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Article de méthode

Un modèle de Culture cellulaire des artères de résistance

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DOI :

10.3791/55992

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8 septembre 2017

 ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular Physiology and Biophysics, University of Virginia School of Medicine, 2Robert M. Berne Cardiovascular Research Center, University of Virginia School of Medicine, 3Department of Hematology, St. Jude Children's Research Hospital, 4Research Histology Core, University of Virginia School of Medicine

Dans cet article

Résumé

Un modèle de culture cellulaire des artères de résistance est décrite, permettant la dissection de la signalisation des voies dans l’endothélium, muscle lisse, ou entre l’endothélium et de muscle lisse (la jonction de myoendothéliales). L’application sélective des agonistes ou isolement de protéine, la microscopie électronique ou immunofluorescence peut être utilisée à l’aide de ce modèle de culture cellulaire.

Résumé

La jonction myoendothéliales (MEJ), un microdomaine signalisation unique dans les artères de petit diamètre de résistance, montre la localisation des protéines spécifiques et des processus de signalisation qui peuvent contrôler le tonus vasculaire et la pression artérielle. Comme c’est une projection de la part de la cellule endothéliale ou de muscle lisse et en raison de sa petite taille (en moyenne, une superficie d’environ 1 µm2), le MEJ est difficile à étudier dans l’isolement. Cependant, nous avons développé un modèle de culture cellulaire appelé la culture mixte de cellules vasculaires (coup) qui permet in vitro la formation MEJ, polarisation des cellules endothéliales et la dissection de la signalisation des protéines et des processus dans la paroi vasculaire de la résistance artères. Le coup a une multitude d’applications et peut être adaptée aux différents types de cellules. Le modèle se compose de deux types de cellules cultivées sur des côtés opposés d’un filtre avec 0,4 µm pores dans lesquels l' in vitro MEJs peuvent former. Nous décrivons ici comment créer le coup via placage des cellules et l’isolement des endothélial, MEJ et fractions de muscle lisse, qui peuvent alors servir d’isolement de protéine ou de l’activité des essais. Le filtre avec des couches de cellule intacte peut être fixe, embarqué et sectionnés pour l’analyse par immunofluorescence. Ce qui est important, bon nombre des découvertes de ce modèle ont été confirmés à l’aide d’artères de résistance intact, soulignant son intérêt physiologique.

Introduction

Dans les artères de petit diamètre de résistance, une mince lame élastique interne (IEL) sépare endothélial (CE) et des cellules musculaires lisses (SMC). Les cellules peuvent du projet par le biais de trous dans cette matrice élastique et faire des connexions cytoplasmiques directes via gap junction canaux1,2. Cette structure unique est appelée la jonction myoendothéliales (MEJ). Le MEJ est un petit (environ 0,5 µm x 0,5 µm, selon le lit vasculaire), projection cellulaire composée principalement de cellules endothéliales mais peut-être provenir de muscle lisse ainsi3,4. Un certain nombre de chercheurs ont démontré l’immense complexité de la signalisation des réseaux qui se produisent de manière sélective au MEJ, rendant l’endroit particulièrement important pour faciliter bidirectionnel de signalisation entre l’endothélium et muscle lisse5 ,6,7,8,9,10.

Cependant, une dissection mécaniste des voies de signalisation au MEJ est difficile dans une artère intacte. Le MEJ étant une projection cellulaire, il n’est pas actuellement possible d’isoler un en vivo MEJ de la paroi vasculaire. Pour cette raison, le coup modèle1 a été développé. Ce qui est important, le coup réplique physiologiques morphologie endothéliale11 et polarisation de signalisation entre l’apicale et MEJ certaines parties de la cellule12. C’est ce modèle unique qui a facilité la découverte que l’hémoglobine alpha est dans la cellule endothéliale, polarisé pour le MEJ. Cette méthode diffère des cellules endothéliales traditionnellement cultivées qui n’expriment pas d’hémoglobine alpha13. Pour les chercheurs intéressés par l’endothélium microvasculaire, il peut être plus approprié d’utiliser des cellules endothéliales qui ont été cultivées dans le coup, surtout si l’intention est de disséquer les voies de signalisation qui se produisent dans les artères de résistance de petit diamètre.

À l’aide d’un insert en plastique robuste contenant un filtre avec des pores de petit diamètre (0,4 µm de diamètre) de types cellulaires distincts de co-culture deux empêche les cellules de migration entre les couches. Elle se traduit par une distance de 10 µm entre les cellules, qui est beaucoup plus longues que in vivo, mais toujours reproduit beaucoup de caractéristiques en vivo du MEJs, y compris la localisation des protéines et second messager signalisation1 , 14. en outre, le coup permet de cibler des cellules spécifiques au type de signalisation via l’addition d’un agoniste ou antagoniste au compartiment cellulaire spécifique. Par exemple, chargement de la Communauté européenne avec BAPTA-AM pour chélater le calcium et stimulant la SMC avec la phényléphrine,14. Contrairement à d’autres descriptions de co-culture modèles15,16,17,18,19,20,21, cela donne instructions pour isoler les fractions distinctes d’ARNm et de protéines, y compris la fraction MEJ distincte dans les pores du filtre. L’ajout de cette technique pour le coup permet une enquête spécifique des changements dans la localisation de l’ARNm ou transcription22, phosphorylation de protéines12,23et protéine activité12. Cet article va décrire plaquage d’EC sur le dessus du filtre et le SMC sur le fond, bien qu’il soit possible à la culture des deux types de cellules différentes conformations11,18,24.

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Protocole

1. cellules de placage pour le coup

  1. Culture grand 225 cm 2 fioles jaugées de EC et SMC dans des conditions stériles à 37 ° C, jusqu’au confluent de 70 à 90 %. Veiller à ce que ce plus que SMC sont utilisés ; Si vous utilisez ce humain primaire et la SMC, généralement 3 flacons grands d’EC à 1 grande fiole de SMC.
    1. Utiliser de cellules primaires à passages inférieurs et ne pas utiliser après passage 10. Choisir les milieux de culture basé sur des cellules d’être conjointement mis en culture. Pour l’artère coronaire humaine primaire ce, utiliser EBM-2 ce média basale avec facteurs de croissance EGM2 MV. Pour primaire humain SMC coronaire, utiliser SmBM SMC média basale avec SmGM-2 facteurs de croissance. Avant son utilisation avec des cellules cultivées, ajouter des facteurs de croissance aux médias.
  2. Construction du coup jour 1 : pulvérisez Pétri de grande taille (150 mm) et couvercles avec un désinfectant (par exemple, Cavicide) et essuyer avec une serviette en papier ou des chiffons non pelucheux. Puis pulvériser les boîtes de Pétri avec 70 % d’éthanol (EtOH) et placez-les dans la hotte à l’air sec.
  3. Ouvrir la plaque d’inserts de filtre (voir la Table des matières) dans des conditions stériles et enduisez le SMC (côté bas du filtre) de l’insert avec la solution de la fibronectine. Maintenant l’insert dans la plaque de 6 puits fournie, pipette de la solution de la fibronectine dans le côté fentes vers le bas de la plaque, en vous assurant que le fond la moitié du filtre est couvert (pas plus de 1 mL).
  4. Après 30 min de traitement avec la fibronectine solution à température ambiante dans la hotte de la culture cellulaire, prendre des insertions hors de la plaque, vide tout excédent de solution et inverti, placer dans le fond la moitié de la propre boîte de Pétri. Mettre de côté. Veillez à ne pas déranger le filtre insert membrane quand aspirer l’excédent de solution ; Cela peut être évité en doucement inclinant la plaque et aspirer la solution au bord de l’insert.
  5. Trypsinize un 225 cm 2 flacon de SMC avec 3 mL de préchauffé 2 X la trypsine-EDTA solution, et une fois que les cellules ont décollé de la plaque, ajouter 9 mL de milieu de SMC pour neutraliser la trypsine (3:1, multimédia : la trypsine). Transvaser dans un tube à fond conique, bien mélanger et ajouter 10 µL sur un hémocytomètre pour déterminer le nombre de cellules.
    1. Compter le nombre de cellules dans le 5 x 5 cases (c.-à-d., 18), multiplier ce chiffre par 10 000 pour obtenir le nombre de cellules dans 1 mL (180 000). Puis multipliez par 12 mL (volume total de suspension cellulaire, SMC 2,16 millions). Veiller à ce qu’il y a assez SMC pour le nombre désiré de puits de la plaque.
      NOTE : par exemple, 1 devrait bien avoir SMC 75 000 et 18 puits auraient donc SMC total 1,35 millions. Diviser des cellules 1,35 millions nécessaires par 180 000 cellules / mL 1 et cela se traduit par 7,5 mL de la suspension cellulaire qu’il faudra pour l’électrodéposition. Calculez le volume final nécessaire (18 puits x 750 µL = 13,5 mL). Ainsi, prendre 7,5 mL de suspension cellulaire, porter le volume à 13,5 mL avec préchauffé SMC media et bien mélanger.
  6. Plaque 750 µL de la suspension cellulaire contenant environ 75 000 SMC sur le côté inférieur de chaque filtre, en veillant à ne pas répandre de la solution de médias et de la cellule. Placez le couvercle sur le dessus et transvaser avec soin la boîte de Pétri avec les inserts dans l’incubateur à 37 ° C pendant la nuit.
    Remarque : La densité cellulaire optimal pour les autres types de cellules devra être déterminée empiriquement.
  7. Au jour 2, remplir propre paraboloïdes 6 avec 2 mL de médias SMC fraîches, préchauffés. Enlever les plaques de l’incubateur. Prendre les inserts sur un à la fois retirer la source par aspiration, puis placer dans le plat de 6 puits avec média SMC.
  8. Manteau du côté opposé du filtre (côté EC) avec 1 mL d’une solution de gélatine bovine de 0,5 % pendant au moins 30 min à 37 ° C.
  9. Trypsinize la Deutsch 2 de 225 cm de EC avec 3 mL de préchauffé 2 X la trypsine-EDTA (10 x dilué dans Dulbecco stérile ' s PBS) solution, avec taraudage douce du ballon afin de soulever les cellules de la plaque de.
    Remarque : Il peut être nécessaire de placer le ballon dans l’incubateur à 37 ° C pendant 1 à 3 min.
    1. Une fois les cellules ont décollé de la plaque, ajouter des éléments multimédias EC 9 mL pour neutraliser la trypsine (3:1). Transférer dans un tube conique, piscine ensemble, bien mélanger et ajouter 10 µL sur un hémocytomètre pour déterminer le nombre de cellules.
      1. Compter le nombre de cellules dans le 5 x 5 cases (c.-à-d., 60), multiplier ce chiffre par 10 000 pour obtenir le nombre de cellules dans 1 mL (600 000). Puis multipliez par 12 mL (volume total de suspension cellulaire, EC 7,2 millions). Veiller à ce qu’il y a assez EC pour le nombre désiré de puits de la plaque.
        NOTE : Environ 360 000 ce sont tenus par puits. Par exemple, 18 puits nécessitent 6,48 millions EC. Diviser des cellules 6,48 millions nécessaires par EC 600 000 par 1 mL et cela se traduit par 10,8 mL de la suspension cellulaire qu’il faudra pour l’électrodéposition. Calculez le volume final nécessaire (18 puits x 1 mL = 18 mL). Ainsi, prendre 10,8 mL de suspension cellulaire, porter le volume à 18 mL avec préchauffée médias EC et doucement resuspendre.
  10. Plaque de 1 mL de 360 000 EC sur le dessus de chaque filtre d’insertion. Laisser les cellules incuber sans agitation à 37 ° C pour les moyennes de remplacer 24 h. sur 4 jours. Récolte le jour 5.

2. Récolte des Fractions de la coup

  1. effectuer l’isolement dans une pièce de 4 ° C et maintenir tous les instruments sur la glace.
  2. N’oubliez pas le nombre d’insertions individuels étant isolé et ajouter le tampon de lyse dans un tube de 50 mL étiqueté MEJ (pour les filtres isolés). Puis identifiez les deux boîtes de 10 mm ; un pour ce et un pour SMC.
  3. Régler le volume de tampon de lyse selon comment concentré le lysat doit être ; 15 s’insère, 500 µL de tampon de lyse pour le tube MEJ et 250 µL par boîte de Pétri sont recommandés.
  4. Travail avec une plaque 6 puits de plaquettes à la fois. D’aspiration hors du milieu dans le capot de la culture de cellules, puis transport vers une chambre froide sur glace.
    Remarque : Les informations suivantes sont destinées 1 Insérez isolement.
  5. Pipette 10 µL de PBS 1 x sur le côté SMC de l’insert.
  6. Utilisez le panier de la cellule à racler les cellules à une extrémité de l’insert et de transférer les cellules de l’haltérophile à la SMC Pétri qui a tampon de lyse dans it.
  7. Une fois que le releveur de cellule a touché le tampon de lyse dans le plat, ne lui permettent pas de toucher le filtre insertion jusqu'à ce qu’il a été complètement nettoyé et séché sur du papier absorbant. Répéter le raclage du filtre SMC au moins une à deux fois pour éliminer complètement les débris restants de cellule SMC.
  8. Tourner l’insert au-dessus et ajouter 10 µL de PBS 1 x dans le côté supérieur/EC du filtre insert. Répétez les étapes 2.6 et 2.7 avec un grattoir de cellules et la boîte de Pétri ce.
  9. Recueillir les cellules restantes et le lisier de PBS du côté EC du filtre avec une pipette et transfert à l’EC Pétri avec du tampon de lyse. Être très complet en grattant les cellules sur les deux côtés du filtre à laisser une contamination EC/SMC minimale dans la fraction MEJ.
  10. Utilisez soigneusement le scalpel pour découper le filtre de l’insert en plastique. Pour ce faire coupe 70-80 % de celui-ci loin de la matière plastique et utiliser des pinces pour tirer le filtre complètement hors de la structure de l’insert en plastique. Mettre le filtre dans le tube à fond conique 50 mL étiqueté MEJ avec tampon de lyse et s’assurer qu’il se trouve dans le tampon de lyse et qu’il reste humide.
  11. Répéter les étapes de l’isolement, en groupes de 6, jusqu'à ce que toutes les insertions ont été traitées.
  12. Veiller à ce que différents groupes sont conservés dans des tubes distincts et plats.
  13. Vortex le tube conique de 50 mL MEJ sur pleine puissance pendant 15 s ou jusqu'à ce que bien mélangés. Retirer les filtres le MEJ conique avec une pince, en les faisant glisser le long des murs latéraux du tube pour laisser le maximum de protéines et de liquide dans le tube. Après ce point, jetez les filtres.
  14. Après ont enlevé tous les filtres du tube conique à MEJ, faire un essorage rapide (10-15 s à vitesse max ~ 16 000 x g) dans une centrifugeuse pour retirer tous les liquides et les protéines vers le bas du tube. Transvaser le contenu du tube MEJ et les plats de ce et SMC Petri dans des tubes à centrifuger distinct, plus petite.
  15. En option : laisser agir le contenu des tubes MEJ/SMC/EC en définissant 4 impulsions trois 10 s sur la glace ou homogénéiser doucement à la main.
  16. Centrifuger à vitesse maximum (~ 16 000 x g) 15 min à 4 ° C. Pipet sortir le surnageant et doser le lysat pour la teneur en protéines à l’aide de la méthode de dosage bicinchoninic.

3. Le coup de la récolte pour l’Immunofluorescence En Face

  1. incubation sur jour 5 du coup, sortir les insertions de l’incubateur. Travaillant dans la hotte de la culture cellulaire, suceuses hors médias SMC de chaque puits inférieurs du filtre de l’insert et rincer deux fois avec du PBS 1 x. Répéter avec le côté EC.
  2. Garder les inserts intact et dans l’assiette, ajouter 4 % de paraformaldéhyde (PFA) pour 10-20 min dans une pièce de walk-in 4 ° C dans un agitateur doux. Lavez les deux côtés du filtre avec du PBS 1 x insert pour 5 min et répétez deux fois.
    ATTENTION : PFA est toxique et doit être manipulé avec soin.
  3. Effectuer les incubations d’anticorps bloquants, primaire et secondaire dans le plat, en veillant à ce que les deux côtés du filtre sont conservés dans l’anticorps + solution de blocage (9 mL de PBS, 25 µL Triton X100, albumine de sérum bovin 50 mg, 500 µL de sérum normal)
  4. Pour monter le filtre sur une lame, coupée le filtre de l’insert en plastique avec un scalpel, monté sur une poignée et le déposer sur une lame de microscope avec milieu de montage.

4. Le coup de la récolte pour l’Immunofluorescence transversal

  1. incubation sur jour 5 du coup, sortir les insertions de l’incubateur. Suceuse hors des médias des deux côtés du filtre à insérer dans la hotte de culture cellulaire et rincer chaque côté du filtre deux fois avec du PBS 1 x.
  2. Garder les inserts intact et dans la plaque 6 puits, ajoutez 4 % PFA et incuber pendant la nuit dans une chambre de walk-in 4 ° C dans un agitateur doux.
    ATTENTION : PFA est toxique et doit être manipulé avec soin.

5. Incorporation du coup pour l’Immunofluorescence transversal

  1. après filtre insertions ont été corrigées environ pendant 24 h en 4 % PFA, transfert à 70 % EtOH pendant au moins 24 h, mais jusqu'à plusieurs semaines.
  2. Traiter les filtres sur un long terme (la nuit) sur un processeur de tissus automatisés. Utiliser le programme comme suit : 70 % 30 min de paraffine EtOH pour 30 min, 85 % EtOH 30 min, 95 % EtOH 30 min, 100 % EtOH 30 min, 100 % EtOH 45 min, 100 % EtOH 45 min, xylène 30 min, xylène 30 min, xylène 45 min, 60 ° C, 60 ° C 30 min de paraffine , 45 min. de paraffine 60 ° C
  3. Après le traitement, transférer les filtres récoltés à la station encastrement dans la paraffine liquide, garder le filtre dans la cassette.
  4. Supprimer le filtre de la cassette, soigneusement à l’aide de pinces pour tenir juste au bord. Avec des ciseaux, coupez le filtre en deux, formant deux demi-cercle en forme de moitiés. Poser chaque des 2 moitiés sur la partie-plaque froide de la station encastrement juste longtemps assez pour remplir le plongement de moule avec de la paraffine liquide.
  5. Une fois rempli avec de la paraffine liquide, touchez le moule incorporation à la plaque froide très brièvement, puis incorporer chaque moitié du filtre en enrobage moule (côté coupé vers le bas), ce qui assure que pendant la découpe, on va couper depuis le centre du filtre vers le bord .
  6. Au cours de l’incorporation, utiliser les pinces pour maintenir le filtre en place pour empêcher les moitiés de tomber dans l’autre jusqu'à ce que la paraffine est assez cool pour eux se tenir seul. Passer le moule incorporation à une plaque froide jusqu'à ce que complètement solidifié.
    NOTE : Blocs sur des plateaux de glace de refroidissement contribue à prévenir les sections ridées.

6. Coupes et coloration du coup pour l’Immunofluorescence transversal

  1. pour les blocs de paraffine sectionnement et faites glisser le montage : 5 µm coupes, placer les sections dans un bain d’eau de 42 ° C et ramasser les sections à l’aide de chargés positivement diapositives. Puis garder diapositives durant la nuit dans un four à sécher à 42 ° C.
  2. Avant de commencer les étapes de la réhydratation, faire cuire les diapositives à 60 ° C pour faire fondre de la paraffine et aider à respecter les sections de coup à la diapositive. Cool brièvement, puis se réhydrater les diapositives grâce à deux changements de xylène, 100 % EtOH, 95 % EtOH, un changement dans les 70 % EtOH et deux changements d’eau distillée.
  3. Éviter les méthodes de récupération de l’antigène qui impliquent de micro-ondes ou de chauffage que les sections peuvent tomber hors de la diapositive.
  4. Effectuer le blocage standard pendant 1 h à température ambiante, puis la nuit d’incubation avec l’anticorps primaire à 4 ° C, suivie d’un lavage des étapes et des anticorps secondaire pendant 1 h à température ambiante. Monter avec les supports de montage et de la lamelle couvre-objet.

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Résultats

Les inserts de filtre utilisés pour le coup ont petit, 0,4 µm trous. Figure 1 a, une vue de face de fr de l’encart filtre de coup, montre les pores dans lesquels le MEJ peut se former en vitro. Le schéma représente les cellules musculaires lisses plaqués sur le côté inférieur du filtre, un jour avant que les cellules endothéliales sont plaqués sur le côté opposé (Figure 1 b). Une fois que les cellules sont plaqu...

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Discussion

Le coup a un certain nombre d’avantages en termes de récapitulant MEJs in vitro, mais il existe des points de discussion pour déterminer si le coup peut être utilisé pour des applications spécifiques. Par exemple, si les différents types de cellules doivent être utilisées avec ce modèle, il devra être optimisé. Nous avons utilisé des cellules humaines primaires, mais il est possible d’isoler des cellules d’aortes bovine24ou souris de type sauvage ou coup de grâce et utilisez-les dans le c...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par le National Heart, Lung and Blood Institute accorde 14PRE20420024 bourse prédoctorale R01088554, T32HL007284 et American Heart Association. Nous remercions particulièrement le St. Jude Cellular Imaging partagé recherche Core, y compris Randall Wakefield et Linda Horner pour les images de microscopie électronique, Adam Straub d’assistance avec des images représentatives par immunofluorescence et Pooneh Bagher pour elle précieux commentaires sur le protocole de manuscrit.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
24 mm de diamètre, 0,4 & micro ; m Transwell Insert filtrant à membrane polyesterCorning3450Il s’agit d’une plaque à 6 puits d’inserts
Fiole de 225 cmCorning431082
plaques à 6 puits (sans inserts filtrants)Corning3506
Cellules endothéliales primaires de l’artère coronaire humaineLonzaCC-2585
Cellules musculaires lisses de l’artère coronaire humaine primaireLonzaCC-2583
EBM-2 EC Milieux de baseLonzaCC-3156
Facteurs de croissance EC (EGM2 MV Simples quotes)LonzaCC-4147Ajouter au milieu de base avant utilisation
SmBM SMC Milieux deLonzaCC-3181
Facteurs de croissance SMC (SmGM-2 SingleQuot)LonzaCC-4149Ajouter au milieu de base avant utilisation
0,5 % Trypsine-EDTA 10XGibco15400-054Diluer à 2X avec un hémocytomètre dPBS stérile
VWR15170-208
grandes boîtes de Pétri pour placage SMC (150mm)Corning353025
Gélatine bovineSigmaG-9382
Fibronectine humaineCorning3560085µ ; g/ml de fibronectine et conserver à -20
10x solution saline tamponnée de Hanks (HBSS)Gibco14065-056Diluer à 1x avec de l’eau stérile
10x solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco (dPBS)Gibco14200-075Diluer à 1x avec de l’eau stérile
Scalpel incurvé jetable (tranchant de 30 mm) avec poignéeAmazonMDS15210
ForcepsFisher17-467-201
Corning3008Grattoir
cellulaireBD Falcon353085
50 mL tube coniqueCorning352070
Boîtes de Pétri 10 mmFalcon35-1008
Rneasy mini kitQiagen74104
Réactif de lyse de l’ARNQiagen79306
ParaformaldéhydeSigma158127Solution à 4 % avec dPBS
70 % d’éthanolFisher04-355-305
Désinfectant pour cavicideFisher131000
Tampon de lyse des protéines RIPASigmaR0278
Démembreur soniqueFisherModel 50
1x PBS pour la récolte EC/SMC et immunocytochimieGibco10010023n’a pas besoin d’être stérile
NomCompanyNuméro de catalogueComments
Embedding/Sectioning/Coloration
ParaffineFisherP31-500
Processeur automatisé de tissusExcelsiorES
Station d’enrobage + plaque froideLeicaHistoCore Arcadia
Tissue Tek Accu-Edge Lame de microtomeVWR25608-961 ou 25608-964
Lames de microscopeThermo Fisher22-230-900
Lamelles ThermoFisher12-548-5E
Support de montage ThermoFisherP36931
NomEntrepriseNuméro de catalogueComments
Autres solutions**Effectuez toutes les étapes dans des conditions stériles si vous utilisez la solution sur des cellules vivantes
Eau stérile dPBSAutoclave à stériliser. À l’aide de l’eau stérile, préparez le DPBS (450 ml d’eau stérile : 50 ml 10X DPBS), mélangez et filtrez pour stériliser (0,2 et micro ; m filtre).
Concentration finale : 1X
stérile HBSSAutoclave à stériliser. À l’aide de l’eau stérile, préparez HBSS (450 ml d’eau stérile : 50 ml 10X HBSS), mélangez et filtrez pour stériliser (0,2 et micro ; m filtre).
Concentration finale : 1X
mère de fibronectineUtilisez 50 ml d’eau stérile pour former un stock de 1 ml d’aliquotes, puis congelez jusqu’à ce que vous en ayez besoin
Concentration finale : 100µ ; g/mL
de fibronectine pour enrober le côté CMS du VCCC,décongeler une aliquote et ajouter 1 ml de fibronectine (100µ ; g/mL) à 19 mL de 1X HBSS pour atteindre une concentration finale de 5µ ; g/mL.
Concentration finale : 5µ ; g/mL
2x solutiontrypsine EDTA Diluez 10X 0,5 % Trypsine-EDTA à 2X avec 1X dPBS (40mL DPBS : 10mL 10X Trypsine) .
Concentration finale : 2X
Solution de blocage/anticorps(9mL 1X PBS, 25mL Triton X100, 50mg d’albumine sérique bovine, 500mL sérum normal)
Gélatine bovine pour enrober EC VCCCMélangez 0,5 g de gélatine bovine dans 100 ml d’eau distillée. Autoclave avant la première utilisation et conservation à température ambiante. Conserver dans des conditions stériles.
Concentration finale : 0,50
%1x PBS pour la récolte des cellulesn’a pas besoin d’être stérile
base Élévateur de cellules eausolution de

Références

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