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Article de méthode

Analyse cinématique démarche plan sagittal chez les souris C57BL/6 soumis à MOG35-55 induit une encéphalomyélite auto-immune expérimentale

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DOI :

10.3791/56032

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4 novembre 2017

 ,  ,  ,  , 
1Pharmacology, Dalhousie University, 2Medical Neuroscience, Dalhousie University, 3Psychiatry, Dalhousie University

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Analyse de la démarche cinématique dans le plan sagittal donne des informations très précises sur la façon dont le mouvement est exécuté. Nous décrivons l’application de ces techniques pour identifier les déficits de la démarche pour les souris soumises à demyelination autoimmun-négociée. Ces méthodes peuvent également être utilisées pour caractériser les déficits de la démarche pour les autres modèles de souris mettant en vedette la locomotion avec facultés affaiblies.

Résumé

Analyse de la démarche cinématique dans le plan sagittal a fréquemment été utilisé pour caractériser les déficits moteurs dans la sclérose en plaques (MS). Nous décrivons l’application de ces techniques pour identifier les déficits de la démarche dans un modèle murin de la SP, appelé encéphalomyélite allergique expérimentale (EAE). Déficits moteur et de la paralysie chez des souris soumises à l’EAE sont généralement évalués à l’aide d’une grille de cotation clinique. Cependant, cette échelle donne seulement des données ordinales qui sont avare d’information sur la nature précise des déficits moteurs. Gravité de la maladie EAE a également été évaluée par rotarod performance, ce qui donne une mesure de coordination motrice générale. En revanche, l’analyse cinématique démarche du membre postérieur dans le plan sagittal génère des informations très précises sur comment le mouvement est altérée. Pour exécuter cette procédure, les marqueurs réfléchissants sont placés sur un membre postérieur pour détecter les mouvements conjoints même si une souris est marchant sur un tapis roulant. Logiciel d’analyse de mouvement sert à mesurer le mouvement des marqueurs lors de la marche. Les paramètres cinématiques démarche proviennent alors les données résultantes. Nous montrons comment ces paramètres de démarche peuvent être utilisés pour quantifier les visuels des mouvements des articulations hanche, du genou et la cheville dans l’EAE. Ces techniques peuvent être utilisées pour mieux comprendre les mécanismes de la maladie et d’identifier des traitements potentiels pour MS et autres maladies neurodégénératives qui entravent la mobilité.

Introduction

Allure est une série de mouvements répétitifs des membres pour atteindre la locomotion. Démarche se compose de cycles de l’étape, qui sont divisés en deux phases : la phase d’appui, c'est-à-dire lorsque le pied se déplace vers l’arrière sur le terrain afin de propulser le corps vers l’avant ; et la phase pendulaire, où le pied est large vers l’avant au sol et émouvant. Troubles de la marche sont caractéristiques de la marque de fabrique de nombreuses maladies neurodégénératives, comme la moelle épinière (SCI), sclérose en plaques (SEP), sclérose latérale amyotrophique (SLA), maladie de Parkinson (MP) et accident vasculaire cérébral ; les modèles précliniques de rongeurs de ces troubles souvent récapitulent leurs allures respectives déficiences1. Les mécanismes de base du contrôle de la locomotion chez les souris ont été intensivement étudiée2,3. En outre, il y a des modèles murins de nombreux troubles neurologiques humain4. Analyse de la démarche chez la souris est donc une approche intéressante pour mesurer des aspects multiples des déficits moteurs qui ont connu les corrélats anatomiques. L’étude de la marche dans des modèles murins peut-être apporter un éclairage sur les bases neuropathologiques des déficits locomoteurs dans les troubles neurodégénératifs et permettre l’identification des traitements potentiels.

Quelques techniques qui ont été utilisées pour mesurer la démarche chez les rongeurs comprennent l’inspection visuelle (par exemple, le Basso souris échelle5 et plein champ test6) et l’analyse de la démarche du plan ventral7. Plus récemment, les méthodes d’évaluation plan sagittal cinématique des mouvements du membre postérieur ont gagné en popularité car elles offrent plus d’informations sur l’exécution du mouvement et par conséquent sont plus sensibles aux changements subtils dans la démarche8, 9 , 10 , 11. cinématiques techniques mises au point pour étudier le mouvement du membre postérieur dans le plan sagittal en marchant sur un tapis roulant9,12 ont été intensivement étudiés dans le cadre de la SCI, ALS, traumatismes corticales, accident vasculaire cérébral, et La maladie de Huntington8,9,10,11,13,14,15,16. En revanche, ces techniques ont vu une utilisation limitée dans l’étude des déficits locomoteurs pour modèles murins de la sclérose en plaques,17.

Encéphalomyélite allergique expérimentale (EAE) est le modèle de souris plus couramment utilisés de MS18. Les deux principales méthodes d’induction d’EAE se fait par l’inoculation active ou passive. Dans l’EAE active, les souris sont immunisées avec des antigènes de la myéline, causant neuroinflammation de médiée par les lymphocytes T autoréactifs et la démyélinisation dans la moelle épinière et le cervelet. EAE passive, en revanche, est induite par le transfert de cellules autoréactives T d’une souris avec EAE active à une naïve souris19. Comme décrit ailleurs, l’évolution de la maladie et la neuropathologie sont influencés par l’antigène du système nerveux central (SNC) et la souche de souris20,21,22,23,24 ,,25. Dans les expériences de l’EAE, souris témoins sont injectées avec adjuvant complet de Freund (ACF) sans l’antigène de la myéline. EAE se caractérise par ascendante paralysie qui commence par la faiblesse de la queue et peut pouvoir impliquer les membres antérieurs, ce qui entraîne une ataxie et une paralysie20. Nous avons récemment caractérisé démarche changements chez les souris C57Bl/6 soumis à la glycoprotéine de myéline oligodendrocyte 35-55 (MOG35-55)-induced EAE. Ces études ont montré la démarche analyse comme étant supérieure à une analyse comportementale classique parce que les déviations du mouvement de la cheville normale sont fortement corrélées avec le degré de perte de substance blanche dans la moelle épinière lombaire de l’EAE souris26. En revanche, la force de la corrélation entre la perte de substance blanche et deux autres mesures comportementales traditionnelles (score clinique et rotarod) était beaucoup plus faible de26.

Nous décrivons ici l’utilisation de l’analyse de la démarche cinématique pour détecter les déficits de mouvement dans le plan sagittal de souris EAE marchant sur un tapis roulant. Cinq marqueurs réfléchissants ont été placés sur un membre postérieur pour identifier les mouvements de la hanche, du genou et articulations de la cheville dans les enregistrements vidéo à haute vitesse. Logiciel d’analyse de mouvement a été utilisé pour extraire des données cinématiques sur excursions mixtes. Les auteurs discutent l’utilité de ces techniques pour quantifier les déficits de mouvement pour le modèle de35-55 MOG de l’EAE. Ces techniques s’appliquent également à l’étude des déficits de la marche chez les autres modèles murins de maladies neurodégénératives.

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Protocole

le présent protocole est selon le Canadian Council on Animal Care directives et a été approuvé par le Comité de l’Université Dalhousie sur animaux de laboratoire.

1. construire des marqueurs réfléchissants :

  1. à l’aide d’une perforatrice à main, coup de poing le nombre désiré de petits cercles sur une feuille de papier réfléchissant. Chaque animal nécessite 5 marqueurs pour un seul enregistrement ; deux grands et trois petits marqueurs.
  2. à l’aide des ciseaux, faire une coupe droite qui s’étend du périmètre au centre du cercle.
  3. Enlever le papier protecteur du marqueur pour révéler la surface adhésive. À l’aide de pinces fines, tenez le marqueur fermement et curl dedans sur lui-même à l’aide de votre doigt pour obtenir une forme de cône. Pour faire un petit marqueur, curl étroitement le cône. Pour faire un grand marqueur, curl le cône souplement.
  4. à l’aide d’un pistolet à colle à main, remplissez l’intérieur du marqueur en forme de cône avec de la colle en saisissant la pointe du cône avec une pince et adhérer au marqueur d’un morceau de carton plat. La colle n’empêchera le marqueur de s’effondrer et de flexion pendant l’enregistrement afin d’assurer une réflexion optimale de la lumière. Lorsque la colle est sèche (environ 10 min), retirer le marqueur de la partie cartonnée avec un scalpel ( Figure 1 a).

2. Préparer l’Animal pour l’enregistrement

  1. anesthésier la souris au gaz isoflurane (2,5 % ; 2 litres/min O 2) en plaçant la souris dans une chambre à induction. Une fois que la souris est inconsciente, placez-le dans un cône de nez placé sur un chauffage couverture recirculation de l’eau. Le but d’anesthetization est d’immobiliser la souris pour le placement du marqueur ; la procédure n’est pas douloureuse. Par conséquent, profondeur de l’anesthésie n’a pas besoin d’être évalué.
  2. Appliquer un lubrifiant oculaire topique pour les deux yeux.
  3. Raser le postérieur désiré à l’aide de tondeuses électriques. Commencer à la cheville et s’étendre à la colonne vertébrale et le bas des côtes ; assurer aucune fourrure n’est laissé comme cela gênera adhérence marqueur.
    Remarque : Ici, le membre postérieur droit a été enregistré ; Toutefois, chaque membre postérieur peut être utilisé.
  4. à l’aide d’un marqueur permanent, indiquer l’emplacement de la crête iliaque et l’articulation de la hanche. La crête iliaque est juste en dessous de la partie inférieure des côtes et est facilement palpable en réunissant les genoux sous la souris ' corps de s.
    Remarque : L’articulation de la hanche peut être trouvée en flexion et extension de la jambe pour trouver le point d’articulation du bassin et du fémur.
  5. Using fine pince, saisir l’extrémité pointue d’un petit marqueur et trempez la base dans la colle adhésive à action rapide, ou une alternative équivalente. Placer le marqueur sur la pointe du quatrième doigt et maintenez en place pendant 2-3 s pour laisser la colle sécher. Placez les deux autres marqueurs petits sur l’articulation métatarsophalangienne et de la cheville de la même manière ( Figure 1 b).
  6. Placer les gros marqueurs sur la crête iliaque et l’articulation de la hanche ( Figure 1 b) de la même manière que les petits marqueurs.
  7. Supprimer la souris de la coiffe et transférer immédiatement à la salle d’enregistrement à l’aide d’une cage de transfert. Placez votre souris sur le tapis roulant stationnaire et permettre un rétablissement complet de l’anesthésie.

3. Enregistrement de la démarche

  1. préalable à l’enregistrement de la souris ' démarche s, prenez une image d’un bloc d’étalonnage avec des dimensions connues sur le tapis roulant.
    Remarque : Ceci permettra les pixels dans la vidéo à convertir aux mesures réelles. L’appareil doit être placé environ 120 cm à partir du tapis roulant.
    1. Position de la caméra à la même hauteur et le niveau du tapis roulant. Maintenir la même position de la caméra pour les enregistrements après l’image de calibration.
  2. Une fois que la souris a complètement récupéré de l’anesthésie, mettre le tapis roulant à une vitesse lente (5 cm/s) pour laisser la souris commencer à marcher. S’assurer que la direction de ceinture de tapis roulant est telle que les repères sur la souris sont face à la caméra.
  3. Augmentation du tapis de course vitesse progressivement jusqu'à 20 cm/s ; il s’agit de la vitesse idéale pour une démarche cohérente plus chez la souris.
    Remarque : Même s’il est idéal d’avoir toutes les souris marche à la même vitesse, certains peuvent être incapables d’atteindre systématiquement cette vitesse.
    1. Si la souris est incapable de marcher à 20 cm/s, réduire la vitesse si nécessaire et n’oubliez pas de prendre note de cela. Réduire la vitesse du tapis roulant jusqu'à l’obtention d’étape cohérente cycles sont.
      Remarque : L’analyse ultérieure des données peut ajuster des différences de vitesses de.
  4. Begin, enregistrements vidéo, une fois que la souris se promène régulièrement (c.-à-d. marcher à un rythme cohérent, ne pas d’élevage ou tissage côte à côte). Continuer d’enregistrer jusqu'à 8 à 12 étape consécutive cycles ont été enregistrées. Pour chaque vidéo, record enregistré la vitesse du tapis roulant et le côté de la souris.
  5. Une fois l’enregistrement terminé, éteignez le tapis roulant et regagner sa cage de la souris. Nettoyez le tapis roulant soigneusement entre les enregistrements comme parfums laissés par les autres souris peuvent modifier le comportement des souris entrants. Pour réduire le stress et les dommages de la peau, ne pas enlever les marqueurs ; permettre aux souris pour les supprimer de leur propre chef.

4. Analyse

  1. traiter les vidéos en utilisant le logiciel d’analyse de mouvement.
    Remarque : Dans nos expériences, nous avons utilisé des scripts personnalisés conçus pour les logiciels d’imagerie et statistiques (voir Table des matières) qui ont été écrits par le Dr Nicolas Stifani. Les étapes suivantes sont effectuées en utilisant le logiciel d’analyse de mouvement sélectionné.
    1. Extrait les coordonnées en pixels des marqueurs des vidéos et à l’aide de la vidéo de calibration, transformer les valeurs des pixels à centimètres et calculer les angles articulaires chaque membrure.
    2. Identifier le début et la fin de chaque cycle d’étape, ainsi obtenir des informations sur la durée de l’étape et la durée.
    3. Normaliser l’étape durée du cycle de 200 cadres normalisés, tels que swing et position sont représentées respectivement par 100 images,.
  2. Utiliser les cadres normalisés, calculer les paramètres cinématiques pour l’analyse de données à l’aide du tableur (voir Table des matières).
    1. à établir l’angle moyen d’une articulation particulière, prendre la moyenne de tous les angles dans un cadre normalisé comme :
      figure-protocol-1
      Remarque : ici, x représente la valeur d’angle à une donnée normalisée cadre et n représente le numéro du cadre normalisé.
    2. à établir l’amplitude des mouvements d’une articulation particulière pour une souris donnée, soustraire le plus petit angle sous l’angle plus important dans un ensemble d’images normalisés comme suit :
      Gamme de mouvement = Angle maximal - Angle minimal.
      Remarque : Ici Angle maximal et Angle minimal sont les angles plus grands et le plus petits atteints respectivement dans le cycle de l’étape normalisée,.
    3. D’établir la différence de RMS, soustraire tout d’abord l’angle moyen de chaque point expérimental de temps de l’enregistrement de base. Ensuite, forme carrée chaque différence, prendre la moyenne des valeurs tout au carré et racine carrée la moyenne. L’équation est la suivante :
      figure-protocol-2
      Remarque : ici figure-protocol-3 représente l’angle moyen de la ligne de base d’enregistrement ; y représente l’angle moyen de chaque point de temps expérimental ; n représente le nombre d’images normalisées. Moyenne quadratique (RMS) différence est une mesure utilisée pour évaluer l’écart par rapport à la démarche des enregistrements de base.
  3. Utiliser les graphiques scientifiques et logiciel de statistiques pour analyser et présenter les données (voir la Table des matières).

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Résultats

La figure 1 est une représentation schématique de la procédure utilisée pour l’analyse de la démarche de cinématique. Tout d’abord, réfléchissants feutres sont faites et placées sur une souris a 5 points anatomiques. Démarche est ensuite enregistré tandis que la souris marche sur un tapis roulant. Logiciel d’analyse de mouvement est utilisé pour extraire des données cinématiques pour analyse ultérieure.

Figure 2 a -C ...

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Discussion

Chez les souris avec EAE, deux principales méthodes de mesure des déficits moteurs sont score clinique et tombent la latence d’un rotarod27,28. Ces techniques présentent plusieurs limites. Bien que pratique et largement utilisé, score clinique est limité en dégageant des données au niveau ordinales uniquement, ce qui signifie que l’ampleur des différences entre les résultats cliniques ne sont pas connus. Score clinique souffre également de l’impossibilité de four...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Nous tenons à remercier Sid Chedrawe son assistance technique pour le tournage. Ce travail a été financé par la MS Society of Canada (2983 EGID).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Appareil photoNikonNikon D750Utilisé pour filmer la vidéo
Bande réfléchissanteB& L EngineeringMKR-Tape-2
Ciseaux finsOutils pour les sciences fines15023-10
Pincespour les sciences fines11252-20
Pistolet à colleCraftsmartE231647
manche de scalpel #4RobozR5-9884
Lame de scalpel n° 10Plume2020-12
C57BL/6 sourisCharles River Laboratories
Appareil d’anesthésieEZ AnesthesiaEZ-AF9000 Système
Couverture chauffante à circulation d’eau AndroitHTP-1500
Lubrifiant topique pour les yeuxRefreshDIN00210889
ShaverOster78997-010
Caméra haute vitesseFastecFastec IL3-100
Lampe haute puissanceSmith Victor CorporationModèle 700 SG (600 Watt lumière à quartz, 120 Volts)
Support d’éclairagePromasterLS1
Tapis de courseConstruit sur mesure à l’Institut zoologique de l’Université de Cologne
Microsoft Excel 2016Microsoft Version 2016
KinemaJNicolas StifaniCeci est un script généré pour être utilisé avec ImageJ
KinemaRNicolas StifaniCeci est un script généré pour être utilisé avec Rstudio
Vicon MotusVicon MotusVersion 9.00
GraphPad PrismGraphPadVersion 6.00
de débit automatique

Références

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