Isolement des cellules endothéliales progénitrices du sang de cordon ombilical humain

Résumé

Ce protocole vise à isoler les cellules endothéliales progénitrices du sang de cordon ombilical. Parmi les applications incluent l’utilisation de ces cellules comme biomarqueur pour identifier les patients à risque cardiovasculaire, traitement des maladies ischémiques, et constructions de création valve tissulaire cardiaque et vasculaire.

Résumé

L’existence de cellules endothéliales progénitrices (EPCs) dans le sang périphérique et son implication dans la vasculogénèse a été signalée par Ashara et ses collègues¹. Plus tard, d’autres documenté l’existence de types similaires de EPCs provenant de la moelle osseuse^2,3. Plus récemment, Yoder et Ingram a révélé que EPCs provenant du sang de cordon ombilical avaient un potentiel prolifératif plus élevé par rapport à ceux isolés d’adulte périphérique de sang^4,5,6. En dehors de n’être impliqué en postnatal vasculogénèse, EPCs ont également montré des promesse comme une source de cellules pour créer tissulaire cardiaque et vasculaire vanne constructions^7,8. Il existe différents protocoles d’isolement, dont certaines impliquent le tri cellulaire des cellules mononucléaires (PTM) dérivés les sources mentionnées plus tôt avec l’aide de marqueurs endothéliales et hématopoïétiques, ou cultivant ces multinationales avec la croissance endothéliale spécialisée moyenne, ou une combinaison de ces techniques⁹. Ici, nous présentons un protocole pour l’isolement et culture des CPE à l’aide spécialisée endothélial additionné de facteurs de croissance, sans utiliser d’immunosorting, suivie de la caractérisation des cellules isolées à l’aide de Western Blot et immunomarquage.

Introduction

Plusieurs chercheurs ont étudié les caractéristiques et le potentiel humain EPCs^{5,10,11,12,13}. CPE peut être qualifiée de circuler les cellules qui ont la capacité d’adhérer aux tissus endothéliales dans les sites d’hypoxie, ischémie, des blessures ou la formation de tumeurs et contribuent à la formation de nouvelles structures vasculaires^4,14. Leur implication observée dans la néovascularisation, sous forme de vasculogénèse postnatal, a conduit à la compréhension de la physiopathologie de ces cellules et leur utilisation dans des applications thérapeutiques^{4,15, 16}. le nombre de CPE chez un individu s’est avéré être en corrélation avec la pathologie cardiovasculaire^{9,15,16,17,18,19 ,},²⁰. D’autres études ont également différenciées EPCs dans un phénotype de fibroblastes-comme soupape et proposé que ces cellules pourraient être utilisées pour l’ingénierie tissulaire cardiaque vannes^7,21.

Les molécules de surface de cellule particulière nécessaires pour isoler les EPCs n’ont pas été clairement identifiés en raison de divergences entre les enquêtes⁴. L’adhérence des multinationales à une certaine matrice, avec une exposition à une variété de conditions de culture, a été interprétée par plusieurs groupes^1,17,22,23, suggérant que putatifs EPCs peuvent afficher les différentes propriétés phénotypiques. Ces propriétés incluent un manque de capacité de phagocytose, la formation du tube en Matrigel et la captation des lipoprotéines de basse densité Dil-acétylé. La haute clonogéniques et potentiel prolifératif sont deux propriétés avec laquelle EPCs peuvent être hiérarchisés⁵. CPE peut également former des tubules in vitro lorsque co-cultivées avec des poumons foetaux humains fibroblastes⁴. Ces cellules sont connues pour exprimer des marqueurs de surface des cellules endothéliales et de partager certaines des marqueurs hématopoïétiques^13,24,25. Les marqueurs positivement exprimées largement acceptées pour le phénotypage EPCs sont CD31, CD34, récepteur de facteur de croissance endothélial vasculaire 2 (VEGFR2), von Willebrand (vWF) de facteur, CD133, c-Kit et vasculaires endothéliales cadhérine (VE-cadhérine)^{4 , 18}. cellules qui expriment conjointement CD90, CD45, CD14, CD115 ou actine muscle lisse-alpha (α-SMA) ne sont pas considérés comme être EPCs en raison de leur capacité potentielle, proliférative limitée à phagocyter les bactéries et incapacité de former de novo humaine navires en vivo^4,7. Cet article décrit un protocole modifié pour l’isolement des cellules endothéliales progénitrices du sang de cordon ombilical humain sans besoin de n’importe quelle cellule protocoles de tri. Pour cet article, nous avons utilisé le CD31, CD34 et VEGFR2 comme les marqueurs positifs, avec α-SMA comme indicateur négatif.

Dans cet article, nous proposons une méthode d’isoler et de cultiver des cellules endothéliales progénitrices du sang de cordon ombilical sans cellule tri à l’aide spécialisée de milieu de croissance endothéliale additionné de facteurs de croissance (EGM). Cette EGM contient le facteur de croissance endothélial vasculaire (VEGF) et le facteur de croissance fibroblastique (FGF), qui améliorent la survie, la prolifération et la migration des cellules endothéliales²⁶. Il comprend également l’acide ascorbique, qui est responsable du maintien de la morphologie de pavées des cellules ; insuline-comme le facteur de croissance-1 (IGF-1), qui fournit angiogénique et fonction migrateur ; et l’héparine, ce qui provoque la meilleure stabilité à long terme des facteurs de croissance en moyenne²⁶. Autres facteurs de croissance, ajoutés le milieu de culture de cellules endothéliales comprend une supplémentation en facteur de croissance épidermique (EGF), qui aide à stimuler la prolifération cellulaire et la différenciation et hydrocortisone, qui sensibilise les cellules à EGF²⁶ . Nous montrons que l’utilisation de ce support de croissance spécifique conduit à un nombre plus élevé de l’EPCs par rapport à la moyenne basale endothéliale (EBM) ou moyen d’Eagle modifié (DMEM de Dulbecco).

Protocole

cette recherche a été menée avec l’approbation de l’Université de l’Arkansas, Institutional Review Board (numéro d’agrément 16-04-722). Unités de sang de cordon ombilical ont recueilli dans une solution de dextrose (CPD) citrate phosphate à l’Arkansas Cord Blood Bank, et les unités qui ne respectent pas l’obligation de stockage ont été données pour la recherche. Unités de sang de cordon ont été envoyées au laboratoire au sein de la collection à une température ambiante de 24 h.

1. isolement des progénitrices endothéliales de sang de cordon

1. préparation des réactifs.
   1. Préparer EGM en ajoutant le milieu basal endothélial (EBM) à 10 % sérum fœtal (SVF) additionné de 20 ng/mL de facteur de croissance analogue à l’insuline (IGF), 1 µg/mL d’acide ascorbique, 5 ng/mL recombinant facteur humain de croissance épidermique (rhEGF), 22,5 µg/mL héparine et 0,5 ng/mL endothéliales facteur de croissance vasculaire (VEGF), ainsi que de 10 ng/mL de recombinant humain facteur de croissance fibroblastique B (rhFGF-B), 0,2 µg/mL hydrocortisone et 2 % la pénicilline-streptomycine-glutamine. Stériliser le milieu de culture à l’aide d’un filtre à membrane vide 0,2 µm polyéthersulfone (PES).
   Rat
   2. Prepare queue j’ai une solution de collagène à une concentration de 50 µg/mL à l’aide de l’acide acétique 0,02 N. Stériliser cette solution à l’aide d’un filtre de seringue 0,2 µm.
   Plaques 6 puits
   3. pré-couche avec 2 mL de rat préparé j’ai tail solution de collagène pour chaque puits. Placez-les dans un incubateur maintenu à 5 % de CO ₂ et 37 ° C pendant au moins 1 h avant de semer.
   4. Diluer environ 25 mL de sang de cordon avec Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) à une concentration de 1:1.
   5. Prepare radio-immuno précipitation assay (RIPA) tampon à l’aide de chlorure de sodium 150 mM, 1 % X-100 Triton, désoxycholate de sodium 0,5 %, β-glycérophosphate de 1 mM, SDS 0,1 % et 50 mM Tris (pH 8,0).
2. Isolement de cellules endothéliales progénitrices.
   1. Tout chaud préparé réactifs dans un bain d’eau maintenu à 37 ° C avant l’isolement.
   2. Ajouter 20 mL de réactif moyen gradient de densité dans un tube à centrifuger 50 mL.
   3. Soigneusement la couche 20 mL de sang de cordon dilué dans le tube à centrifuger contenant le milieu de gradient de densité sans casser cette couche en visant la pipette vers les parois du tube.
   4. Séparer les composants du sang issu de leur densité ( Figure 1) par centrifugation à 800 g pendant 30 min à température ambiante, avec le frein du rotor centrifuge au large. Ne pas déranger les différentes couches.
   5. Enlever la couche de plasma par pipetage soigneusement il hors du tube sans déranger les autres cellules de la couche couches jusqu'à ce que la pointe de pipette est en mesure d’atteindre le RNM (voir Figure 1). Jeter le plasma enlevé.
      Remarque : Lors de l’utilisation de pointes de pipette pour retirer le plasma, laisser une petite couche de plasma au-dessus de la couche MNC ( Figure 1) pour réduire les turbulences.
   6. Recueillir la couche leuco-plaquettaire qui contient les multinationales à l’aide d’une seringue munie d’une aiguille de calibre 18 et le transférer dans un tube à centrifuger fraîche.
   7. Ajouter un volume égal d’EBM à la centrifugeuse EMNs. collectées ces tubes à 500 x g pendant 10 min à 4 ° C. jeter le surnageant.
      Remarque : Le culot cellulaire apparaissent en rouge à cause de la présence de globules rouges/érythrocytes.
   8. Ajouter 5 mL de solution de chlorure d’ammonium à lyser les globules rouges. Incuber à ce tube sur la glace pendant 5-10 min, avec agitation occasionnels.
      NOTE : Attention doit être prise pendant cette étape à ne pas dépasser la durée de temps, car il peut être nocif pour les multinationales.
   9. Centrifuger les tubes à 500 x g pendant 10 min à 4 ° C et éliminer le surnageant. Si les érythrocytes persistent, répéter les étapes 1.2.8 et 1.2.9 jusqu'à ce qu’aucune couleur rouge n’est observée dans le culot.
   10. Resuspendre le culot dans EGM préparé et utilisez l’hémocytomètre pour compter les PTM.
   11. Aspirer le rat j’ai tail collagène recouvert de plaque 6 puits (de l’étape 1.1.3) et laver les puits trois fois avec 1 x solution saline tamponnée au phosphate (PBS).
   12. Graines le culot de RNM resuspendu dans EGM à la plaque de collagène à une concentration de 1 x 10 ⁷ multinationales dans chaque puits. Placez-le dans le 37 ° C, 5 % CO ₂ incubateur.
   13. Après 24 h, aspirer le milieu et laver les puits une fois avec EGM. Ajouter 3 mL de milieu EGM dans chaque puits et placez-le dans le 37 ° C, 5 % CO ₂ incubateur.
   14. Reconstituer la plaque avec un milieu EGM frais tous les jours pendant 7 jours. Après 7 jours, changer le milieu EGM alternats.
   15. à l’aide d’un microscope en champ clair, prendre des images de la plaque 6 puits tous les jours pour suivre la progression des colonies de cellules endothéliales. Marquer la plaque lorsque les colonies se présentent pour garder une trace de leur croissance.
       Remarque : Il faut généralement entre 5 et 9 jours pour les colonies apparaissent dans la culture.
3. Expansion des cellules endothéliales progénitrices.
   1. Manteau le flacon de culture T-25 avec rat queue j’ai collagène (50 µg/mL) et placez-le dans le 37 ° C, 5 % CO ₂ incubateur au moins 60 min. aspirer et laver le flacon de culture cellulaire T-25 trois fois avec du PBS 1 x avant le semis des cellules.
   2. Trypsinize des colonies de cellules endothéliales lorsqu’ils atteignent environ 3 mm de taille à l’aide de 150 µL de solution de trypsine-EDTA 0,05 % dans chaque puits. Replacez la plaque 6 puits dans les 37 ° C, 5 % CO ₂ incubateur pour 2-3 min.
   3. Tapoter légèrement la plaque 6 puits pour déloger les cellules attachées. Immédiatement ajouter 2 mL d’EGM et récupérer les cellules dans un tube à centrifuger 15 mL.
   4. Compter les cellules à l’aide d’un hémocytomètre et calculer la densité de semis initiale.
   5. Spin la centrifugeuse 15 mL tubes à 400 g pendant 5 min. Resuspendre le culot dans EGM et la fiole T-25 ~ 500 000 cellules des graines. Marquer cette fiole en tant que Passage 1 et placer le ballon de T-25 retour dans les 37 ° C, 5 % CO ₂ incubateur.
      Remarque : Les cellules peuvent être plaqués en EBM et DMEM pour comparer la croissance avec EGM.
   6. Pour plus amples passages, lorsque le ballon atteint 90 % confluence, suivez les étapes 1.3.1 - 1.3.5 et réensemencer les cellules à 10 ⁴ cellules/cm ² sur T-75 ou T-175 flacons de culture cellulaire. Procéder à la caractérisation des cellules isolées (étapes 2 et 3).

2. Caractérisation des cellules isolées à l’aide de Western Blotting

1. Ajouter 50-100 µL de lyse tampon à chaque passage en suivant les étapes de l’expansion pour caractériser les cellules isolées. Collecter les protéines d’environ 500 000 ou plusieurs cellules.
2. Pipette de haut en bas vigoureusement pour rompre les cellules et libérer les protéines. Recueillir et transmettre la mémoire tampon dans un tube de microcentrifuge.
3. Tourner le tube de microcentrifuge à 500 x g et transvaser avec soin le surnageant dans un nouveau tube de microcentrifuge. Étiqueter et stocker les tubes à-80 ° C pour le stockage à long terme.
4. Quantifier la quantité de protéines dans chaque tube en utilisant soit Bradford ' s ou BCA assay ^{27 , 28 , 29}.
5. Réaliser de Western Blot à l’aide de procédures standard ^{27 , 28 , 29}. Analyser 5 µg de protéines totales pour l’expression de CD31, CD34, VEGFR2 et α-SMA. Utiliser des α-tubuline pour normaliser les données.

3. Immunofluorescence indirecte

1. soniquer verre 18 mm lamelles dans 50 % d’éthanol et séchez-les. Laissez les lamelles couvre-objet propre dans la plaque de 12 puits du jour au lendemain dans la hotte de sécurité biologique avec un UV lumière pour stériliser les.
2. Enrober les lamelles couvre-objet avec 50 & #181 ; g/mL de rat j’ai tail collagène et la plaque de transfert à un 37 ° C, 5 % CO ₂ incubateur pour au moins 60 min.
3. Aspirer le collagène et ajouter 1 mL de PBS 1 x à la plaque de 12 puits pour laver les lamelles couvre-objet. Aspirer la solution de PBS 1 x et répéter deux fois.
4. Graine 250 000 cultivées EPCs dans chaque puits et les replacer dans les 37 ° C, 5 % CO ₂ incubateur pendant au moins 3 jours avant d’effectuer d’immunomarquage.
5. Laver la plaque 3 fois avec du PBS 1 x. Ajouter 1 mL de méthanol glacée à chaque puits et incuber à température ambiante pendant 15 min fixer les cellules.
6. Mener d’immunomarquage à l’aide d’un protocole standard ^{27 , 28 , 29}. Utiliser les anticorps à leurs dilutions appropriées (p. ex., CD31 (01:20), CD34 (01:50), α-SMA (1/100) et VEGFR2 (01:50)).
7. Prendre des images de l’immunomarquage lamelles couvre-objet à l’aide d’un microscope à épifluorescence.

Résultats

Isolement et l’Expansion des cellules progénitrices endothéliales :
Un schéma (Figure 1) est fourni en décrivant le protocole global. Les couches de composants sanguins différents ont été observés après centrifugation en gradient de densité du sang de cordon ombilical humain avec milieu de gradient de densité. Après ensemencement MNCs sur les plaques imprégnées sur le collagène, l’excroissance des colonies fut observée entre 5 jours et 7 (...

Discussion

Comme mentionné précédemment, adhérent EPCs possèdent une morphologie pavées. Nos multinationales isolés a progressé d’une colonie de cellules fusiformes (Figure 2A-2D) dans les premiers stades à une colonie de pavées (Figure 2E-2F) sur une période de dix jours de culture. CPE ont été étiquetés différemment par les différents groupes de recherche, à savoir comme fin de cellules progénitrices endothéliales¹⁰

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
A) Pour l’isolement et la culture
EGM-2 BulletKit	Lonza	CC-3162	Ce produit est livré avec tous les facteurs de croissance nécessaires pour rendre le Croissance endothéliale Medium Fetal
Bovin	Serum Thermofisher Scientific	26140079
Pencillin-Streptomycin-Glutamine (100x)	Thermofisher Scientific	10378016
Ficoll-Paque	GE Heatlhcare	17-1440-02
Solution saline équilibrée de Hank	Thermofisher Scientific	14170-112
Chlorure d’ammonium	Stem Cell Technologies	7850
1x tampon de phosphate Saline	Thermofisher Scientific	14190250
Rat Tail I Collagen	Corning	354236
Acide acétique glacial	Amresco	0714-500ML
0,05 % Trypsine-EDTA	Thermofisher Scientific	25300054
tampon HEPES	Thermofisher Scientific	15630080
Dulbecco’s Modified Eagle’s	Medium Thermofisher Scientific	10566-016
B) Anticorps et lysats cellulaires
CD31 ;	Abcam	ab28364	dilution 1:250 pour Western blot
CD34	Santa Cruz Biotechnology	sc-7045	dilution 1:100 pour Western blot
&alpha ;-SMA	abcam	ab5694	dilution 1:100 pour Western blot
&alpha ;-tubuline	abcam	ab7291	dilution 1:2 500 pour Western blot
VEGFR2	abcam	sc504	Dilution 1:100 pour Western blot
Lysat de cellules endothéliales de la veine ombilicale humaine	Santa Cruz Biotechnology	sc24709  ;
		cellules interstitielles valvulaires	Lignée cellulaire primaire cultivée en laboratoire et lysée avec un tampon RIPA
C) Western blot et immunomarquage
10x tampon Tris/Glycine/SDS	Biorad	161-0772	Utilisé comme tampon courant
10x tampon Tris/Glycine	Biorad	161-0771	Utilisé comme tampon de transfert
Membrane de transfert Immobilon-FL	Merck Millipore	IPFL0010	Il s’agit d’une membrane de transfert PVDF qui a 45 & micro ; m taille des pores et est mentionné dans le protocole comme membrane western blot
4x tampon d’échantillon Laemmli	Biorad	161-0747
2-mercaptoéthanol	Biorad	161-0710
10 % Criterion TGX gel préfabriqué	Biorad	5671033
Prolong Gold antifade	Thermofisher Scientific	P36930	Utilisé pour le montage de lamelles immunocolorées pour le stockage à long terme
Méthanol	VWR Analytique	BDH1135-4LP