PGTs 128, 141-145 ont été signalés à être très puissant dans la neutralisation des 70-80 % des isolats de VIH-1 en circulation. Les épitopes de ces bNAbs sont très conservés parmi les variantes de l’ensemble du VIH-1 groupe M, donc ils peuvent guider la conception de l’immunogène efficace pour un vaccin contre le VIH susciter la neutralisation des anticorps23,24,25 . Dans le cadre ...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs remercient la Division de technologie Thin Film Instrument Technology Research Center (ITRC) et laboratoires de recherche nationaux appliqués, parc scientifique de Hsinchu, Taiwan. Ce travail a été soutenu par le Conseil National de la Science (n° de subventions. La plupart 105-0210-01-13-01) et l’Académie chinoise des sciences.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Acide acétiqueSigma Aldrich64197
AcétonitrileSigma Aldrich75058
Anhydride acétiqueSigma Aldrich108247
Sulfate de magnésium anhydreSigma Aldrich7487889
Étherate d’éthyle de trifluorure de boreSigma Aldrich109637
Albumine sérique bovineSigma Aldrich9048468
Bio-Gel P2 polyacrylamideBio-Rad1504118
dichlorure de bis(cyclopentadiényl)hafnium(IV)Sigma Aldrich12116664
&beta ;-1, 4 Galactosyl transférases de lait bovinSigma Aldrich48279
BioDot Technologie de cartesion avec broche robotisée SMP3 (Stealth Micro Spotting Pins)Arrayit
Cérum-ammonium molybdateTCIC1794
Nitrate de cérum-ammoniumSigma Aldrich16774213
Lame de verre propre  ;Schott  ;
Cytidine-5&prime ;-monophospho-N-acétylneuraminiqueSigma Aldrich3063716
Chloroforme deutéréSigma Aldrich865496
Donkey Anti-Human IgG (Alexa Fluor647 conjuguéJackson Immuno Research, États-Unis709605098
DichlorométhaneSigma Aldrich75092
Trifluorure de diéthylaminosulfureSigma Aldrich38078090
DiméthylformamideSigma Aldrich68122
Acétate d’éthyleSigma Aldrich141786
Éthylène glycolAcros Organic107211
FAST frame chambres d’incubation de lamesSigma Aldrich
Guanosine 5'- sel disodique de diphospho-b-L-fucose  ;Logiciel Sigma Aldrich15839700
Lab tracer 2.0Section 4 du protocole
Lecteur GenePix Pro 4300A (analyse d’images de microarray)dispositifs moléculaireswww.moleculardevices.com
GraphPad Prism Software (traitement d’image)GraphPad Software, Inchttp://www.graphpad.com/guides/prism/6/user-guide/
Hydroxyde de lithiumSigma Aldrich1310652
manganèseSigma Aldrich7773015
MéthanolSigma Aldrich67561
N-butanolSigma Aldrich71363
Acide oxaliqueAcrosHydroxyde de 144627
de palladiumorganique Sigma Aldrich12135227
Saline tamponnée au phosphateThermo Fisher Scientific  ;
PyridineSigma Aldrich110861
Acide p-toluène sulfonique monohydratéSigma Aldrich773476
Triflate d’argentSigma Aldrich2923286
Chlorure de sodiumSigma Aldrich7647145
Sodium hydrogénocarbonateSigma Aldrich144558
Méthoxyde de sodium  ;Sigma Aldrich124414
Sulfate de sodiumSigma Aldrich7757826
Toluene  ;Sigma Aldrich108883
Tris bufferAmrescoN/AGrade ultra-pur
Tween-20Amresco9005645
Uridine diphosphate galactose (UDP-galactose)Sigma Aldrich137868521
Chlorure de10010023 Bicarbonate de sodium Sigma Aldrich 144558

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kim, P. J., Lee, D. Y., Jeong, H. Centralized modularity of N-linked glycosylation pathways in mammalian cells. PloS one. 4, e7317(2009).
  2. Townsley, S., Li, Y., Kozyrev, Y., Cleveland, B., Hu, S. L. Conserved Role of an N-Linked Glycan on the Surface Antigen of Human Immunodeficiency Virus Type 1 Modulating Virus Sensitivity to Broadly Neutralizing Antibodies Against the Receptor and Coreceptor Binding Sites. J.virol. 90, 829-841 (2015).
  3. Wang, Z., et al. A General Strategy for the Chemoenzymatic Synthesis of Asymmetrically Branched N-Glycans. Science. 341, 379-383 (2013).
  4. Li, L., et al. Efficient Chemoenzymatic Synthesis of an N-glycan Isomer Library. Chem Sci. 6, 5652-5661 (2015).
  5. Pritchard, L. K., Harvey, D. J., Bonomelli, C., Crispin, M., Doores, K. J. Cell- and Protein-Directed Glycosylation of Native Cleaved HIV-1 Envelope. J.Virol. 89, 8932-8944 (2015).
  6. Behrens, A. J., et al. Composition and Antigenic Effects of Individual Glycan Sites of a Trimeric HIV-1 Envelope Glycoprotein. Cell Rep. 14, 2695-2706 (2016).
  7. Barouch, D. H. Challenges in the development of an HIV-1 vaccine. Nature. 455, 613-619 (2008).
  8. Horiya, S., MacPherson, I. S., Krauss, I. J. Recent Strategies Targeting HIV Glycans in Vaccine Design. Nat Chem Bio. 10, 990-999 (2014).
  9. Wang, L. X. Synthetic carbohydrate Antigens for HIV Vaccine Design. Curr Opin Chem Biol. 17, 997-1005 (2013).
  10. Tian, J., et al. Effect of Glycosylation on an Immunodominant Region in the V1V2 Variable Domain of the HIV-1 Envelope gp120 Protein. PLoS Comput Biol. 12, e1005094(2016).
  11. Geyer, H., Holschbach, C., Hunsmann, G., Schneider, J. Carbohydrates of human Immunodeficiency Virus. Structures of Oligosaccharides Linked to the Envelope Glycoprotein 120. The J Bio Chem. 263, 11760-11767 (1988).
  12. Lee, J. H., Ozorowski, G., Ward, A. B. Cryo-EM Structure of A Native, Fully Glycosylated, Cleaved HIV-1 Envelope Trimer. Science. 351, 1043-1048 (2016).
  13. Lonardi, E., Balog, C. I., Deelder, A. M., Wuhrer, M. Natural GlycanMicroarrays. Expert Rev Proteomics. 7, 761-774 (2010).
  14. Paulson, J. C., Blixt, O., Collins, B. E. Sweet Spots in Functional Glycomics. Nat. Chem. Bio. 2, 238-248 (2006).
  15. Dotsey, E. Y., et al. A High Throughput Protein Microarray Approach to Classify HIV Monoclonal Antibodies and Variant Antigens. PLoS One. 10, e0125581(2015).
  16. Wu, C. Y., Liang, P. H., Wong, C. H. New Development of Glycan Arrays. Org Biomol Chem. 7, 2247-2254 (2009).
  17. Scurr, D. J., et al. Surface Characterization of Carbohydrate Microarrays. Langmuir. 26, 17143-17155 (2010).
  18. Blixt, O., et al. Printed Covalent Glycan Array for Ligand Profiling of Diverse Glycan Binding Proteins. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 17033-17038 (2004).
  19. Chang, S. H., et al. Glycan Array on Aluminum Oxide-Coated Glass Slides Through Phosphonate Chemistry. J. Am. Chem. Soc. 132, 13371-13380 (2010).
  20. Tseng, S. Y., et al. Preparation of Aluminum Oxide-Coated Glass Slides for Glycan Microarrays. ACS Omega. 1, 773-783 (2016).
  21. Shivatare, S. S., et al. Efficient Convergent Synthesis of Bi-, Tri-, and Tetra-Antennary Complex Type N-Glycans and Their HIV-1 Antigenicity. J. Am. Chem. Soc. 135, 15382-15391 (2013).
  22. Shivatare, S. S., et al. Modular synthesis of N-Glycans and Arrays for the Hetero-Ligand Binding Analysis of HIV Antibodies. Nat Chem. 8, 338-346 (2016).
  23. McLellan, J. S., et al. Structure of Hiv-1 gp120 V1/V2 Domain with Broadly Neutralizing Antibody PG9. Nature. 480, 336-343 (2011).
  24. Julien, J. P., et al. Asymmetric Recognition of the HIV-1 Trimer by Broadly Neutralizing Antibody PG9. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 4351-4356 (2013).
  25. Willis, J. R., et al. Long Antibody HCDR3s from HIV-Native Donors Presented on a PG9 Neutralizing Antibody Background Mediate HIV Neutralization. Proc Natl Acad Sci U S A. 113, 4446-4451 (2016).
  26. JoVE Science Education Database. Essentials of Organic Chemistry. Performing 1D Thin Layer Chromatography. JoVE. , Cambridge, MA. (2017).
  27. de Castro, M. D., et al. A useful approach to the automation of analytical processes? J Automat Chem. 12, 267-279 (1990).
  28. JoVE Science Education Database. Essentials of Organic Chemistry. Nuclear Magnetic Resonance (NMR) Spectroscopy. JoVE. , Cambridge, MA. (2017).
  29. JoVE Science Education Database. Essentials of Analytical Chemistry. Introduction to Mass Spectrometry. JoVE. , Cambridge, MA. (2017).
  30. Tseng, S. Y., et al. Preparation of Aluminum Oxide-Coated Glass Slides for Glycan Microarrays. ACS Omega. 1 (5), 773-783 (2016).
  31. Blixt, O., et al. Printed covalent glycan array for ligand profiling of diverse glycan binding proteins. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 17033-17038 (2004).
  32. GenePix Pro 6.0 Microarray Acquisition and Analysis Software for GenePix Microarray Scanners User’s Guide & Tutorial. , Axon Instruments/ Molecular Devices Corp. Sunnyvale, CA. (2017).
  33. GraphPad Prism version 6.01 for Windows. GraphPad Software. , La Jolla California USA. Available from: http://www.graphpad.com/guides/prism/6/user-guide/ (2017).

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Réimpressions et autorisations

Demander l’autorisation de réutiliser le texte ou les figures de cet article JoVE

Demander une autorisation

Mots-clés

R seau de N glycanesmicropuce glycanesverre d oxyde d aluminiumliaison h t roligandeanticorps PG9spectrom trie de masseanodisation de surfacesynth se de glycanes

Articles connexes