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Article de méthode

Évaluation de l’homéostasie des dopaminergiques chez les souris par l’utilisation de l’analyse de chromatographie liquide à haute performance et l’absorption de la Dopamine

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DOI :

10.3791/56093

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21 septembre 2017

 ,  ,  ,  , 
1Molecular Neuropharmacology and Genetics Laboratory, Lundbeck Foundation Center for Biomembranes in Nanomedicine, Department of Neuroscience and Pharmacology, Faculty of Health and Medical Sciences, University of Copenhagen, 2Laboratory of Neuropsychiatry, Psychiatric Center Copenhagen and Department of Neuroscience and Pharmacology, University of Copenhagen

Dans cet article

Résumé

Capture de la dopamine et de chromatographie liquide à haute performance représentent expérimentale des outils d’analyse pour étudier l’homéostasie de la dopamine chez les souris en évaluant la fonction de transporteur de la dopamine et les niveaux de dopamine dans le tissu du striatum, respectivement. Nous présentons des protocoles afin de mesurer la teneur en tissu dopamine et d’évaluer les fonctionnalités du transporteur de la dopamine.

Résumé

La dopamine (DA) est un neurotransmetteur modulatrice contrôlant l’activité motrice, les processus de récompense et les fonctions cognitives. Altération de la neurotransmission dopaminergique (DAergic) est fortement associée à plusieurs maladies associées au système nerveux central telles que la maladie de Parkinson, troubles de l’attention-hyperactivité et drogues toxicomanie1,2 ,3,4. Délimitant les mécanismes des maladies impliquant le déséquilibre DA critique repose sur des modèles animaux pour imiter les aspects des maladies et des protocoles qui permettent d’évaluer des parties spécifiques de l’homéostasie de la DA sont donc importants de proposer des idées nouvelles et thérapeutique possible cibles pour ces maladies.

Nous présentons ici deux protocoles expérimentaux utiles que lorsqu’il est combiné fournissent un affichage fonctionnel du système DAergic chez la souris. Les paramètres biochimiques et fonctionnelles sur l’homéostasie DA sont obtenus au moyen d’évaluation des niveaux de DA et de dopamine transporter (DAT) fonctionnalité5. Lors d’enquêtes sur le système de DA, la possibilité de mesurer de manière fiable des taux endogènes de DA du cerveau adulte est essentielle. Par conséquent, nous présentons comment effectuer la chromatographie en phase liquide à haute performance (HPLC) sur les tissus cérébraux de souris pour déterminer les niveaux de l’AA. Nous effectuons l’expérience sur le tissu du striatum dorsal (dStr) et le noyau accumbens (NAc), mais la méthode convient également pour d’autres zones du cerveau DA-innervés.

DAT est essentiel pour le recaptage de la DA dans la terminaison présynaptique, contrôlant ainsi l’activité spatiale et temporelle de l’AA publié. Connaître les niveaux et les fonctionnalités de DAT dans le striatum est d’une importance majeure lors de l’évaluation de l’homéostasie du DA. Ici, nous fournissons un protocole qui permet de déduire simultanément des informations sur les niveaux de surface et fonction à l’aide d’un test d’absorption de synaptosomes6 DA.

Les méthodes actuelles combinées avec des protocoles standard immunoblotting fournissent le chercheur avec des outils pertinents pour caractériser le système DAergic.

Introduction

La dopamine (DA) est un neurotransmetteur modulatrice critique pour comportement moteur, de récompense et de la fonction cognitive1,7,8,9. Les déséquilibres dans l’homéostasie de la DA sont impliqués dans plusieurs maladies neuropsychiatriques tels que le trouble d’hyperactivité avec déficit de l’attention, la toxicomanie, la dépression et la maladie de Parkinson,1. DA est libéré du neurone présynaptique dans la fente synaptique, où il se lie à et active les récepteurs sur la membrane pre- et post-synaptiques, véhiculant ainsi davantage le signal. Le niveau de DA dans la synapse, après que la libération est spatialement et temporellement contrôlée par DAT3,10. Le transporteur séquestre DA de l’espace extracellulaire et soutient donc physiologique DA niveaux3,11. Suppression génétique des DAT chez la souris provoque un phénotype hyperdopaminergique caractérisé par des niveaux élevés de DA synaptiques, épuisement des réserves intracellulaires de DA et des changements profonds en postsynaptique DAergic signalisation10,12.

Ici, deux protocoles distincts sont présentés, une méthode pour la teneur en tissu mesure DA et un autre pour évaluer la fonctionnalité de DAT. combiné avec le test de surface biotinylation décrit par Gabriel et coll.13 ces deux méthodes renseignent sur DA contenu et fonctionnelles niveaux de DAT pour une évaluation approfondie de l’homéostasie de la DA. Avec ces méthodes DA l’homéostasie des diverses souris transgéniques ou des modèles de maladies peut être caractérisé et décrit. Ces outils ont été mis en place et optimisés et sont utilisation standard dans nos laboratoires. Les tests actuellement ont servi à étudier les conséquences sur l’homéostasie DA pourrait modifier le C-terminal de DAT14 ou exprimant une recombinase Cre en vertu de la tyrosine hydroxylase (TH) promoteur 5.

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Protocole

les directives de l’inspection d’expérimentation animale danois (numéro d’autorisation : 2017-15-0201-01160) a été suivie et expériences effectuées dans un établissement entièrement AAALAC accrédité sous la supervision d’un bien-être animal local Comité.

1. absorption synaptosomes de Dopamine (méthode 1)

Remarque : ce protocole est pour évaluation parallèle de deux cerveaux, mais peut être utilisé avec succès pour effectuer des expériences d’absorption DA synaptosomes avec quatre cerveaux en parallèles.

  1. Préparations
    1. Label 48 mL 1,5 micro-centrifuge tubes par le tableau 1 (24 pour chaque cerveau). Utiliser des couleurs différentes pour les tubes appartenant à chaque cerveau pour éviter toute confusion entre les échantillons
    2. Label 51 scintillation tubes #1-51.
      3. Tamponnée au phosphate
    3. Place salin (PBS), sur la glace. Cela servira à garder les cerveaux réfrigérés.
    4. Mettre en marche la centrifugeuse pour laisser refroidir préalablement à 4 ° C.
    5. Peser les deux tubes de micro-centrifuge pour obtenir le poids exact de tissu lors de la préparation de la (section 2.6).
      6. Tampon
    6. Prepare homogénéisation en mélangeant 4 mM HEPES et 0,32 M de sucrose. Ajuster le pH à 7,4 et garder sur glace
      NOTE : Tampon homogénéisation peut être gardé en aliquotes à-20 ° C et décongelé le jour de l’expérience.
      7. Tampon d’absorption
    7. Prepare en combinant ce qui suit : 25 mM HEPES, 120 mM NaCl, KCl, 1,2 mM CaCl 2, 1,2 mM MgSO 4, 5 mM 1 mM d’acide ascorbique (0,194 g/L), 5 mM D-glucose (0,991 g/L). Ajuster le pH à 7,4 avec NaOH (entraîne une concentration en sodium d’environ 130 mM) et de garder sur glace
      Remarque : Pour 2 cerveaux, préparer 1 500 mL de tampon de capture. Préparer le tampon d’absorption comme un 10 x solution mère sans l’acide ascorbique et du glucose conservés à 4 ° C. faire 1 x solution de travail fraîchement sur le jour, compléter avec l’acide ascorbique et du glucose. Ajuster le pH avec du NaOH à 7.4.
      8. Tampon de capture
    8. Prepare + ligand en combinant ce qui suit : 25 mM HEPES, NaCl, KCl, 5 mM à 120 mM 1,2 mM MgSO 4, l’acide ascorbique (0,194 g/L), 5 mM D-glucose (0,991 g/L) de 1 mM, 1,2 mM ACC l2, 1 μM pargyline, 100 désipramine nM, 10 nM Inhibiteur de la catéchol-O-méthyl-transférase (COMT). Ajuster le pH 7,4 avec NaOH et garder sur glace
      Remarque : Utilisez 50 mL de tampon de capture et ajoutez ligand. Pargyline est ajouté pour aider à prévenir la dégradation de la DA par oxydation par le biais de la monoamine oxydase (MAO). Inhibiteur de la COMT (RO-41-0960) est ajouté à prévenir la dégradation de la DA (catécholamines en général) par le biais de COMT. Désipramine est ajoutée à inhibent l’absorption par les transporteurs de la noradrénaline et la sérotonine et ainsi rendre les résultats de l’absorption spécifique pour DAT.
      9. Tampon de capture
    9. Prepare + ligand + cocaïne en combinant ce qui suit : 25 mM HEPES, 120 mM NaCl, KCl, 1,2 mM CaCl 2, 1,2 mM MgSO 4, 1 mM d’acide ascorbique (0,194 g/L), D-glucose (0,991 g/L), de 5 mM à 5 mM 1 μM pargyline, 100 désipramine nM , 10 inhibiteur de la COMT nM, cocaïne 500 μM. Ajuster le pH à 7,4 avec NaOH et garder sur glace
      Remarque : Utilisez 7 mL de tampon de capture + ligand et ajouter la cocaïne. Cocaïne est ajouté pour obtenir une mesure de fond d’absorption DA non-spécifique à soustraire des données, laissant seulement l’absorption spécifique DAT (car SERT et NET sont inhibées par la désipramine, tel que décrit ci-dessus). Alternativement, un inhibiteur de la DAT très puissant et spécifique GBR-12935, peut être utilisé à la place.
      Important : Maintenir le tout sur la glace par la suite .
  2. La préparation
    1. sacrifier une souris à la fois par la dislocation cervicale et décapitation.
    2. Couper la peau à l’aide de ciseaux pour révéler le crâne et couper n’importe quel postérieur de l’excès de tissu de skull gauche de décapitation. Couper le crâne avec des petits ciseaux droites le long de la sutura sagittalis se terminant vers le haut que vers l’avant que possible.
    3. Placer les pointes de deux ciseaux dans chaque oeil de la souris et coupez à travers le crâne pour enlever le reste du crâne et du cerveau intact. Rapidement enlever le cerveau et le placer dans du PBS glacée. Cela permet de garder froid, tandis que le deuxième cerveau est disséqué.
    4. à l’aide d’une matrice de cerveau, disséquer une tranche de 3 mm coronale du striatum (antéro-postérieur : +1,5 mm à-1,50 mm) suivie d’une dissection plus fine avec un perforateur. Voir la Figure 1 pour punch domaine.
    5. Garder le tissu sur la glace à tout moment aller de l’avant.
    6. Transférer le tissu dans un tube à centrifuger-micro 1,5 mL pour le pesage.
      Remarque : Ce poids sera utilisé à l’étape 1.2.14.
    7. Répéter étape 1.2.1-1.2.6 pour le deuxième cerveau.
    8. Une fois que le poids a été obtenu pour les deux cerveaux, transférer le tissu dans un verre d’homogénéisation contenant 1 mL de tampon d’homogénéisation glacee.
    9. Homogénéiser le tissu à l’aide d’un pilon de moteur moteur à 800 tr/min, 10 coups même.
      Remarque : Un seul coup soit égal à un et descendre de l’action, le premier coup doit être environ 5 s, le 3-4 s. homogénéisation dans un milieu isotonique est important pour éviter l’éclatement des synaptosomes 6 qui suit. En utilisant la force appropriée et milieu isotonique permettra les terminaisons présynaptiques reseal cytoplasme englobante, vésicules synaptiques, mitochondries et cytosquelette 15.
    10. Transférer l’homogénat dans un tube à centrifuger-micro 1,5 mL et à percevoir l’homogénat restant le verre d’homogénéisation en rinçant avec 0,5 mL de tampon de l’homogénéisation supplémentaires.
    11. Conserver l’échantillon sur la glace tandis que le tissu de l’autre cerveau soit homogène. Les deux cerveaux s’exécuter en parallèle dans les étapes 1.2.12-1.2.13.
    12. Les noyaux de granule et débris de cellules par centrifugation (1 000 x g, 10 min, 4° C).
    13. Transférer le surnageant (S1) (contenant les membranes cellulaires et le cytoplasme) dans de nouveaux tubes de microcentrifuge de 1,5 mL et centrifuger à 16 000 x g pendant 20 min à 4 ° C.
    14. Jeter le surnageant (contenant du cytoplasme) et Resuspendre le culot (P2) (contenant des synaptosomes bruts) dans le tampon de l’homogénéisation 40 μL / mg de tissu (selon le poids obtenu à l’étape 1.2.6). Resuspendre doucement la fraction synaptosomale brute avec une pipette p1000 car trop de force se brisera les synaptosomes.
      Remarque : Il est important de se retrouver avec au moins 280 μL. Si ce n’est pas le cas, diluer avec plus de 40 μL / mg sera nécessaire. 1.2.1-1.2.13 étapes doivent être effectuées aussi rapidement que possible et tout doit être gardé sur glace. Dès que les synaptosomes bruts ont été resuspendues dans le tampon de l’homogénéisation ils sont relativement stables, tant qu’ils sont tenus en glace 6 , 15 , 16.

2. Expérience de captation

  1. Ajouter 440 μl tampon de capture + ligand + cocaïne les désigné 12 tubes de microcentrifuge de 1,5 mL et 440 tampon d’absorption μL + ligand pour les 36 autres tubes de microcentrifuge de 1,5 mL (voir le tableau 1 pour la mise en page).
    Remarque : Les supprimer de glace 15 min avant le début de l’expérience à amener à température ambiante, mais gardez sur la glace jusqu'à puis conserver inhibiteurs.
  2. Courbe de saturation Prepare (dopamine (2, 5, 6-[3H]-DA) (3 H dopamine) (91,1 Ci/mmol) à différentes concentrations finales (0,031 0,0625, 0,125, 0,25, 0,5 et 1,0 μM)).
    1. Qualifier de six tubes de microcentrifuge de 2 mL 10, 5, 2,5, 1,25, 0,62 et 0,31.
    2. Tampon de capture ajouter 750 μL + ligand pour les tubes de microcentrifuge 5 avec le nombre le plus bas.
    3. Tampon de capture 1,455.4 Ajouter μL + ligand, 14,6 μL la dopamine (1 mM), dopamine de 3 H 30 μl (11 μM) au tube marqué 10.
    4. Transfert 750 μl du tube marqué 10 au tube marqué 5. Bien mélanger et transférer 750 μL de ce tube dans le tube de 2,5. Répétez cette dilution avec les tubes restants.
  3. Rincez d’abord les filtres en microfibre de verre avec 4 mL de tampon de capture après leur mise sur un seau de 12 filtre bien.
  4. Ajouter 10 μL de la suspension de la membrane pour les 24 premières mL 1,5 micro-centrifuge tubes contenant tampon de μL 440 (voir tableau 1 pour la mise en page). Vortex avec soin et tournez en bas peu de temps pour s’assurer que les synaptosomes soient immergés dans la mémoire tampon. Sortir à 37 o C pendant 10 min.
    Remarque : Il est important d’être précis sur les temps au cours de l’expérience de l’absorption d’une comparaison équitable entre le cerveau. Utiliser un chronomètre de précision.
  5. Ajouter 50 μL de dopamine de concentration 10 et 5 μM (section 2.2) à la première deux colonnes et laisser à 37 o C pendant 5 min avec agitation. Après exactement 5 min, arrêter la réaction en ajoutant 1 mL de tampon de capture glacée. Faire la même chose avec concentration, 1,25 et 2,5 μM (section 2.2), puis avec concentration 0,62 et 0,31 μM.
  6. Ajouter les échantillons aux filtres rincés au préalable en microfibre et laver avec 5 x 4 mL de tampon de capture glacée. Lorsque les 12 premiers échantillons ont été ajoutés aux filtres, déplacer les filtres aux tubes de scintillation. Répétez cette opération avec les prochain 12 échantillons.
  7. Recommencez l’étape 2,4 à 2,6 pour le cerveau suivant.
  8. Max-comptage de préparer 3 tubes en plaçant un filtre en microfibre dans le bas des tubes de scintillation 49-51 et en ajoutant 25 µL de la concentration maximale de la dopamine sur le dessus (10 μM).
  9. Laisser tous les tubes de scintillation 51 sous une hotte pour 1 h.
  10. Ajouter 3 mL scintillation liquide sur chaque tube de scintillation et secouez vigoureusement sur un agitateur pendant 1 h.
  11. Comte [3 H]-DA dans un compteur-bêta pendant 1 min.
    1. , Ouvrez le programme et choisissez : Label : H-3, / filtre à plaques : flacon de 4 mL, 4 par 6, le type de test : Normal et compter le temps : 1 min.
      Remarque : Cette étape peut être effectuée le lendemain, si il est plus commode. Laisser les échantillons recouverts de papier d’aluminium pendant la nuit.
  12. Détermination des protéines
    1. utiliser un kit de dosage protéique BCA standard pour déterminer les concentrations de protéine des synaptosomes des adaptations de chefs d’accusation par minute (cpm) μg/min/fmol et pour comparaison appropriée d’absorption entre les échantillons.

3. Analyse des données

  1. utiliser les données provenant de l’absorption de l’expérience pour faire une saturation de la courbe pour chaque groupe et calculer le taux de la réaction (V la max) et la constante de Michaelis Menten (K, M).
    Remarque : La valeur de K M reflète la concentration de substrat nécessaire pour atteindre la moitié du V max. Par conséquent, V max reflète directement la fonction de DAT (capacité d’absorption maximale), qui dépend du nombre de DAT sur la surface et comment son activité pourrait être modulée par des modifications post-traductionnelles et/ou protéines qui interagissent ainsi que sur changements des gradients ioniques. La valeur de K M est une mesure indirecte de l’affinité du substrat pour le transporteur qui, ce qui est important peut également être modulée par des modifications post-traductionnelles et/ou protéines qui interagissent. Pour évaluer pleinement les changements fonctionnels, il est donc important de déterminer directement les niveaux d’expression de surface par exemple un test de surface biotinylation. Une description du recaptage de la dopamine et une élaboration sur le sens des valeurs max K, M et V ont été revus par Schmitz et al. 17.

4. Chromatographie liquide haute performance (méthode 2)

    1. de la dissection du cerveau
    1. tubes de microcentrifuge Label et peser ; une par région et par la souris.
    2. Sacrifier une souris à la fois par la décapitation et la dislocation cervicale. Rapidement enlever le cerveau tel que décrit à la section 1.2. Lancer d’autres dissection immédiatement.
    3. à l’aide d’une matrice de cerveau, disséquer une tranche de 3 mm coronale du striatum suivie plus fine bilatérale dissection du CNA et dStr avec un perforateur. Voir la Figure 3 pour punch domaine.
    4. Transférer le tissu aux tubes de microcentrifuge de 1,5 mL et placer rapidement sur la glace sèche. Peser le tissu et le placer sur la glace sèche immédiatement.
      Remarque : Le poids du tissu est important pour le calcul de la concentration par la suite.
      5. 4.1.1-4.1.4
    5. répéter les étapes avec la souris suivante.
      NOTE : Placer le tissu en 80 o C jusqu'à ce que la poursuite de la procédure ou de procéder immédiatement au traitement des tissus.

5. Préparation du tissu

  1. tour sur centrifugeuse afin qu’il puisse refroidir préalablement à 4 ° C
    2. de
  2. préparer la solution d’homogénéisation (0,1 N acide perchlorique (HClO 4)) et de garder sur la glace.
  3. Solution d’homogénéisation Using, préparer une norme frais 0,1 dopamine pmol/μL d’une solution mère de 1 mM (une dilution de 10 000 x).
    Remarque : La solution étalon est préparée en dissolvant la dopamine dans le tampon d’homogénéisation à une concentration de stock de 1 mM, qui peuvent être conservé à 20 ° C pendant environ un mois. Si d’autres zones du cerveau sont d’intérêt, concentration de l’étalon devra être modifié, depuis d’autres régions du cerveau y compris prefrontral cortex, hippocampe, nigra de substantia et l’aire tegmentale ventrale possèdent jusqu'à 100 fois moins DA par rapport au striatum.
  4. Ajouter 500 μL de solution homogénéisation à chaque échantillon (c'est-à-dire les tissus du CNA et dStr ; article 4.1) et homogénéiser les échantillons à l’aide d’un ultra-homogénéisateur à pleine vitesse pour environ 30 s. garder l’échantillon dans l’eau glacée pendant l’homogénéisation. Entre chaque échantillon, nettoyer l’homogénéisateur ultra avec de l’eau (pleine vitesse pendant 30 s).
  5. Centrifuger les échantillons pendant 30 min à 4 ° C, 14 000 x g.
    6. Échantillon de
  6. transfert environ 200 μL d’un filtre en verre 0,22 μm (1 cm de diamètre) à l’aide d’une seringue en plastique de 1 mL.
    Remarque : L’utilisation de filtres en verre n’est pas important, tant que les filtres choisis sont 0,22 μm à éliminer les substances de poids moléculaire élevé.
  7. Analyser des échantillons de détection électrochimique (EC)-HPLC méthodologie 18 tel que décrit à la section 6.

6. Analyse par chromatographie liquide de haute performance

solution
  1. Prepare ce qui suit pour la phase mobile : acétate de Sodium 55 mM, sulfonate acide 1 mM, Na 2 EDTA 0,1 mM, acétonitrile 8 %, acide acétique 0,1 M, pH = 3.2.
    Remarque : Ajuster le pH avec de l’acide acétique 0,1 M. Il est important d’être précis avec le pH. La solution devrait être degassed par le dégazeur en ligne (partie intégrante du système HPLC). Faire 2 L de la phase mobile et le changer une fois par mois (le changer quand le bruit est perceptible). En raison des fluctuations, cela prend environ 24h à régler après avoir changé la phase mobile.
  2. Mise en place du détecteur :
    1. Set volts sortie à 700 mV et température de 32 ° C sur le four détecteur ; c’est très important. Faire un programme de gamme en utilisant le manuel en ligne. Voir le manuel pour plus de détails). Ajouter le programme de temps selon le tableau 2.
      Remarque : Dans cette étude, le programme est prévu pour modifier automatiquement le courant au temps de rétention définie, pour garder la CLHP avec le courant optimal et de garder les pics du chromatogramme aussi grande que possible, mais toujours dans la vue. Cela a été optimisé pour striatale lysats de cerveau de souris.
  3. Lorsque le programme a été ajouté au détecteur, faire une courbe d’étalonnage 3 points, soit en injectant la norme trois fois (5, 10 et 15 μL).
    NOTE : Standard (10 μL (10 μL x 0,1 pmol/μl = 1 pmol DA)) doit être injecté chaque dixième échantillon et échantillons étalonné par rapport à la norme le plus proche. Fine tune le système la veille en ajustant la norme 3-point et en vérifiant si le chromatogramme sort dans les limites prévues. Si le bruit important est observé, changer la phase mobile. Si un pic est plus élevé que 990 mV puis ré-injecter l’échantillon dans un volume inférieur, ou faire un nouveau programme de gamme et une nouvelle courbe d’étalonnage. La limite de détection est mesurée comme 3 fois la valeur de bruit en mV à la plus faible valeur de crête injectée pour chaque norme (NA, DA, DOPAC, 5-HIAA, HVA, MT-3 et 5-HT).
    1. Système de réglage en ouverture de la solution de la LC et en activant commence à 1 ; cette analyse en mode en ligne. Tapez l’ID utilisateur et mot de passe, puis cliquez sur OK. Attendez que la solution LC pour se connecter aux instruments. Aller à la table des lots, puis renseignez les informations de données (par exemple, le type d’échantillon : inconnu pour échantillons et std pour standard, type d’analyse : il QT, inj volume : 10, amt ISTD : niveau 1 con). Enregistrez le fichier (allez dans fichier - > enregistrer le fichier de commandes comme - > sauver).
    2. Que le système soit injecter l’échantillon premier en appuyant sur ' Batch Démarrer '. Cela se traduira par l’injection de l’échantillon de 10 μL de l’échantillonneur automatique avec un module de livraison solvant.
      Remarque : Utiliser un débit de pompe de 0,15 mL/min et une colonne C18 à phase d’inversion. Ici, un détecteur ampérométrique de détection électrochimique a été utilisé. L’électrode de carbone vitreux doit être défini sur 0,8 V avec une électrode de référence Ag/AgCl. Afin de doser la dopamine, utiliser la chromatographie 3 µ ODS C18 (3) (DA 2 mm x 100 mm, particule taille 3 µm) qui permet la séparation chromatographique.
    3. Extrait de la surface des pics enregistrés et calculée.
      1. Go pour l’acquisition de données pour suivre le chromatogramme lorsque les échantillons ont terminé. Allez dans Lc post exécuter une analyse - > choisit le nom de fichier (le chromatogramme ouvrira) - > cliquez sur Afficher. Dans la barre d’intégration manuelle, ajouter tous les pics intégrable - > aller au rapport de données et imprimer la lecture.
        NOTE : Ici le logiciel solution de LC a été utilisé pour le contrôle de système et analyse de données.
  4. De la surface des pics, calculer la concentration de dopamine dans un échantillon, comme suit en utilisant la concentration de la norme :
    1. la surface du pic de l’étalon (correspond à 1 pmol) permet d’acquérir le facteur A.
      figure-protocol-1
    2. utilisation de facteur A pour obtenir la concentration des échantillons de.
      Concentration de l’échantillon (en pmol par 10 μL) = facteur de A × surface du pic de l’échantillon
    3. utiliser cette formule pour obtenir la concentration de l’échantillon dans ng.
      Échantillon concentration pmol / 10 µL x 500 µL x MW de dopamine = concentration de l’échantillon en ng
      échantillon concentration (en ng) = concentration de l’échantillon (en pmol par 10 μL) x 500 μL x MW de dopamine
    4. utiliser la concentration de l’échantillon en ng pour obtenir t il l’échantillon concentration en pg/g de tissu (échantillon concentration en pg / g de tissu = pg/g de tissu).

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Résultats

Protocole d’absorption DA actuel (Figure 1) comprend toutes les étapes nécessaires pour évaluer les fonctionnalités de DAT synaptosomes de souris. Nos données représentatives de la méthode de captation de DA (Figure 2) représente une courbe de saturation avec données non désaisonnalisées (Figure 2 b) et données (Figure 2 a). La courbe de saturation montre absorption des ...

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Discussion

Ce manuscrit décrit les protocoles expérimentaux utiles pour délimiter l’homéostasie DA dans n’importe quel modèle de souris de choix. Nous fournissons des protocoles détaillés pour mesurant les niveaux de DA dans le tissu de cerveau de souris HPLC et la captation de DA pour évaluer fonctionnelle DA transport par le biais de DAT. Les procédures, les protocoles et les limites pour l’expérience HPLC et dosage de captation synaptosomes DA seront précisés ci-dessous.

Le protocole de la captation p...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par l’UCPH 2016 programme d’Excellence (UG, A.R., K.J.), la Fondation de Lundbeck (M.R.) la Fondation Lundbeck Center for Biomembranes en nanomédecine (UG), le National Institute of santé subventions P01 DA 12408 (UG), le danois Conseil pour la recherche indépendante - Sciences médicales (UG).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Inhibiteur de la COMTSigma Aldrich, AllemagneRO-41-0960Pour le protocole d’absorption de la DA synaptosomale
[3H]-DopaminePerkin-Elmer Life Sciences, Boston, MA, États-UnisNET67-3001MCPour le protocole d’absorption de la DA synaptosomale
Filtres en microfibre de verreGF/C Whatman, GE Healthcare Life Sciences, Buckinghamshire1822-024Pour le protocole d’absorption de la DA synaptosomale
HiSafe Fluide à scintillationPerkin Elmer1200-437Pour le protocole d’absorption de l’AD synaptosomale
MicroBeta2Perkin ElmerPour le protocole d’absorption de l’AD synaptosomale
BCA Kit d’analyse des protéines ThermoScientific Pierce23225Pour le protocole d’absorption de l’AD synaptosomale
HEPESSigma Life ScienceH3375Pour le protocole d’absorption de l’AD synaptosomale
SaccharoseSigma Life ScienceS7903Pour le protocole d’absorption de DA synaptosomale
NaClSigma Life ScienceS3014Pour le protocole d’absorption de DA synaptosomique
KClSigma Life ScienceP9541Pour le protocole d’absorption de DA synaptosomique
CaCl2Merck KGaA10043-52-4Pour le protocole d’absorption de DA synaptosomique
MgSO4Sigma Life Science63065Pour le protocole d’absorption de DA synaptosomal
Acide ascorbiqueSigma Life ScienceA0278Pour le protocole d’absorption de DA synaptosomique
D-GlucoseSigma Life ScienceG7021Pour le protocole d’absorption de DA synaptosomique
PargylineSigma AldrichP-8013Pour le protocole d’absorption de DA synaptosomique
DesipramineSigma AldrichD3900Pour l’absorption de DA synaptosomale protocole
DopamineSigma Life ScienceH8502Pour le protocole d’absorption de DA synaptosomale
CocaïneSigma Life ScienceC5776Pour le protocole d’absorption de DA synaptosomale
Instruments ASIdematrice cérébralePour le protocole d’absorption de DA synaptosomale
Cafano perturbateur mécanique en téflonBuch & HolmAbandonnéPour le protocole d’absorption de DA synaptosomal (homogénéisation)
Antec Decade (Détecteur ampérométrique)Antec, Leiden, Pays-BasAbandonné : nouveau modèle DECADE Elite / Lite&trade ; Détecteur électrochimique type 175 et 176Pour protocole HPLC
Avantec 0.22 &mu ; m filtre en verreFrisenette ApS, Danemark13CP020ASPour protocole HPLC
Colonne : Prodigy 3 &mu ; ODS-3 C18Phenomenex, YMC Europe, Chermbeck, AllemagneNuméro de pièce :00A-3300-E0Pour le protocole HPLC
Logiciel de solution LCShimadzuLabSolutions Series WorkstationPour le protocole HPLC
Acide perchloré 0,1M Fluka Analytical35418-500mlPour le protocole HPLC (préparation des tissus)
EDTASigmaE5134-50gPour le protocole
HPLCNatriumdihydrogenphospharBie& Berntsen1.06346 1000gPour le protocole HPLC
Sodium 1-octanesulfonate monohydratéAldrich74885 -10gPour le protocole HPLC
Acétonitrile, isocratique grade HPLCScharlauAC03402500Pour le protocole HPLC
Filtre 0.22umFrisenette ApS, DanemarkAvantec 13CP020AS Pour leprotocole HPLC (préparation des tissus)
ortho-Acide phosphorique 85 %Merck1.00563. 1000mlPour le protocole HPLC
Electrode Antec, Leiden, Pays-BasAN1161300Pour le protocole HPLC (voir le manuel en ligne)
Programme de détection sur détecteur électrochimique DECADE IIAntec, Leiden, Pays-BasLite&trade ; Détecteur électrochimique de type 175 et 176pour protocole HPLC
RBM2000C

Références

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