Un abonnement JoVE est requis pour visualiser ce contenu. Connectez-vous ou commencez votre période d'essai gratuite.

Article de méthode

La morphologie de poils absorbants d’Arabidopsis semis dans une bicouche Microfluidic plateforme d’imagerie

8.1K vues

⸱

DOI :

10.3791/55971

⸱

15 août 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Bredesen Center for Interdisciplinary Research and Graduate Education, University of Tennessee, 2Bioscience Division and Center for Nanophase Materials Sciences, Oak Ridge national Laboratory, 3Department of Biochemistry and Cellular and Molecular Biology, University of Tennessee, 4Department of Microbiology, University of Tennessee

Dans cet article

Résumé

Cet article montre comment la culture de semis de Arabidopsis thaliana en une plate-forme microfluidique de deux couches qui confine la racine principale et les poils absorbants pour un seul plan optique. Cette plate-forme peut être utilisée pour l’imagerie optique en temps réel de la morphologie de racines fines aussi bien en ce qui concerne l’imagerie haute résolution par d’autres moyens.

Résumé

Poils absorbants augmentent la surface racinaire pour une meilleure absorption de l’eau et l’absorption des nutriments par la plante. Parce qu’ils sont de petite taille et souvent masquée par leur environnement naturel, fonction et morphologie des poils absorbants sont difficiles à étudier et souvent exclus de la recherche sur les plantes. Ces dernières années, les plateformes microfluidiques ont offert un moyen de visualiser le système racinaire à haute résolution sans déranger les racines lors du transfert d’un système d’imagerie. La plate-forme microfluidique présentée ici s’appuie sur des recherches antérieures de plante-on-a-chip en incorporant un dispositif deux couches pour confiner la racine principale de l’Arabidopsis thaliana au même plan optique comme les poils absorbants. Cette conception permet la quantification des poils absorbants sur un téléphone cellulaire et organelle niveau et également empêche l’axe z à la dérive lors de l’ajout de traitements expérimentaux. Nous décrivons comment stocker les appareils dans une ambiance confinée et hydratée, sans la nécessité pour les pompes fluidiques, tout en maintenant un environnement gnotobiotiques pour le semis. Après l’expérience d’imagerie optique, l’appareil peut être démonté et utilisé comme substrat pour la force atomique ou la microscopie électronique à balayage tout en gardant les structures fines racines intactes.

Introduction

Caractéristiques de radicelles augmentent l’eau et l’acquisition de nutriments pour la plante, explorer de nouveaux espaces de sol et d’accroître la superficie totale des racines. Le chiffre d’affaires de ces fonctionnalités de radicelles joue un rôle important dans la stimulation de l' underground chaîne alimentaire1 et le nombre de racines fines dans certaines espèces de plantes est devrait doubler en dioxyde de carbone atmosphérique élevé2. Les radicelles sont généralement définis comme ceux inférieurs à 2 mm de diamètre, bien que les nouvelles définitions préconisent pour caractériser les racines fines par leur fonction3. Comme beaucoup de fines racines, radicelles offrent les fonctions d’absorption et d’absorption mais occupent un espace beaucoup plus petit avec des diamètres de l’ordre du micron. En raison de leur petite taille, poils absorbants sont difficiles à image in situ et sont souvent négligés dans le cadre de l’architecture globale de la racine dans les modèles et les expériences en champ.

Ex terra poil étudie, tel à partir de plants cultivés sur milieu gélosé, ont présenté à la communauté scientifique des renseignements précieux sur la croissance cellulaire et de transport4,5. Tandis que les boîtes de gélose permettent des systèmes racinaires à être photographiée en temps réel et de façon non destructive, ils ne proposent pas de contrôle de l’environnement élevé pour l’ajout de traitements expérimentaux tels que les éléments nutritifs, hormones de plantes ou de bactéries. Une nouvelle solution pour faciliter l’imagerie haute résolution tout en offrant également contrôle dynamique de l’environnement a été l’avènement de plateformes microfluidiques pour les études de l’usine. Ces plates-formes ont permis la croissance non destructif et la visualisation de plusieurs espèces de plantes à haut rendement phénotypage6,7,8,9, traitements chimiques isolés 10, force dimensions11,12et l’ajout de micro-organismes13. Conceptions de plate-forme microfluidiques ont mis l’accent sur l’utilisation de couches fluidique unique espace ouvert dans lequel les racines peuvent se propager, autorisant les poils de la racine à la dérive dans et hors de l’optique mise au point au cours de la croissance ou le traitement.

Nous présentons ici une procédure pour l’élaboration d’une plateforme de microfluidique de deux couches à l’aide de photo et les méthodes douces-lithographie qui s’appuie sur les conceptions précédentes de plante-on-a-chip en limitant les poils absorbants des semis pour le plan d’imagerie de la racine principale. Cela nous permet de suivre le développement de poils absorbants en temps réel, à haute résolution et tout au long du processus de traitement expérimental. Nos méthodes de culture permettent des semis d’Arabidopsis thaliana à être mises à germer des graines au sein de la plate-forme et d’élevage pour une semaine en milieu hydraté et stérile qui ne nécessite pas l’utilisation d’équipements de pompe seringue. Après que l’expérience d’imagerie Time-lapse a conclu, la plateforme présentée ici peut être ouverte sans déranger la position des caractéristiques plus fines racines. Ceci permet l’utilisation d’autres méthodes d’imagerie haute résolution. Nous fournissons ici résultats représentatifs pour la quantification et la visualisation de la morphologie des poils absorbants dans cette plate-forme par microscopie optique, balayage (SEM) et à force atomique techniques de microscopie (AFM).

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Protocole

1. deux-couche Fabrication de plate-forme

  1. Fabrication des maîtres multicouches
    1. Spin manteau à base d’époxy de résine photosensible négative (~63.45% solides, 1 250 cSt) selon les spécifications du fabricant (2 000 tr/min 45 s) sur une plaquette de silicium de diamètre de 4 pouces pour obtenir la hauteur souhaitée de 20 µm pour la première couche de conception.
    2. Soft-cuire les gaufres resist couché pendant 4 min à 95 ° C. Permettre la plaquette refroidir pour 5 min. exposer la plaquette aux UV pour 15 s (~ 150 mJ/cm2 à 365 nm) à travers un photomasque dans un UV contact aligneur pour définir la géométrie de la couche inférieure.
    3. Après l’exposition cuire la galette pendant 5 min à 95 ° C. Sans développer, retourner la gaufrette au spin coater spin et sur une seconde couche de RESINE PHOTOSENSIBLE négative à base d’époxy (~76.75% solides, 80 000 cSt) à 3 000 tr/min pour atteindre une hauteur de deuxième couche de 150 à 200 µm.
    4. Permettre la gaufrette se reposer pendant 5 min avant de les transférer à une plaque chauffante à 95 ° C pendant 45 min. Après la cuisson sur la plaque de cuisson, retirer la plaquette et laisser la résistance se refroidir et durcir à température ambiante pendant 5 min sur une surface plane. Aligner et exposer la gaufrette à la deuxième photomask couche pendant 30 s dans un aligneur de contact UV (dose d’environ 300 mJ/cm2).
    5. Effectuer une cuisson post-exposition en plaçant les tranches sur une plaque de cuisson à 95 ° C pendant 15 minutes et laisser ensuite la plaquette à refroidir sur une surface plane pendant 5 min avant de développer.
    6. Développer les deux couches de résister en même temps en plaçant la plaquette dans un plat en plastique et submergeant la plaquette dans le développeur approprié (voir la Table des matières). Balançant doucement le plat occasionnellement pour lavis développeur fraîche sur la plaquette.
    7. Après 17 minutes, rincez la plaquette avec de l’isopropanol (IPA). Si une pellicule blanche apparaît, continuer à parcourir entre rinçage la plaquette avec le développeur et l’UIE, jusqu'à ce que le film disparaît. Sécher la plaquette de silicium à motifs avec de l’azote.
  2. Polydiméthylsiloxane Soft-Lithographie
    1. Exposer la plaquette de silicium d’un plasma d’air pendant 30 s dans un plasma cleaner mis en haut (voir Table des matières) pour nettoyer. Silyler l’hostie du silane trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluoro-n-octyl) sous une hotte chimique sur une plaque chauffante sous le point d’éclair du silane (85 ° C) pendant 2 h.
    2. Verser un ratio 10:1 de polydiméthylsiloxane (PDMS) agent de durcissement sur la plaquette de silicium de maître. Dégazer le PDMS mélangés dans une chambre à vide et puis guérir le polymère dans un four à 70 ° C pendant 1 h ou jusqu'à ce que le PDMS est complètement guéri.
    3. À l’aide d’un scalpel, couper les dispositifs PDMS et pelez-les de la plaquette de silicium de maître. Un coup de poing biopsie 1,5 mm permet de créer des entrées de semences et le traitement, poinçonnage de l’entrée de la graine à un angle de 45° pour encourager la croissance des racines dans le chenal principal.
    4. Ruban adhésif transparent permet d’enlever les débris de l’appareil PDMS et placez le côté design de périphérique sur une lamelle de verre. Stériliser les appareils assemblés.

2. dispositifs de plantation

  1. Préparation de semences de Arabidopsis thaliana
    1. Surface de stériliser les graines d’Arabidopsis dans un tube à centrifuger avec une solution d’eau de Javel commercialement disponible 30 % dilué dans un détergent Triton X déminéralisée à eau et 0,1 % pour les semences de lavage de 7 min. 4 fois avec de l’eau stérile.
    2. Stratifier les graines par réfrigération tube à centrifuger pendant la nuit ou jusqu'à une semaine à 4 ° C.
  2. Préparation de l’appareil
    1. Placer des dispositifs stérilisés dans un vide dégazage chambre pour enlever l’air du gaz perméable PDMS et canaux fluidiques pour améliorer la facilité de remplissage.
    2. Enlever les dispositifs de la chambre à vide et plonger immédiatement les dispositifs dans une boîte de Pétri remplie de ¼ force végétale un milieu liquide à pH 5,7.
    3. À l’aide d’une pipette, tirer le liquide à travers les bras de mer pour remplir l’appareil. Veillez à ce qu’aucune bulle d’air ne reste au sein de canaux par inspection visuelle.
    4. Transfert des unités individuelles à nouveau Pétri sec. Verser ou une pipette agar chaud autour de l’appareil jusqu'à ce que le niveau de gélose affleure presque au dessus de l’appareil PDMS. Permettre à agar se solidifier.
      NOTE : Les dispositifs sont maintenant prêtes à planter des graines ou peuvent être conservés à 4 ° C jusqu'à ce que nécessaire.
  3. Planter des graines dans les dispositifs
    1. Dans un environnement stérile, transférer une graine stérilisée à l’entrée de chaque appareil à l’aide d’une petite pipette.
    2. Couverture de la boîte de Pétri avec de la cire du film (voir Table des matières) et placer dans une chambre de croissance cycle lumière/obscurité ou le rebord de la fenêtre à la température ambiante. Orienter la boîte de Pétri afin que les périphériques sont verticaux et gravité va encourager les racines à se développer à travers le canal.

3. le traitement

  1. Traitements expérimentaux
    1. Au moment voulu dans le développement de la plantule, ajouter le traitement expérimental à la plantule en ajoutant un montant prescrit du traitement à chacun des ports 8 côté par pipette.
    2. Refermer la boîte de Pétri et revenir à la chambre de croissance ou une fenêtre.
    3. Aller de l’avant avec l’imagerie des échantillons au moment voulu pour capturer des moments individuels ou commencer imagerie de laps de temps.

4. optique imagerie

  1. Abaisser l’imagerie de résolution (4-20 X)
    1. Placer l’ensemble boîte de Pétri contenant l’appareil et le semis sous un microscope inversé champ lumineux pour le champ lumineux de basse résolution (4-20 X) ou l’imagerie (DIC) de contraste interférentiel différentiel. Optimiser les conditions d’éclairage pour élucider les caractéristiques morphologiques d’intérêt en réglant le temps d’exposition, la luminosité de la lampe, ouverture et la polarité de la lumière. Conduire la scène à l’endroit désiré de la racine et se concentrer sur la racine ou le root hair(s) d’intérêt.
    2. Acquérir un moment unique ou une série temporelle d’images. Pour visualiser la croissance des poils absorbants, image croissante des poils absorbants une fois par minute. Pour visualiser la croissance de la racine principale, acquérir une image chaque 30 min. retour la boîte de Pétri et les semis à la chambre de croissance ou le rebord de la fenêtre en position verticale après l’imagerie est terminée.
  2. Imagerie de résolution (20-63 X) supérieur
    1. Lorsque la plantule est trop grand pour un temps désiré, utilisez pinces pour retirer la lamelle couvre-objet et dispositif de l’agar. Nettoyer le fond de la lamelle à l’aide d’un tissu de laboratoire éthanol humidifiée.
    2. Appliquer les médias recommandée d’immersion à l’objectif tel que suggéré par le fabricant de lentilles du microscope. Placez le couvre-objet sur la platine du microscope et soulever la scène pour communiquer avec les médias de l’immersion sur l’objectif. Optimiser les conditions d’éclairage en réglant le temps d’exposition, la luminosité de la lampe, ouverture et la polarité de la lumière. Conduire la scène à l’endroit désiré et de se concentrer sur root hair(s) d’intérêt.
      Remarque : La DIC est requis pour visualiser la cyclose et marqueurs fluorescence sont nécessaires pour visualiser le mouvement des organites.
    3. Afin de quantifier la croissance des cheveux de la racine au fil du temps, acquérir une image par min. Afin de visualiser le mouvement des organites, réduire au minimum le temps d’exposition de fluorescence tout en conservant un signal de fluorescence identifiable d’organelles. Acquérir dès que le temps d’exposition permet des images des organites. Pour plus de Time-lapse imagerie, utiliser un incubateur de stade d’imagerie de cellules vivantes pour maintenir l’humidité et la température ambiante.
      Remarque : Un objectif à huile 63 X est recommandé pour imagerie organites de poils absorbants.

5. non optique imagerie

  1. Préparation de l’appareil
    1. Lorsque des semis sont trop grand pour la durée souhaitée,
Retirez l’appareil et la lamelle couvre-objet de la boîte de Pétri.
  • Retournez l’appareil et décollez délicatement la lamelle couvre-objet pour que la racine reste dans le chenal PDMS.
  • Continuer d’utiliser le dispositif PDMS comme substrat pour la racine dans la force atomique résolution plus élevée ou la microscopie électronique à balayage.
  • Microscopie électronique à balayage
    1. Déposer une fine (~ 20 nm) couche de chrome sur la racine et qui entourent le PDMS en utilisant une double Gun Electron Beam évaporation chambre.
    2. Transférer la racine et le dispositif de PDMS devant une chambre du microscope électronique à balayage.
      NOTE : Conditions, c'est-à-dire de tension, distance actuelle et fonctionnel de l’imagerie devra être optimisé pour atteindre la résolution souhaitée pour une application donnée.
  • Microscopie à Force atomique (AFM)
    1. Du côté de racine du périphérique PDMS montent sur un porte-échantillon AFM. Pour augmenter le contraste dans la caméra et la racine plus facilement distinguer le PDMS, placez l’appareil PDMS sur un substrat plat réfléchissant (comme mica revêtu en or) avant de monter l’appareil sur le porte-échantillon AFM.
    2. Fixer une attache bien liquide sur le dessus de l’appareil PDMS et remplissez-le d’eau pour garder les racines hydratés pendant la formation image.
    3. Insérez le porte-échantillon dans l’AFM. Réglage de la z-pour l’épaisseur de l’appareil PDMS et conduire le cantilever à la région d’intérêt sur la racine à l’aide d’une caméra pour l’orientation.
    4. Aligner le laser avec la pointe du levier. Pour de meilleurs résultats avec l’imagerie mode de contact, utilisez poutres en porte-à-faux avec des constantes de printemps de 0,01 ou 0,03 N/m à exercer une force minimale sur la racine lors de la numérisation.
    5. Abaissez lentement le mécanisme de balayage jusqu'à ce que le levier soit juste en contact avec l’échantillon. Ajustez la taille de numérisation pour la région souhaitée, puis choisissez une vitesse de balayage de 1 ligne/s avec 256 points de tension par ligne. L’analyse de l’acquisition.

    • Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

    Résultats

    La microfluidique PDMS diploblastique décrits ici ont un canal élevé de 200 µm pour la racine principale d’Arabidopsis et une chambre haute de 20 µm à confiner latéralement de plus en plus les poils (Figure 1 a). Cette conception peut être utilisée pour les espèces de plantes avec un diamètre racine semblable comme Arabidopsis thaliana et peut être facilement modifiée pour tenir compte des espèces de différentes tailles. La concepti...

    Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

    Discussion

    La méthode décrite dans cet article pour la création d’une plate-forme centrale-on-a-chip est unique car les deux couches design confins les poils absorbants pour un seul plan d’imagerie et de la plate-forme peut être déconstruits et utilisés comme substrat pour l’imagerie non optiques de haute résolution . Imagerie non optiques à haute résolution peut fournir des informations précieuses sur le tissu de la plante qui ne peut pas être obtenu de l’imagerie optique seul. Par exemple, l’imagerie AFM peut fournir des mesures ...

    Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

    Déclarations de divulgation

    Les auteurs n’ont rien à divulguer.

    Remerciements

    Ce manuscrit a été écrit par UT-Battelle, LLC sous le contrat no. DE-AC05-00OR22725 avec l’US Department of Energy. Le gouvernement des Etats-Unis maintient et le serveur de publication, par l’acceptation de l’article pour publication, reconnaît que le gouvernement des États-Unis conserve une licence non exclusive, versée, irrévocable, mondial pour publier ou reproduire le formulaire publié de Ce manuscrit, ou permettre aux autres de le faire, aux fins du gouvernement des États-Unis. Le Department of Energy fournira l’accès du public à ces résultats de recherche parrainé par le gouvernement fédéral conformément au Plan de l’accès Public DOE (http://energy.gov/downloads/doe-public-access-plan).

    Ce travail a été soutenu en partie par le programme de sciences génomiques, U.S. Department of Energy, Office of Science, biologique et recherche sur l’environnement, dans le cadre de la plante Microbe Interfaces scientifique Focus Area (http://pmi.ornl.gov). La fabrication des plateformes microfluidiques a été réalisée dans le laboratoire de recherche de Nanofabrication au Centre pour les Sciences des matériaux Nanophase, qui est un bureau d’installations de la Science utilisateurs DOE. JAA est soutenu par une bourse d’études supérieures de NSF DGE-1452154

    Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

    Matériaux

    Liste des matériaux utilisés dans cet article
    NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
    Plaquette de siliciumWRS Matériaux100 mm de diamètre, épaisseur 500-550um, Prime, résistivité 10-20, N/Phos< 100>
    Quintel Contact AlignerNeutronix Quintel CorpNXQ 7500 Mask Aligner
    Microscope fluorescentNikonEclipse Ti-U
    tissu de laboratoireKimberly ClarkKimwipe KIMTECH SCIENCE Marque, 34155
    Negative Photoresist EpoxyMicrochemSU-8 2000s series
    Photoresist developerMicrochemSu-8 développeur
    trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluoro-octyl)silaneSigma Aldrichutilisation dans le capot chimique
    Air Plasma CleanerHarrick Plasma
    PDMSDow CorningSylgard 184 Base d’élastomère
    PDMS agent de durcissementDow CorningSylgard 184 Agent
    de durcissement de l’élastomère de siliconeDessicatorBel-ArtF42010-000
    ScalpelX-acto couteau
    Biopsie PunchTed Pella15110-15
    Ruban adhésifAgrafesInvisible Tape
    Tube MicrofugeEppendorf
    Triton XJ.T.Baker XI98-07
    BleachChloroxMilieux concentrés
    base de plantesPhyto Technology LaboratoriesM524
    AgarTeknovaA7777
    Film de cireMicroscope parafilm
    OlympusIX51
    Microscope à force atomiqueKeysight Technologies5500 PicoPlus AFM
    Boîte de PétriVWR
    Microscope électronique à balayageJEOL7400
    Évaporateur à faisceau d’électrons à double pistoletThermionicsSystème d’évaporation à double pistolet à électrons personnalisé
    de silicone à

    Références

    1. Pritchard, S. G. Soil organisms and global climate change. Plant Pathol. 60 (1), 82-99 (2011).
    2. Norby, R. J., Ledford, J., Reilly, C. D., Miller, N. E., O'Neill, E. G. Fine-root production dominates response of a deciduous forest to atmospheric CO2 enrichment. Proc. Natll. Acad. Sci. USA. 101 (26), 9689-9693 (2004).
    3. McCormack, M. L., et al. Redefining fine roots improves understanding of below-ground contributions to terrestrial biosphere processes. New Phytol. 207 (3), 505-518 (2015).
    4. Mangano, S., Juarez, S. P. D., Estevez, J. M. ROS regulation of polar-growth in plant cells. Plant Physiol. 171 (3), 1593-1605 (2016).
    5. Ketelaar, T., Emons, A. M. The Actin Cytoskeleton in Root Hairs: A Cell Elongation Device. Root Hairs. , 211-232 (2009).
    6. Grossmann, G., et al. The RootChip: an integrated microfluidic chip for plant science. Plant Cell. 23 (12), 4234-4240 (2011).
    7. Grossmann, G., et al. Time-lapse fluorescence imaging of Arabidopsis root growth with rapid manipulation of the root environment using the RootChip. J. Vis. Exp. (65), (2012).
    8. Jiang, H., Xu, Z., Aluru, M. R., Dong, L. Plant chip for high-throughput phenotyping of Arabidopsis. Lab Chip. 14 (7), 1281(2014).
    9. Busch, W., et al. A microfluidic device and computational platform for high-throughput live imaging of gene expression. Nat. Methods. 9 (11), (2012).
    10. Meier, M., Lucchettta, E., Ismagilov, R. Chemical Stimulation of the Arabidopsis thaliana Root using Multi-Laminar Flow on a Microfluidic Chip. Lab Chip. 10 (16), 2147-2153 (2010).
    11. Ozoe, K., Hida, H., Kanno, I., Higashiyama, T., Notaguchi, M. Early characterization method of plant root adaptability to soil environments. Proc. of 28th IEEE Interntl. Conf. Micro. Electro Mech. Syst. , (2015).
    12. Sanati Nezhad, A. Microfluidic platforms for plant cells studies. Lab on a chip. , 3262-3274 (2014).
    13. Parashar, A., Pandey, S. Plant-in-chip: Microfluidic system for studying root growth and pathogenic interactions in Arabidopsis. App. Phys. Lett. 98 (26), 2009-2012 (2011).
    14. Rigas, S., et al. Root gravitropism and root hair development constitute coupled developmental responses regulated by auxin homeostasis in the Arabidopsis root apex. New Phytolol. 197 (4), 1130-1141 (2013).
    15. Bengough, A. G., McKenzie, B. M., Hallett, P. D., Valentine, T. A. Root elongation, water stress, and mechanical impedance: A review of limiting stresses and beneficial root tip traits. J. Exp. Bot. 62 (1), 59-68 (2011).
    16. Sia, S. K., Whitesides, G. M. Microfluidic devices fabricated in poly(dimethylsiloxane) for biological studies. Electrophor. 24 (21), 3563-3576 (2003).
    17. Millet, L. J., Stewart, M. E., Sweedler, J. V., Nuzzo, R. G., Gillette, M. U. Microfluidic devices for culturing primary mammalian neurons at low densities. Lab chip. 7 (8), 987-994 (2007).
    18. Nelson, B. K., Cai, X., Nebenführ, A. A multicolored set of in vivo organelle markers for co-localization studies in Arabidopsis and other plants. Plant J. 51 (6), 1126-1136 (2007).
    19. Talbot, M. J., White, R. G. Cell surface and cell outline imaging in plant tissues using the backscattered electron detector in a variable pressure scanning electron microscope. Plant Methods. 9 (1), 40(2013).

    Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

    Réimpressions et autorisations

    Mots-clés

    Arabidopsis thalianamicroscopie en champ clairmicroscopie force atomiquemicroscopie lectronique balayagedispositif en PDMSst rilisation des grainesapplication du traitementimagerie des organites
    La morphologie de poils absorbants d’Arabidopsis semis dans une bicouche Microfluidic plateforme d’imagerie
    Contactez-nous
    Recommander à la bibliothèque

    Confidentialité

    Conditions d'utilisation

    Politiques

    Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Tous droits réservés.