Génération indépendante et dépendante de la sélection de CRISPR / Cas9-Meded Knockouts dans les cellules de mammifères

Résumé

Les progrès récents dans la capacité de manipuler génétiquement les lignées cellulaires somatiques offrent un grand potentiel pour la recherche fondamentale et appliquée. Ici, nous présentons deux approches pour la production et le dépistage de knock-out créés par CRISPR / Cas9 dans des lignées cellulaires de mammifères, avec et sans utilisation de marqueurs sélectionnables.

Résumé

Le système d'ingénierie du génome CRISPR / Cas9 a révolutionné la biologie en permettant un montage précis du génome avec peu d'effort. Guidé par un seul ARN guide (sgRNA) qui confère une spécificité, la protéine Cas9 clive les deux brins d'ADN au locus ciblé. La rupture de l'ADN peut déclencher une jointure terminale non homologue (NHEJ) ou une réparation dirigée par homologie (HDR). NHEJ peut introduire de petites suppressions ou des insertions qui conduisent à des mutations par déplacement de trame, tandis que HDR permet des perturbations plus grandes et plus précises. Ici, nous présentons des protocoles pour générer des lignées cellulaires knock-out en couplant les méthodes CRISPR / Cas9 établies avec deux options pour la sélection / sélection en aval. L'approche NHEJ utilise un seul site de coupe de sgRNA et un dépistage indépendant de la sélection, où la production de protéines est évaluée par immunotransfert par points de manière à haut débit. L'approche HDR utilise deux sites de sgRNA coupés qui couvrent le gène d'intérêt. Ensemble avec un modèle HDR fourni, cette méthode peut éliminerDe dizaines de kb, aidé par le marqueur de résistance sélectionnable inséré. Les applications et avantages appropriés de chaque méthode sont discutés.

Introduction

Les modifications génétiques stables offrent un avantage sur les méthodes transitoires de perturbation cellulaire, qui peuvent être variables dans leur efficacité et leur durée. L'édition génomique est devenue de plus en plus courante ces dernières années en raison du développement de nucléases spécifiques cibles, telles que les nucléases ^{1 , 2 , 3 , 4 , 5} , les nucléases effectrices de l'activateur de la transcription (TALEN) ^{6 , 7} <....

Protocole

1. Identification des régions d'homologie autour de la suppression désirée

REMARQUE: nécessaire uniquement si vous utilisez l'édition basée sur la sélection.

1. Sélectionnez deux régions, initialement 1,5-2 kb, de chaque côté du locus de suppression désiré, qui serviront d'armes d'homologie dans le modèle HDR ( Figure 1A ). Identifiez les régions qui manquent de sites de reconnaissance BsaI sur l'un ou l'autre des deux (GGTCTC) pour faciliter le clonage. Si les sites BsaI sont inévitables, utilisez une enzyme de restriction de type II (BsmBI, SapI, BbsI) et modifiez les sites c....

Résultats

Pour la génération de lignes knock-out ELAVL1, un anticorps robuste était disponible, de sorte que l'édition utilisant des sgRNAs simples ( Figure 1A , à gauche) a été effectuée, suivie d'un immunoblot point. Trois sgRNAs ont été transfectés de manière indépendante pour comparer l'efficacité et éliminer les effets cibles dans les clones résultants. Après avoir recueilli et bloqué les lysats cellulaires à partir de populations clonales sur deux me.......

Discussion

Le système CRISPR / Cas9 a permis une génération efficace de modifications génomiques stables, qui fournissent une alternative plus cohérente aux autres méthodes de manipulation transitoires. Ici, nous avons présenté deux méthodes pour l'identification rapide des knockouts du gène CRISPR / Cas9 dans les lignées cellulaires de mammifères. Les deux méthodes nécessitent peu de matériel cellulaire, de sorte que les tests peuvent être effectués dans les premiers stades de la culture clonale, en économisant du temps et de.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Competent E. coli cells
plasmide prep kit
pSpCas9(BB) plasmide	Addgene	42230	Ran et al. 2013, clonage des sgRNAs
BbsI enzyme	ThermoFisher	FD1014	Ran et al. 2013, clonage des sgRNAs
T7 DNA ligase	NEB	M0318L	Ran et al. 2013, clonage d’ARNsg
Tango Buffer	ThermoFisher	BY5	Ran et al. 2013, clonage d’ARNsg
PlasmidSafe exonucléase	Epicentre	E3105K	Ran et al. 2013, clonage d’ARNsg
Q5 démarrage à chaud polymérase haute fidélité	NEB	M0494A	HA amplification
pUC19-BsaI			Plasmide pUC19 modifié, mutation du site BsaI existant et insertion de deux sites BsaI orientés vers l’extérieur après digestion BamHI/EcoRI
pGolden-Neo	Addgene	51422	Cassette de résistance
pGolden-Hygro	Addgene	51423	Cassette de résistance
Enzyme BsaI	NEB	R3535S	Construction de bras d’homologie
T7 ADN ligase	NEB	M0318L
PlasmidExonucléase sûre	Epicentre	E3105K
Cure-dents			PCR bactérien Taq
polymérase			bactérienne PCR
HEK293 cellules
DMEM	Corning	10-013-CV
FBS	Corning	MT35010CV
Pénicilline-Strep (opt.)	Gibco	15140-122
Plaques 6 puits	BioLite	12556004
TransIT-LTI Réactif de transfection	Mirus	MIR2300	pour lipofection uniquement
Opti-MEM	ThermoFisher	31985062	pour lipofection uniquement
G418 (Neomycin)	Sigma Aldrich	A1720-5G
Hygromycin	Sigma Aldrich	H3274-250MG
Plaques 96 puits	ThermoFisher	12556008
Tampon de lyse passive, 5x	Promega
1x Tampon			recette décrite dans le protocole
Membrane nitrocellulosique	Bio-Rad	162-0115
Recette TBST			décrite dans le protocole
Lait déshydraté
Substrat SuperSignal West Dura Extended Duration ThermoFisher		34075	pour anticorps secondaires conjugués à la HRP
Extraction d’ADN préparation pour PCR	Quantabio	95091-025
KOD polymérase	Novagen	71316

colonie humaines de chargement SDS