Préparation de l’échantillon d’Identification basé sur la spectrométrie de masse des régions de liaison à l’ARN

Résumé

Les auteurs décrivent un protocole pour identifier des protéines de liaison à l’ARN et de cartographier leurs régions de liaison à l’ARN dans des cellules vivantes psoralen médiée par les UV et spectrométrie de masse.

Résumé

ARN non codants joue des rôles importants dans plusieurs processus nucléaires, y compris la régulation de l’expression des gènes, structure de la chromatine et la réparation de l’ADN. Dans la plupart des cas, l’action d’ARN non codants est médiée par des protéines dont les fonctions sont à leur tour régies par ces interactions avec les ARN non codants. Conformément à cela, un nombre croissant de protéines impliquées dans des fonctions nucléaires ont été signalé à lier RNA et dans certains cas les régions de liaison à l’ARN de ces protéines ont été cartographiées, souvent par le biais de méthodes laborieux, axée sur le candidat.

Nous rapportons ici un protocole détaillé pour effectuer une identification non biaisée haut-débit, à l’échelle du protéome de leurs régions de liaison à l’ARN et de protéines de liaison à l’ARN. La méthodologie s’appuie sur l’incorporation d’un uridine photoréactive analogique à l’ARN cellulaire, suivi par réticulation UV induite par la protéine-ARN et spectrométrie de masse pour révéler des peptides de RNA-réticulé au sein du protéome. Bien que nous décrivons la procédure pour les cellules souches embryonnaires de souris, le protocole devrait être facilement adapté à une variété de cellules cultivées.

Introduction

La méthode RBR-ID vise à identifier de nouvelles protéines de liaison à l’ARN (pratiques commerciales restrictives) et de cartographier leurs régions de liaison à l’ARN (IPR) avec une résolution de peptide-niveau pour faciliter la conception des mutants de la liaison à l’ARN et l’enquête de la biologique et biochimique fonctions des interactions de protéine-ARN.

L’ARN est unique parmi les biomolécules car il peut agir comme un messager porteur d’informations génétiques et aussi incorporer des structures tridimensionnelles complexes avec des fonctions biochimiques plus semblables à celles des protéines^1,

Protocole

1. culture et Expansion de mESCs

Remarque : cellules souches embryonnaires de souris sont faciles de culture et peut être rapidement étendus à un grand nombre requis par des expériences biochimiques grâce à leur durée de cycle rapide. MESCs sains doubler chaque 12 h.

1. MESCs Expand jusqu'à la valeur souhaitée sur plaques gélatinisés dans mESC moyen (voir ci-dessous) dans un incubateur de culture de tissus maintenus à 37 ° C, 5 % de CO ₂, et > 95 % d’humidité.
   Remarque : Assez plaques doivent être préparées pour 3 à 5 répétitions biologiques pour le + échantillon 4SU et contrôle - 4SU. Une plaque de 10 cm (

Résultats

La figure 1 illustre le flux de travail IPR-ID. En raison de l’efficacité de la réticulation relativement faible de cette technique, il est très important de tenir compte tant le niveau de déplétion et la cohérence de l’effet observé (P -value) à travers des réplicats biologiques. La figure 2 montre une parcelle de volcan de résultat RBR-ID. Peptides qui chevauchaient domaine de motif (MRR) de reconnaissance RNA afficher.......

Discussion

Nous décrivons un plan expérimental détaillé pour effectuer RBR-ID dans mESCs et, avec les modifications appropriées, dans n’importe quelle cellule qui peut incorporer 4SU dans l’ARN. Autres types de cellules peuvent exiger l’optimisation de l’approche pour assurer un signal / bruit suffisant. En outre, alors que le protocole décrit ci-après met l’accent sur l’examen des pratiques commerciales restrictives nucléaires, la technologie de RBR-ID devrait être facilement adaptables aux différents compartiments cellulaires, te.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
KnockOut DMEM	Fisher Scientific	10829018
sérum fœtal bovin, qualifié, origine américaine	Fisher Scientific	26140079
solution de L-glutamine 200 mM	Sigma	G7513
Solution de pénicilline-streptomycine	Sigma	P0781
MEM Solution d’acides aminés non essentiels (100× ;)	Sigma	M7145
2-Mercaptoéthanol	Sigma	M3148
ESGRO Facteur inhibiteur de la leucémie (LIF)	EMD Millipore	ESG1106
CHIR99021	Tocris	4423
PD0325901	Sigma	PZ0162
Solution de gélatine, 2 % dans l’eau	Sigma	G1393
4-thiouridine	Sigma	T4509	50 mM stock dans l’eau
Spectrolinker XL-1500	Fisher Scientific	11-992-90
Fluorure de phénylméthanesulfonyle	Sigma	78830
IGEPAL CO-630	Sigma	542334	Forme commerciale du détergent octyl-phénoxy-polyéthoxy-éthanol
Iodoacétamide	Sigma	I6125
Trypsine, grade de séquençage	Promega	V5111
Empore disque d’extraction en phase solide	3M	66883
OLIGO R3 Inversé - Phase Résine	Fisher Scientific	1133903
Benzonase	Sigma	E8263	Nucléase de haute pureté
Sonic Dismembrator Modèle 100	Fisher Scientific	discontinué mis	à jour avec FB505110
Acétonitrile de qualité HPLC	Fisher Chemical	A955-4
Eau de qualité HPLC	Fisher Scientific	W6 4
TFA	Fisher Scientific	A11650
Bicarbonate d’ammonium	Sigma	A6141
Acide acétique	Sigma	49199
Acide formique	Sigma	F0507
ReproSil-Pur 18-AQ	Dr. Maisch GmbH HPLC	r13.aq.0003	Matériau d’emballage pour colonne HPLC
Capillaire pour nano-colonnes (75 µ ; m)	Molex	1068150017
Logiciel MaxQuant	Institut Max Planck de biochimie		Peut effectuer l’alignement chromatographique de plusieurs cycles MS